BIOQUIMICA MOLECULAR, 32

Autor: OGUETA VILLARREAL SAMUEL.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FAC.CIENCIAS, UNIV.AUTON.MADRID.

Resumen: En este trabajo hemos descrito y caracterizado que los ratones transgénicos para la hormona de crecimiento bovina (bGH) son un nuevo modelo murino de autoinmunidad y de procesos artríticos similares a la osteoartritis humana. Estos ratones, muestra unos niveles elevados de bGH e IGF1 (factor de crecimiento insulínico 1) en suero y en edades adultas presentan dificultad de movimiento. También hemos observado que el cartílago articular de estos ratones transgénicos y el de pacientes con problemas osteoartríticos expresan la isoforma larga el receptor de PRL y que su expresión es significativamente menor a la de un cartílago sano. Además, hemos demostrado que la PRL es un componente del líquido sinovial en humanos con una masa de 29 kDa y que, en base a los datos obtenidos en ratón, puede ser sintetizada en los condrocitos. La función de la PRL en el cartílago la buscamos en la diferenciación condral a partir de las células mesenquimales pluripotentes (MSC). Hemos observado que las MSC humanas, en cultivo de monocapa, expresan la isoforma intermedia, o embrionaria, del receptor de PRL y que no expresan el transcrito de PRL. Sin embargo, son capaces de proliferar en ausencia de suero y presencia de PRL de manera dependiente de dosis hasta una concentración de 10 ng/ml de hormona. También hemos observado que, cuando las células se cultivan en agregados para provocar su diferenciación condral, la expresión del receptor de PRL cambia a la isoforma larga y se expresa la PRL de origen extrapituitario, que es regulada negativamente por los glucocorticoides. Además, esta PRL, junto con los glucocorticoides, promueven la disposición de las células en columnas, al igual que sucede en el cartílago articular. Estos datos sugieren una acción del sistema PRL-receptor de PRL en los primeros estadios de la diferenciación condral. Todos los datos presentados en este trabajo sugieren que la PRL y su receptor constituyen un sistema regulador implicado en la condrogénesis, el mantenimiento de la integridad del cartílago y la regeneración del cartílago y hueso.

Autor: RODRIGUEZ IGLESIAS CRISTINA.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOMEDICAS.

Resumen: La glucosa produce en la levadura Saccharoomyces cerevisie diversos efectos, como la inducción o la represión de la transcripción de determinados genes y la activación o inactivación de diversas proteínas. En este trabajo hemos puesto de manifiesto que no sólo la glucosa es capaz de producir estos efectos, sino que la galactosa también produce efectos similares. Los mecanismos por los cuales se desencadenan todos los efectos mencionados no son bien conocidos, por tanto nos hemos propuesto la identificación de nuevos elementos involucrados en la señalización de la presencia de glucosa, de galactosa o de ambos azúcares. El abordaje que hemos seguido ha sido el aislamiento de supresores extragénicos de los efectos represores que la glucosa y la galactosa producen en una cepa que carece de los genes PYC1 y PYC2 (que codifican las isoenzimas de la piruvato carboxilasa). Una cepa pyc1 pyc2 no crece en azúcares en un medio con amonio como fuente de nitrógeno porque no es capaz de rellenar el ciclo de Krebs, debido por una parte a la carencia de actividad piruvato carboxilasa, y por otra a la represión que ejerce los azúcares sobre las enzimas del ciclo del glioxilato. Utilizando est cep como material de partida, hemos aislado una serie de mutantes que revierten este fenotipo. Uno de los mutantes caracterizados suprimía específicamente la represión por galactosa y resultó estar afectado en el gen GAL2, que codifica el transportador de este azúcar. Un transporte reducido de galactosa provoca una reducción del flujo glicolítico y un alivio de la represión catabólica que produce este azúcar. Por otro lado se han aislado dos mutantes ddrl-1 y DDR3-1, que suprimen la represión por glucosa, fructosa y galactosa. El mutante DDR3-1 crece más lentamente que la cepa silvestre en medios con glucosa o con galactosa, mientras que el mutante ddrl-1 lo hace a la misma velocidad. Ambos mutantes presentan una reducción del flujo glicolítico de glucosa y galactosa y una disminución de la represión catabólica provocada por ambos azúcares. En el intento de clonación del gen DDR3, hemos aislado el gen REGl, que es un regulador de la fosfatasa de tipo 1 Glc7, la cual desempeña diversas funciones en la célula. En estos momentos estamos tratando de discernir si REG1 es un supresor de la mutación DDR3-1 o si es el alelo silvestre de DDR3-1.

