BIOQUIMICA MOLECULAR, 31

Autor: PÉREZ RONTOMÉ M. CARMEN.
Año: 2000.
Universidad: ZARAGOZA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS DE LA UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA.

Resumen: El ciclo VAZ ha sido descrito ampliamente por numerosos autores. Aunque existe un amplio acuerdo en que los pigmentos de este ciclo desempeñan un papel protector frente al exceso de energía recibida por el aparato fotosintético, por el momento, no se ha econtrado una explicación exacta de cómo desempeñan esta función. El objetivo de este trabajo ha consistido en obtener información de la actuación del ciclo VAZ estudiando un amplio rango de situaciones de estrés, fundamentalmente deficiencias nutricionales y variaciones climáticas. Para alcanzar el objetivo mencionado se cubrieron las siguientes etapas de trabajo: 1,- Determinar los valores óptimos de pH para las dos enzimas implicadas en el ciclo. 2,- Localizar las zonas de la antena del aparato fotosintético que están mayoritariamente implicadas en los procesos de disipación de energía asociados con el ciclo VAZ. 3,- Estudiar el comportamiento de estos pigmentos en dos situaciones de estrés nutricional que inducen modificaciones en el aparato fotosintético: deficiencia de hierro y de manganeso. 4,- Utilizar la concentración foliar de zeaxantina como marcador de posibles situaciones de estrés nutricional. 5,- Establecer una relación entre la concentración de los pigmentos del ciclo de las xantofilas y la capacidad de adaptación de varias especies al clima mediterráneo. Los resultados obtenidos de estos experimentos nos permiten obtener las siguientes conclusiones: * Los pH's óptimos de las enzimas responsables de la interconversión de V en Z (violaxantina deseproxidasa y zeaxantina epoxidasa), en maíz y remolacha, coinciden con los descritos para otras especies. La deficiencia de hierro no induce cambios en estos valores, a pesar de las modificaciones que se producen en el aparato fotosintético. * El tamaño de la antena fotosintética afecta a la cantidad de energía que se disipa a través del grandiente de pH. Sin embargo, la actividad del ciclo de las xantofilas, durante el período de relajación en la oscuridad, en hojas de cebada control y deficientes en antena, es igual para ambas, y más rápidas que la encontrado en otras especies. Ambas observaciones sugieren que la actividad del ciclo VAZ está ligada a la antena más próxima al centro de reacción. * En condiciones de deficiencia de hierro severa (Chl total < 15 mmol cm-2), las hojas de melocotonero experimentan cambios en la composición de su aparato fotosintético, particularmente en las proteínas y pigmentos de la antena externa. * En las mismas condiciones de iluminación, las hojas de soja deficiente en hierro contienen mayor porcentaje de Z y A, que las de los controles. Esta diferencia es mucho más acusada en el caso de las hojas jóvenes. Asimismo, la concentración total de pigmentos VAZ respecto a la de clorofila, también es mayor, en este tipo de hojas. * La deficiencia de manganeso no produce alteraciones importantes en las relaciones estequiométricas de los pigmentos fotosintéticos, aunque disminuye su cantidad total por unidad de superficie. Los parámetros de fluorescencia indican que esta deficiencia afecta a la funcionalidad del centro de reacción del PSII, aumenta la contribución de la antena (FO) y disminuye la relación Fv/Fm. Los datos obtenidos en soja cultivada en condiciones controladas se confirmaron un melocotonero en condiciones de campo. * La fluorescencia de clorofila y la concentración foliar de pigmentos del ciclo VAZ podría ser una herramienta útil para seleccionar patrones para cerezo en función de las características medioambientales. * De las siete especies del encinar estudiadas, la concentración foliar de prolina sólo puede ser utilizada como marcador de estrés en Pl y Bs. * En plantas desarrolladas en condiciones silvestres, las hojas expuestas al sol sintetizan mayor cantidad de pigmentos del ciclo VAZ, por unidad de clorofila que las de sombra, siendo estas diferencias mayores incluso, que las encontradas entre distintas especies. * Las especies caducifolias (Qf y Pt) no mostraron ningún tipo de interacción entre la cantidad total de pigmentos del ciclo VAZ y la de clorofila. En el caso de las especies perennifolias, este hecho sólo se produce en hojas de Bs desarrolladas en condiciones de sombra. * En Pl y en Bs se ha encontrado un posible mecanismo de protección consistente en la aparición de nuevos pigmentos, que podrían actuar como filtro en condiciones de alta intensidad de luz y baja temperatura. * La concentración foliar de pigmentos fotosintéticos y, en particular la de los del ciclo VAZ, es una herramienta útil para evaluar el grado de adaptación de estas 7 especies al clima mediterráneo.