Autor: GAVIRA ALBIACH MONICA INES.
Año: 1999.
Universidad: CORDOBA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCAS.

Resumen: El sistema de reducción periplásmaica del nitrato en Rhodobacter sphaeroides DSM 158 está codificado por siete genes que forman la unidad trasncripcional nap KEFDABC. Estos genes están localizados en un plásmido y existen evidencias de transferencia horizontal de dichos genes nap entre diferente estirpes bacterianas. Los genes nanpABC son esenciales y los genes napKEFD son necesarios para la reducción óptima del nitrato in vivo. La nitrato reductasa periplásmica es un díametro formado por una subunidad catalítica, codificada por el gen napA, y un citocromo c soluble,codificado por el gen napB, que recibe los electrones de la proteína NapC, un citocromo c unido a la membrana. NapK y NapE son proteínas integrales de la membrana que podrían facilitar la interacción de NapC con una quinol oxidasa, mientras que NapD y NapF son proteínas solubles que se localizan en el citoplasma y podrían participar en el procesado y exportación del complejo NapAB al periplasma. El péptido señal con doble arginina dirige a las proteínas por la vía de secreción Tat, que sólo transporta holoproteínas plegadas. Este péptido señal de la proteína NapA no permite la exportación de la fosfatasa alcalina debido a que no se forman los puentes disulfuros necesarios para el plegamiento correcto de la enzima en el ambiente reductor del citoplasma. Por el contrario, la proteína NapA sí se transporta por esta vía Tat porque adquiere sus cofactores ( un centro sulfoférrico y un dinucleótido de molibdopterina y guanina) en el citoplasma y se pliega sin necesidad de formación de puentes disulfuros. El promotor nap es dependiente del factor general y se ha identificado el sitio de inicio de la transcripción del operón nap exacatamente a diez nucleótidos de la caja-10 de unión de dicho factor sigma. El transcrito nap tiene un tamaño de 5,5 kb y presenta la máxima expresión cuando las células se cultivan en condiciones heterotróficas, en aerobiosis y oscuridad. El análisis de la expresión de los genes nap mediante la construcción de fusiones traducionales con el gen de la galactosidasa revela que la traducción de los genes napD y napK se afecta por posibles estructuras secundarias en el RNA que ocultan los sitios de inicio de la traducción de ambos genes.El nitrato y la presencia de una fuente de carbono reducida en el medio de cultivo no afectan significativamente a la expresión de los genes nap de R. Sphaeroides, por lo que el efecto estimulador del nitrato y del butirato sobre la actividad nitrato reductasa se explica por procesos de activación enzimática. El nitrito, el clorato y el molibdato no son inductores de la expresión de los genes nap de R.sphaeroides, que tampoco se afecta por amonio.

Autor: GRANADOS MOLINA M. DOLORES.
Año: 1999.
Universidad: CORDOBA.
Centro de lectura: VETERINARIA.
Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA.