Autor: DÍAZ DE AGUSTÍN BEATRIZ.
Año: 2000.
Universidad: ALCALA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: El objetivo principal de esta tesis ha sido comprobar el valor diagnóstico del inmunofenotipo de los mastocitos de médula ósea por citometría de flujo en pacientes diagnósticados de mastocitosis sistémica. Se han estudiado un total de 21 pacientes diagnosticados de mastocitosis sistémica indolente, 3 mastocitosis sistémicas agresivas, 2 mastocitosis malignas y 19 individuos sanos. Los resultados revelan que los mastocitosis medulares de las mastocitosis sistémicas indolentes poseen unas características de dispersión de la luz, así como, autofluorescencia superior a la de los mastocitos normales. Su porcentaje es significativamente mayor que el hallado en la médula ósea de sujetos normales. En las mastocitosis sistémicas agresivas y, especialmente, en las mastocitosis malignas, el porcentaje de mastocitos es más alto que en las formas indolentes. Desde un punto de vista inmunofenotípico, los resultados más importantes son la expresión constante de los antígenos CD2, CD25 y CD35 en los mastocitos de mastocitosis, moléculas que están ausentes en los mastocitos normales, junto con la sobreexpresión de los antígenos asociados a la activación celular CD35, CD63 y CD69. Los mastocitos medulares de las mastocitosis sistémicas presentan cambios en su estado de actuación y adhesión respecto a los normales. El inmunofenotipo de los mastocitos de las mastocitosis agresivas y malignas es similar al descrito en las formas indolentes. En conclusión, la citometría de flujo permite la identificación, el recuento y la caracterización inmunofenotípica de los mastocitos de médula ósea y debe ser incluida como una técnica de utilidad diagnóstica junto con los estudios histológicos, inmunohistoquímicos y clínicos.

Autor: IZQUIERDO CLAROS ROSA M..
Año: 2000.
Universidad: ALCALA.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: MEDICINA.

Resumen: La administración de melatonina en una dosis única disminuye la actividad adenilil ciclasa en la corteza frontoparietal de la rata. La melatonina no altera la subunidad catalítica de la adenilil ciclasa ni en la corteza frontoparietal ni en el hipocampo de la rata. Por otro lado, tanto el tratamiento con una sola dosis de melatonina como durante 4 días aumenta la acumulación de inositol 1,4,5-trifosfato en el hipocampo de la rata. La administración de melatonina en una sola dosis y a corto plazo aumenta la actividad del sistema receptor-efector de la somatostatina en la corteza frontoparietal de la rata, ya que incrementa el número de receptores de somatostatina y el efecto inhibidor de la misma sobre la actividad adenilill ciclasa. La administración de melatonina a corto plazo sensibiliza el sistema adenilil ciclasa en la corteza frontoparietal de la rata. Es posible que este efecto se pueda relacionar con la disminución de los niveles de las proteínas Gialfa2 detectado en el presente estudio. La administración de melatonina en una sola dosis y a corto plaza disminuye la actividad del sistema somatostatinérgico en el hipocampo de la rata, ya que reduce el número de receptores de somatostatina, el efecto inhibidor de la misma sobre la actividad adenilil ciclasa y su efecto estimulador sobre la acumulación de inositol 1,4,5-trifosfato. Los efectos opuestos de la melatonina sobre el sistema somatostatinérgico en la corteza frontoparietal y en el hipocampo de la rata sugieren una especificidad regional en el efecto de la misma. La melatonina parece reducir el número de receptroes de somatostatina en el hipocampo a través de su acción como antagonista de la calmodulina, dado los resultados obtenidos in vitro con el calmidazol y calmidazol más melatonina. Sin embargo, en corteza frontoparietal de rata no parece que la melatonina pueda ejercer sus efectos a través de antagonizar la calmodulina. Tampoco parece que la melatonina pueda ejercer sus efectos vía proteína quinasa C en ninguna de las dos áreas cerebrales estudiadas. El efecto de la melatonina sobre el sistema receptor-efector de la somatostatina en las dos áreas cerebrales citadas, revierte a los 7 y 14 días de su administración diaria. Este efecto se puede deber a que la exposición continuada a la melatonina provoca una falta de respuesta tisular a la hormona, a través de una disminución del número de receptores de melatonina tal como está descrito. La administración de melatonina en una sola dosis y a corto plazo disminuye los niveles de somatostatina inmunorreactiva en el hipocampo de la rata. Está descrito que la fosforilación de la proteína fijadora del elemento de respuesta al adenosín monofosfato cíclico (CREB) estimula la transcripción del gen de la somatostatina y dado que la melatonina, actuando como antagonista de calmodulina, inhibe la calmodulina quinasa II que fosforila a la proteína CREB, es posible que la melatonina disminuya los niveles de somatostatina inmunorreactiva actuando como antagonista de la calmodulina. Desconocemos el papel fisiológico de la modulación del sistema somatostatinérgico por la melatonina en la corteza frontoparietal e hipocampo de la rata. Sin embargo, el hecho de que la melatonina y la somatostatina ejerzan efectos similares sobre la actividad locomotora, disminuyéndola, y efectos contrarios sobre la memoria, los presentes hallazgos sugieren que la melatonina liberada por la gláncula pineal puede regular de un modo agudo y a corto plazo las conductas anteriormente mencionadas a través de su interacción con el sistema somatostatinérgico en la corteza frontoparietal e hipocampo de la rata.

Autor: GONZÁLEZ SANTIAGO LAURA.
Año: 2000.
Universidad: ALCALA.
Centro de lectura: MEDICINA .
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: La acumulación de proteínas normales de la matriz extracelular y la aparición de colágenos inersticiales, principalmente colágeno tipo I, caracterizan patologías vasculares como hipertensión, aterosclerosis y diabetes. Estudios previos sugieren que la matriz modula el fenotipo de las células. Sin embargo, apenas se ha analizado el efecto de la composición de la matriz sobre el comportamiento celular. El objetivo de este trabajo fue analizar el papel del colageno I (Col.l), principal componente de la matriz extracelular en situaciones patológicas, en la síntesis de los factores endoteliales vasoactivos óxido nítrico (NO) y endotelina (ET-1), así como los posibles mecanismos implicados en dicha modulación. Se cultivaron células endoteliales humanas de vena umbilical (HuVEC) en dos tipos de matrices: Col.lV y Col.l y se estudió la expresión de preproendotelina-1, la síntesis de ET y la enzima conversora de la ET, paso limitante de este proceso. Respecto al NO, se analizaron: la expresión y actividad de la óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS), su promotor y la síntesis de NO. En ambos casos, se profundizó en los mecanismos implicados en los efectos inducidos por el colágeno I, haciendo especial hincapié en las integrinas, proteina quinasas y el sistema de la lLK. Nuestros resultados sugieren que en presencia de una matriz anormal se produce una mayor activación del sistema vasconstrictor de la ET, así como un empeoramiento de la relajación dependiente de endotelio, o lo que es lo mismo una disminución de la síntesis de NO, favoreciendo así el mantenimiento y la progresión de las alteraciones hemodinámicas que tienen lugar en diversas lesiones vasculares.

Autor: ISABEL LA-MONEDA INES.
Año: 2000.
Universidad: POLITECNICA DE MADRID.
Centro de lectura: INGENIEROS AGRÓNOMOS.
Centro de realización: E.T.S. INGENIEROS AGRONOMOS.

Resumen: En esta tesis se estudia el papel de los factores transcripcionales tipo DOF, en el proceso de germinación de la semilla de cebada. La posibilidad de que alguna proteína DOF estuviera implicada en este proceso surge de la observación de la presencia de la caja de pirimidina, que forma parte del complejo en cis de respuesta a giberélico (GARC) en los promotores de hidrolasas inducibles pro ácido giberélico durante la germinación, que coincide por el motivo central reconocido por los factores transcipcionales tipo DOF. El trabajo se inicia mostrando los datos que soportan la implicación del factor transcripcional de la clase DOF, BPBF, como represor a través de la caja de pririmidinas de la expresión de lso genes de hidrolasas, que previamente se había caracterizado como un activador de los genes que codifican proteínas de reserva durante el desarrollo de la semilla. Del escrutinio de una genoteca genómica de cebada se aislaron y caracterizaron siete clones correspondientes a genes que codifican distintas proteínas DOF. Uno de ellos, al que denominamos Sed (Scutellum and aleurone Expressed DOF) se estudió más detalladamente debido a su alto nivel de expresión en esculeto y aleurona en germinación. SED en experimentos de expresión transitoria mostró activar los genes reprimidos por BPBF. Los datos obtenidos indican que los genes que codifican hidrolasas en aleurona en germinación pueden ser regulados a través de la caja de pirimidinas que forman parte del complejo de respueta a GA (GARC) por, al menos, dos proteínas DOF: BPBF que actuaría como represor y SED que sería un activador. Dependiendo de la relación entre dichos factores, estos genes serían inducidos o reprimidos, de manera que durante el desarrollo y dormancia, BPBF podría reprimir su expresión, evitando la germinación precoz, mientras que durante la germinación, BPBF podría ser desplazado por SED que activaría su transcripción y con ella la movilización de las sustancias de reserva requerida durante este proceso.

Autor: OSUNA JIMENEZ DANIEL.
Año: 1999.
Universidad: CORDOBA.
Centro de lectura: CIENCIAS .
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: En el proyecto desarrollado en esta Tesis Doctoral se ha llevado a cabo la clonación de dos genes que codifican sendas asparragina sintetasas (AS) de una leguminosa ureida, como es Phaseolus vulgaris. Teniendo en cuenta la hipótesis de que existen factores moleculares responsables de la integración y corregulación de la biosíntesis de ureidos y amidas en raíces de leguminosas, y con el objetivo último de determinar los mecnismos de control de estos procesos, se ha iniciado un aproximación molecular al estudio de la asparragina sintetasa, una de las enzimas clave en el proceso de movilización del nitrógeno desde las raíces hacia las partes aéreas de la planta. Así, se han clonado y caracterizado los genes PVAS1 y PVAS2 de Phaseolus Vulgaris, que codifican asparragina sintetasas de tipo I y II, ambas dependientes de glutamina. El promotor de PVAS1 contiene motivos de secuencias relacionadas con la regulación por luz presentes en el promotor del gen AS1 de guisante. La expresión de PVAS1 y de PVAS2 complemetó la mutación de una estirpe de Escherichia coli auxótrofa para la asparragina, lo que indica que tanto PVAS1 como PVAS2 son funcionales. Estos genes se expresan mayoritatiamente en raíces, y en mucha menor medida en raíces de plátulas, cotiledones en germinación y frutos en desarrollo. PVSA2 se expresa además, en las etapas tempranas del desarrollo nodular antes de que este adquiera capacidad fijadora de nitrógeno. La expresión de PVAS1 y PVAS2 está regulada metabólicamente por la relación C/N.

Autor: GOMEZ JIMENEZ M. DOLORES.
Año: 1999.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAD DE CC.BIOLOGICAS-UNIVERSITAT DE VALENCIA.

Resumen: Durante el desarrollo de este trabajo hemos estudiado a nivel histológico el desarrollo de las anteras de guisante y hemos aislado y caracterizado el gen END1, cuya expresión es específica en las anteras. Como resultado del estudio del desarrollo de las anteras hemos dividido a éste en siete estadios que nos han sido útiles para analizar la expresión de dicho gen. Las hibridaciones in situ de mRNA y las inmunolocalizaciones de la proteína nos han permitido definir con precisión en que tejidos y en que estadíos de desarrollo se expresa END1. La expresión del gen comienza cuando el primordio estaminal inicia su desarrollo para convertirse en una antera y continua hasta que se produce la dehiscencia de ésta, momento en el que se observa una disminución de la expresión. Durante este período la expresión END1 y la proteína que codifica se detectan en las líneas celulares que dan lugar a la epidermis, la capa intermedia, el endotecio y el conectivo, así como en todos estos tejidos una vez desarrollado. La función de END1, por el momento desconocida, debe de estar relacionada con el papel de estos tejidos en la antera y ya que está presente en ellos y en las células de las que se originan a lo largo de su diferenciación. Dichos tejidos contribuyen básicamente al establecimiento de la arquitectura de la antera. Por otra parte, hemos aislado y caracterizado la región promotora del gen END1. Entre los diferentes posibles motivos reguladores encontrados en su secuencia, merecen especial atención las cajas CArG que están presentes en genes MADS-box o genes diana de éstos, y las cajas GTCAAAA, ACGTCA y C(A), 6/8 que están presentes en genes que se expresan específicamente en anteras. Por otro lado, hemos comprobado mediante el análisis de plantas transformadas con la región promotora de END1 dirigiendo la expresión del gen GUS, que un frangmento de 1,5 Kb de la región 5' del gen END1 contiene los elementos reguladores necesarios para la expresión específica de un gen en anteras de plantas heterólogas.

Autor: GARCIA-GALLO PINTO MONICA.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOMEDICAS.

Resumen: Los receptores de glutamato de tipo NMDA son protetínas heteroméricas localizadas en la membrana de las densidades postsinápticas, que se activan en respuesta a la unión de glutamato y glicina y simultánea despolarización de la membrana, dando lugar a la entrada de iones calcio desde el exterior celular a través de un canal iónico contenido en su estructura. En esta tesis se ha desarrollado un sistema heterólogo de expresión de receptores NMDA en células no neuronales, basado en la utilización del virus de la vacuna. Este sistema ha permitido la expresión de receptores funcionales en la superficie celular que, en respuesta a la adición de agonistas, inducen muerte celular por excitotoxicidad. Así mismo se han abordado cuestiones relativas a la maduración, localización y ensamblaje de las subunidades del receptor expresadas (NR1 Y NR2A) así como la expresión diferencial de las subunidades. Se ha observado que mientras NR1 es transportada eficientemente a la membrana plasmática en ausencia de expresión de NR2A, esta última precisa la co-expresión de NR1 para alcanzar la superficie celular. Dado que estas subunidades son proteínas N-glicosiladas, se ha estudiado el efecto de la inhibición de la N-glicosilación en la funcionalidad del receptor. Los resultados indican que en ausencia de N-glicosilación, el receptor expresado en el sistema heterólogo no es funcional debido a la retención de las subunidades en compartimentos intracelulares y a la degradación específica de la subunidad NR1 no glicosilada. Estudios realizados en cultivos de neuronas corticales de rata indican que dicha degradación está relacionada con la activación de respuestas de estrés de retículo endoplásmico y requiere la actividad del proteasoma.

Autor: CORTEGANO JIMENO ISABEL.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS. UAM.

Resumen: Las lectinas son un grupo de proteínas que se caracterizan por presentar en su estructura proteica un dominio con afinidad por carbohidratos denominado dominio tipo lectina. La galectina-3 es una lectina tipo S (soluble) con un peso molecular de 32 kDa e indentifica en diferentes tipos celulares. En su estructura proteica nos encontramos con dos dominios el C-terminal (lectina) y N-terminal, éste último con una secuencia de aminoácidos conservados y repetidos que le confieren su capacidad para formar dímeros. A galectina-3 se le han atribuido diferentes funciones tanto intracelulares (splicing del ARNm, regulación del crecimiento celular, inhibición de apoptosis) como extracelulares (adhesión a proteínas de la matriz extracelular, activación y liberación de mediadores). Debido a la interacción entre la galectina-3 y el receptor de alta afinidad para la IgE así como con la propia molécula de IgE, dos proteínas muy importantes en las reacciones alérgicas/inflamatorias (reacciones del tipo Th2), se pensó que la galectina-3 podría estar implicada en este tipo de patologías. Los objetivos y resultados de este trabajo fueron los siguientes: 1. Estudiar el efecto de galectina-3 sobre las citoquinas del subtipo Th2 (IL-4 e IL-5). Para abordar el primer objetivo se realizaron cultivos de diferentes tipos celularess en presencia o ausencia de galectina-3 y se analizó por RT-PCR los mensajeros de IL-4 e IL-5. Se demostró que la presencia de galectina-3 en el cultivo era capaz de inhibir específicamente la transcripción del gen de la Il-5, sin ningún efecto detectable sobre la IL-4. Además también se corroboran estos datos analizando la liberación de la proteína IL-5 al medio mediante ELISA. 2. El segundo objetivo fue determinar el ligando de galectina-3 en la superficie celular responsable de la inhibición del gen de la IL-5. Un buen candidato era el receptor de baja afinidad para la IgG (FcRII o CD32). Utilizando diferentes aproximaciones experimentales (citometría de flujo, inmunodetección con la proteína de fusión GST-galectina-3 y ratones deficientes en el receptor CD32) se demostró que la galectina-3 interacciona con CD32 y ésta unión es responsable de la inhibición de la transcripción del mensajero de la IL-5. 3. El tercer objetivo fue estudiar las secuencias reguladoras y los factores de transcripción implicados en la inhibición del gen de la IL-5 por la galectina-3. Se determinó que tanto la secuencia IL-5REIII como el factor de transcripción GATA-3 estaban implicados en este mecanismo. En conclusión, la interacción entre la galectina-3 y el CD32 es capaz de inhibir la expresión del gen de la IL-5. En este mecanismo participan entre otros el factor de transcripción GATA-3 y la secuencia del promotor de la IL-5REIII.

Autor: CUADRADO GARCIA M. ANA.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOMEDICAS.

Resumen: La hormona tiroidea (T3) desempeña un papel esencial en el correcto desarrollo del SNC de mamíferos. La disminución de los niveles normales de esta hormona en el hombre durante perídos críticos del desarrollo provoca graves anomalías neurológicas y retraso mental severo. Con el objeto de comprender mejor los efectos de la hormona tiroidea sobre el desarrollo cerebral hemos buscado genes regulados por T3 en este órgano. Para ello hemos utilizado la técnica de PCR diferencial con la línea celular neurona E18 + TR sensible a T3. De este modo, hemos identificado el homólogo en rata del gen SWAP de Drosophila como un gen regulado por hormona tiroidea en esta línea celular y durante el desarrollo del cerebro de rata. Hemos visto que el hipotiroidismo provoca un incremento de la expresión del RNAm de SWAP entre los días P5 y P15 en todas las regiones cerebrales a excepción del cerebelo. Numerosos estudios demuestran la existencia de múltiples genes regulados por hormona tiróidea en los que no se han identificado elementos de respuesta. Esto sugiere que T3 puede estar implicada en mecanismos de regulación post-transcripcional. En base a ello hemos estudiado el efecto del estado tiroideo sobre la expresión de msi-1 y huD, dos genes que codifican proteínas relacionadas con este tipo de procesos. Hemos observado que T3 incrementa los niveles de RNAm y proteína Msi-1 in vitro durante el período postnatal temprano. In vitro, el tratamiento con hormona tiroidea de células N2a que expresan niveles adecuados de receptores provoca un aumento de expresión de Msi-1. Este efecto es específico de T3, y se debe probablemente a un efecto directo sobre la transcripción de este gen. Hemos demostrado que la expresión exógena de la proteína Msi-1 en células N2a es responsable de un incremento en la proporción de isoformas maduras de tau que contiene el exón 10 respecto a las que no le contienen (isoformas inmaduras), siendo éste el resultado de un efecto descrito T3 sobre el "splicing" alternativo de tau durante el desarrollo cerebral. El tratamiento con hormona tiroidea de las células N2a + TR tiene el mismo efecto. Estos resultados sugieren que Msi-1 es una proteína reguladora de "splicing" que media la regulación T3 en el desarrollo del "splicing" alternativo del pre-RNAm de tau. Finalmente, hemos visto que la expresión de HuD depende del estado tiroideo en el cerebro de rata a lo largo del desarrollo perinatal. El hipotiroidismo provoca un aumento de la expresión tanto del RNAm como la proteína HuD. Hemos visto este mismo efecto en las células N2a + TR tratadas con T3. Las proteínas Hu están implicadas en el control de la estabilidad del RNAm mediante la unión a secuencias ricas end AU. Hemos demostrado que las proteínas HuD y HuR se unen con alta afinidad a varias secuencias de este tipo localizadas en los RNAm de Tn-C y AChE. Esto sugiere que los efectos de T3 en la expresión de ambos genes puede estar mediada por HuD. Mediante el control de la expresión de SWAP, Msi-1 y HuD la hormono tiroidea puede ejercer efectos reguladores sobre múltiples genes. De este modo se define un nuevo mecanismo de acción de T3 que puede ser importante en el desarrollo del cerebro.

Autor: GIL VALLES JESUS.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS .
Centro de realización: FAC. CC.

Resumen: Esta tesis se ha centrado en desentrañar las rutas involucradas en inducción de apoptosis por PRK. Se ha demostrado que la fosforilación de eIF-2a y la activación de NF-kB por PKR juegan un papel en dicho proceso. Además, se ha comprobado que el complejo IkB quinasa media la activación de factor de transcripción NF-kD por PKR y que la actividad catalítica de PKR es necesaria para dicha activación. Por último se ha visto que la ruta de apoptosis mediada por FADD/caspasa 8 está involucrada en la inducción de muerte celular programada por PKR.

Autor: GARCIA SIMON M. ISABEL.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: En esta tesis se ha conseguido indentificar la actividad de intercambio H+/Ca2+ de una preparación de proteínas (PPTC) procedente de una purificación parcial de transportadores de calcio mitocondriales de hígado de rata, en sentido reverso cuando se reconstituye en proteoliposomas. Las proteínas mayoritarias del PPTC presentan un peso molecular de 66 y 55 Kda, no conociéndose aún su secuencia ni cual de ellas es la responsable de la actividad de intercambio H+/Ca2+. Por otro lado la línea de neuroblastoma SK-N-SH diferenciada con NGF es adecuada para la expresión (sentido o antisentido) de posibles genes cadidatos a transportadores mitocondria a la regulación del calcio citosólico. La diferenciación in vitro de los progenitores neurales inmortalizados HiB5 y C17.2, es incompleta. El estadio más avanzado de diferenciación se obtiene mediante el tratamiento con ácido retinoico de células C17.2 . Estas células no responden a estímulos que movilizan calcio y en condiciones extremas de exposición a glutamato manifiestan síntomas de stress oxidativo. Se ha estudiado también la función de dos proteínas posibles transportadores mitocondriales de metabolitos sensibles a calcio, codificadas por genes que pertenecen a la subfamilia CaMC. La ausencia del gen YNLO83w no afecta ni al crecimiento en fuentes de carbono no fermentables ni modifica la función mitocondrial (respiración, estimulación por calcio de la respiración, interacción del calcio con la mitocondria). Es posible que, al igual que la proteína Efinal de conejo, se localice en peroxisoma. La proteína humana Aralar 1, reconstituida en proteoliposomas, no manifiesta actividad transportadora de calcio mitocondrial (uniportador, intercambiador H+/Ca2+, antiportador Na+/Ca2+) lo que indica que no es ningulo de estos transportadores. Ensayos de expresión heteróloga de Aralar 1 en HEK-293 concluyen que la expresión de esta proteína es tóxica (con una disminución tanto en el metabolismo de glucosa, como en el crecimiento y en algún almacén de calcio no establecido), probablemente debido al impedimento estérico producido por el exceso de proteína en la membrana interna mitocondrial. Esto ha impedido el estudio funcional de estas células.

Autor: MIÑANA MUROS ROSA M..
Año: 1999.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: INSTITUTO DE INVESTIGACIONES CITOLOGICAS.

Resumen: Las moléculas de adhesión celular neurales desempeñan funciones críticas durante la migración neuronal, sinaptogénesis y crecimiento axónico, por lo que se las considera moléculas morforreguladoras. En el presente trabajo, demostramos que durante el periodo neonatal en la rata se expresa PSA-NCAM o forma polisialilada de NCAM. Esta isoforma va desapareciendo a medida que transcurre la maduración de corteza cerebral y paralelamente comienza a expresarse NCAM 180 y NCAM 140, con mayores propiedades de adhesión, permitiendo la estabilización de la sinapsis. La exposición al etanol durante el desarrollo de cerebro induce: un aumento de PSA-NCAM una alteración en la transición a las isoformas maduras y una disminución en los niveles de NCAM 140 al final del periodo postnatal. Estos efectos parecen estar mediados por cambios postraduccionales, ya que los ARNm de las diferentes isoformas no se afectan por la exposición al etanol. De hecho, los niveles de actividad sialiltransferasa (enzima responsable de la síntesis de PSA-NCAM) son menores en cerebros expuestos al etanol. También hemos caracterizado la expresión de NCAM en astrocitos en cultivo primario, describiendo por primera vez la presencia de PSA-NCAM en estas células durante su fase de proliferación, apareciendo localizada en vesículas citoplásmicas del aparato de Golgi. La diferenciación de los astrocitos conlleva una desaparición de PSA-NCAM y NCAM 180 y la expresión de NCAM 140 localizada en la membrana plasmática y regiones de contacto intercelular. De acuerdo con la expresión temporal de PSA-NCAM la actividad sialiltransferasa es elevada en la fase de proliferación y disminuye conforme las células se diferencian. Mediante estudios de inmunolocalización e inmunoprecipitación con clatrina y adaptina demostramos que NCAM se endocita por una vía dependiente de clatrina. De acuerdo con estos resultados, PSA-NCAM y NCAM 140 presentan vidas medias largas (9 y 16 horas, respectivamente). La exposición al etanol induce en células astrogliales una acumulación de PSA-NCAM en el citoplasma y una disminución en membrana plasmática, sugiriendo que el etanol podría inducir alteraciones en el transporte y/o endocitosis de NCAM. Dado que las NCAM son moléculas morforreguladoras estas alteraciones en su patrón de expresión localización podrían participar en los déficits en la estructuración de cerebro inducidos por el etanol.

Autor: FERNANDEZ PEREZ MARIO.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.

Resumen: En la presente tesis doctoral se ha investigado la capacidad de respuesta al interferón (IFN) de las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) de pacientes infectados por el VBH o el VCH, así como el mecanismo de inhibición de la síntesis inducida por IFN de MxA. En las CMSP de pacientes infectados crónicamente por el VBH se han encontrado niveles bajos de MxA y 2-5A (genes inducibles por IFN) tras estimulación con IFN. Asimismo, se ha demostrado que el nivel de replicación del virus está asociado a la capacidad para responder al IFN. También, se ha demostrado que la IL-2 y la IL-12 son capaces de inducri MxA en las células de estos pacientes. En lo que se refiere a las CMSP de pacientes infectados crónicamente por el VCH se ha encontrado que los niveles de MxA y 2-5A están elevados, lo que sugiere la presencia de IFN endógeno, es decir, que la infección crónica por VCH induce la síntesis a nivel local de IFN. Se ha demostrado que durante la administración de IFN en el tratamiento de estos pacientes las proteínas MxA y 2-5A son activadas de forma diferente, y que las síntesis de MxA está relacionada con la obtención de una mejor respuesta al final del tratamiento. Por último, se ha demostrado que las proteínas core y e del VBH se unen al promotor del gen de MxA inhibiendo de esta forma la correcta transcripción desde el promotor de MxA, mostrandose por primera vez como el VBH es capaz de inhibir uno de los componentes de la rspuesta antiviral que el IFN pone en marcha.

Autor: HERNANDEZ VARGAS PURIFICACION.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: La ciclooxigenasa 2 (COX-2) es la principal enzima responsable de la elevada producción de prostaglandinas (PGs) en los tejidos inflamados. Recientemente se han desarrollado AINEs que muestran una actividad para COX-2 y carecen de los efectos secundarios atribuidos a la inhibición de COX-1. En esta tesis hemos analizado la expresión de COX-2 en dos modelos experimentales que cursan con una destacada respuesta inflamatoria: un modelo de artritis por antígeno y otro de aterosclerosis por desecación endotelial; estudiando además la acción antiinflamatoria de un inhibidor selectivo de COX-2, el Meloxicam. El incremento en el infiltrado de macrófagos, observado tanto en las membranas sinoviales artriticas como en las femorales ateroscleróticas, se correlacionaba con un aumento significativo en la expresión proteica y génica de COX-2; en cambio, los niveles proteicos de COX-1 sufrieron mínimas modificaciones. En ambos tejidos, COX-2 se localizan en las células inflamatorias así como en las residentes. La administración pofiláctica de Meloxicam a conejos con artritis prevenía la respuesta inflamatoria al reducir el exudado (163+3 vs. 272+23 líquido sinovial artrítico) y la infiltración polimorfonuclear (46 + 8 x 10 células/ml líquido sinovial vs. 88+12x10 células/ml), pero no era capaz de aminorar el reclutamiento de monocitos. Por otra parte, la inhibición en la síntesis de PGs mediada por Meloxicam (concentración de PGE2 5 veces inferior a la detectada en el líquido sinovial de animales sin tratar), se acompañaba de un descenso de un 60% en la expresión génica de COX-2, sugiriendo una posible regulación de dicha enzima por su producto. El tratamiento de células sinoviales (CSs) con PGE2 confirmó dicha hipótesis, pures inducía un incremento en los niveles del mRNA de COX-2 que fue máximo entre las 3 y 6h (1.6 veces respecto al basal con la dosis de 10 -6 M PGE2). Sin embargo, la PG necesitaba un estimulo adicional para modificar los niveles proteicos de COX-2. En este sentido, la presencia de dosis subóptimas de IL-1 (1.5 U/ml) producía un efecto sinérgico en la síntesis y expresión de COX-2 inducida por PGE2 (5 veces los niveles proteicos de COX-2 inducidos por 1.5 U/ml IL-1). En conclusión estos resultados apoyan el papel activo de COX-2 en la respuesta inflamatoria asociada a la artritis y aterosclerosis experimentales y sugieren que dicha enzima puede sufrir una regulación positiva por su producto, amplificando de este modo su expresión. El empleo de AINEs selectivos de COX-2 podría ser un importe abordaje terapéutico para el tratamiento de ambas patologías.

Autor: GUERRA GARCIA SUSANA.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGIA SEVERO OCHOA.

Resumen: La infección productiva de los parvovirus y su completa expresión génica requiere funciones expresadas transitoriamente durante la fase S del ciclo celular, si bien los factores que intervienen en esta dependencia no han sido aún descritos. El objetivo del trabajo en curso es determinar las interacciones moleculares entre proteínas virales y factores del huésped que pudieran estar alterados en el estado de transformación celular, incluyendo en la morfogénesis del virus y, en definitiva, contribuyendo al fenómeno de oncosupresión. Hasta el momento, hemos estudiado el ciclo de multiplicación del parvovirus MVM en una línea celular de glio blastoma humano no totalmente permisiva al virus. Hemos observado que la viabilidad de estas células es muy sensible a la infección, aunque no se expresa a alto nivel la proteína no estructural responsable de la amplificación del DNA, así como las proteínas de la cápsida. Asimismo, se ha obtenido el patrón de fosfopéptidos en capa fina bidimensional de la principal proteína involucrada en múltiples eventos del ciclo vital del MVM. Por otra parte, hemos puesto a prueba la capacidad oncosupresora del MVM en un sistema in vivo, empleando células de astrocitoma humano para general tumores en ratones inmunodeficientes, e inoculando el virus por vía intranasal.

Autor: LOPEZ DE HEREDIA ALONSO MIGUEL.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGIA MOLECULAR "SEVERO OCHOA".

Resumen: Se entiende por biogénesis mitocondrial el conjunto de procesos que conducen a un aumento en el número y/o actividad de las mitocondrias. Estos procesos están altamente coordinados y controlados a nivel transcripcional y post-transcripcional. En esta Tesis Doctoral hemos demostrado que las células tumorales AS30D y FAO, al igual que los hepatocarcinomas humanos poseen un menor número de mitocondrias. Esta disminución va acompañada, al igual que en el hígado fetal, de un aumento dde los niveles de los mRNAs de la fosforilación oxidativa, debido a un aumento de la estabilidad de los mismos. La menor disponibilidad de proteínas mitocondriales es debida a una represión traduccional específica del mRNA de beta-Fl-ATPasa, tanto en las células tumorales AS30D y FAO como qn el hepatocarcinoma sobre hígado sano. Esta inhibición traduccional está mediada por elementos intrínsecos al mRNA de beta-Fl-ATPasa como (i) la necesidad de que la región 3'UTR esté completa para que el mensajero se traduzca con la máxima eficiencia y (ii) la presencia de una secuencia intensificadora de la traducción en la región 3'UTR del mismo; hecho que se produce tanto en el mRNA de humanos como de rata. También, esta inhibición traduccional, esta mediada por la elevadaactividad de unión de proteínas por las regiones 3'UTR y betal.2 (situada en la secuencia codificante justo detrás de la presecuencia) del mRNA de beta-Fl-ATPasa tanto en las células tumorales AS30D y FAO como en el hepatocarcinoma humano sobre hígado sano, al igual que ocurre en el hígado fetal.

Autor: LOPEZ DE QUINTO SONIA.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD CIENCIAS. U.A.M..

Resumen: El trabajo realizado en esta Tesis Doctoral se centró en estudiar el mecanismo por el cual algunos RNAs eucarióticos, entre los que se encuentra el RNA de los picornavirus, inician su traducción de forma interna, independiente de la estructura cap presente en el extremo 5' en la mayoría de los RNA mensajeros. Para que un RNA posea la capacidad de iniciar la traducción de forma interna, es necesaria la presencia de un elemento especializado dominado IRES, que atrapa la maquinaria traduccional empleando un mecanismo molecular aún no conocido en profundidad. En este estudio se han identificado regiones conservadas entre IRES relacionados, esenciales para la actividad y que podrían determinar la estructura del RNA que compone el IRES. Posteriormente se ha analizado la contribución de estas regiones en la unión de factores de iniciación de la traducción, eIF4B y eIF4G, además de la proteína PTB, descrita como un factor transactivador de la actividad IRES. El conjunto de estos resultados enmarcado en el contexto de los descritos por otros autores, nos ha permitido proponer un modelo básico que explica cómo la maquinaria traduccional se ensamblaría sobre la estructura del IRES. En el tercer apartado de este trabajo, se ha indentificado los parámetros que determinan la selección del codón iniciador de la traducción dependiente de IRES, tanto en vectores bicistrónicos de utilidad en la expresión génica en sistemas eucarióticos como en el entorno del RNA viral.

Autor: LOPEZ MADERUELO M.DOLORES.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOMEDICAS (CSIC).

Resumen: En eta Tesis se estudia la regulación de las vías de las MAPK, ERK y JNK, en condiciones de apoptosis y diferneciación. Las células de neuroblastoma de ratón N2A entran en apoptosis al inhibir la PKCa, y para ello es necesaria la activación de JNK y la inhibición de ERK. Sin embargo, una línea derivada de las células N2A que sobre-expresan la proteína Bcl-2, es resistente a esta inducción de apoptosis, posiblemente por no producirse ni la inhibición de la vía en ERK ni la activación de la vía de JNK. Las células N2A se diferenciacian cuando se las ayuna de los factores de crecimiento presentes en el suero, cuando se las trata con geldanamicina (un inhibidor de la chaperona Hsp90) o SB203580 (un inhibidor de p38 y JNK), y cuando se las transfecta con una construcción de MEKK1 constitutivamente activa. En todas estas condiciones se produce la activación de ERK, que parece necesaria y suficiente para la diferenciación. También se han estudiado otros efectos de la geldanamicina. Este inhibidor induce apoptosis en las células PC12 e importantes cambios morfológicos en otros tipos celulares (mioblastos C2C12, keratinocitos 3D y PAM, células epiteliares HEK293 y BSC40) que confirman el efecto pleiotrópico de la inhibición de Hsp90.

Autor: MATA VICENTE M.TERESA.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: HOSPITAL RAMON Y CAJAL.

Resumen: Listeria monocytogenes es un patógeno intracelular de origen alimentario. Los análisis de una mutación en el gen gl2, el cual codifica una proteína de superficie, nos permiten pensar que se puede tratar de un receptor de osmolitos. La secuenciación a ambos lados tanto del gen gl2 como de flaR nos ha permitido indentificar tres nuevas secuencias codificantes mdetl1, trl1 y sprl1, cuyas correspondientes secuencias de aminoácidos presentan homología con transportadores de flujo de múltiples drogas, un regulador transcripcional y un regulador de antígeno de superficie, respectivamente. Los estudios interespecíficos llevados a cabo por hibridación o por PCR demuestran que las secuencias antes mencionadas sólo se encuentran en Listeria monocytogenes y en Listeria grayi, incluyendo a flaR en este grupo de genes. La caracterización del mutante construido mediante la inserción del plásmido pKSV7 en el gen mdetl1 nos ha permitido realizar un análisis comparativo de la función del gensalvaje con respecto al gen mutante, apreciándose una mayor sensibilidad de la cepa mutada LOTM1 frente a eritromicina, josamicina y clindamicina, con respecto a la cepa salvaje LO28. Estas bombas de flujo exportan no sólo antiobióticos, sino también otros compuestos tóxicos para la bacteria, tales como metales pesados, quedanto demostrado que la cepa LOTM1 tenía una mayor sensibilidad frente a ZnSO2, CoCl4, y K2CrO4. Otro compuesto tóxico para la célula es el bromuro de etidio, siendo posible medir el flujo de ésta sustancia, lo que nos permitió demostrar que nuestra proteína funcionaba como una bomba de flujo para dicha sustancia. Desde el punto de vista clínico, este gen (mdetl1) es muy interesante ya que la resistencia antibiótica de Listerina monocytogenes se ha convertido en un problema creciente desde la aparición de las primeras resistencias en 1988.