Resumen: Tiorredoxina (Trx) y Glutarredoxina(Grt), como agentes esenciales en el mantenimiento redos tiol/disulfuro, desempeña una función moduladora en el proceso de crecimiento, diferenciación y respuesta frente al estrés en mamíferos a nivel intracelular y extracelular. De esta idea junto con el hallazgo de un alto contenido de trx en células Folículo Estrelladas (FS) y la presencia de Trx y/o Grx en algunas células secretoras se desprende nuestra hipótesis de trabajo; que ambas proteínas forman parte dentro del eje hipotálamo-hipófisis-adrenal, de un sistema molecular general para el mantenimiento de la homeostasis en mamiferos. Para someter a comprobación esta hipótesis, hemos planteado los siguientes objetivos: Conocer el comportamiento de Trx y Grx en células FS de la hipófisis ante diversos estímulos ( péptidos hipotalámicos, estrés) y estudiar el appel de Trx y Grx en la modulación de la secreción de Hormona del crecimiento (GH) y porlactina (PRL) por células hipofisarias. Como modelo experimental, se escogieron inicialmente líneas celulares establecidas de origen hipofisario y luego cultivo primarios de hipófisis de rata. Con los resultados obtenidos con dos poblaciones de anticuepos policlonales que distinguen a Trx humana recombinate y Trx de rata, ambos obtenidos en nuestro laboratorio, junto con los anticuerpos frente a Grx recombinante humana se puede concluir que ambas proteínas ( Trx y Grx) tienen una localización citoplasmástica en las líneas celulares usadas como modelo de células FS y secretores(TtT/GF y GH3 respectivamente). Las células TtT/GF, incrementan su contenido en Trx al privarlas de suero y al tratarlas con PACAP y H2O2, este último además induce una mayor complejidad y una secreción de Trx al medio. En células GH3. El estrés provocado por la privación de suero inhibe la secreción de GH y PRL y la respuesta a TRH, en función de la duración del tratamiento. Grx o BSA protegen de este efecto y ejercen, además, una estimulación de la secreción de GH en células estresadas. El estrés oxidativo provocado por un aumento de especies reactivas de oxígeno o una disminución de los sistemas antioxidantes da lugar, en células GH3 a un incremento muy significativo de la secreción de GH y PRL y a una respuesta inhibitoria frente a TRH. En cultivos primarios de células hipofisarias de rata, Trx ejerce una estimulación de la secreción de PRL pero no de GH; el estrés oxidativo también tiene efectos diferenciales para la secreción de GH y PRL.

Autor: POZA CARRION CESAR.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS .
Centro de realización: UNIDAD BIOLOGIA GENERAL.

Resumen: En primer término se ha estudiado el papel de la resistencia bacteriana al estrex oxidativo en la patogénesis. Para ello, se ha caracterizado el gen oxyR de la bacteria patógena Erwinia chrysanthemi. Un mutante oxyR de esta cepa ha sido construido por recombinación homóloga. Tras la inducción con dosis no letales de agua oxigenada, este mutante es más sensible al agua oxigenada y presenta reducidos los niveles de la actividad catalasa y glutación reductasa, comparados con los de la cepa silvestre. El mutante oxyR es incapaz de formar colonias individuales en placas de agar. Sin embargo, mantiene el mismo grado de virulencia en tubérculos de patata y hojas de tabaco. Estos resultados indican que la producción de agua oxigenada por el hospedador no tiene un efecto directo antimicrobiano en la interacción de la bacteria Erwinia chrysanthemi con estas dos especies de plantas. En segundo lugar se ha realizado una tipificación molecular y caracterización de cepas de la bacteria patógena Brenneria quercina aisladas en diversas masas forestales de Quercus de la Península Ibérica.

Autor: RICART ENGEL JAVIER.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: Durante la realización de esta tesis hemos pretendido abordar determinados aspectos del control post-transcripcional de la expresión del mRNA de la subunidad del complejo Fl-ATPasa (mRNA) en hígado de rata. Se ha identificado, y purificado parcialmente, una estructura subcelular densa a electrones "gránulo" de aproximadamente 150 nm de diámetro, para la localización específica del mRNA en el hepatocito de rata. Este gránulo es específico de hígado, puesto que no se aprecia en otros tejidos como corazón, riñón y cerebro, además esta localización es independiente del momento del desarrollo estudiado. Por tanto, es en estos gránulos donde se regula la expresión citoplasmática del mRNA. En este sentido hemos demostrado que la estabilidad del mRNA es mayor durante la etapa perinatal que durante la etapa adulta. Asimismo, hemos demostrado que los gránulos son estructuras traduccionalmente activas, por otra parte hemos demostrado que Hsc70 interacciona en el hígado de rata con la proteína precursora de Fl. Se han identificado dos secuencias en el mRNA capaces de interaccionar específicamente con proteínas del hígado de rata. Estas secuencias se localizan en la región 5' codificante del mRNA (2) y en la región 3' no traducible del tráncrito (3'UTR). La secuencia 1.2 es imprescindible para conferir al mRNA un comportamiento particular en gradientes de densidad y requiere de la secuencia 3'UTR para otorgar al tránsito la gran densidad que lo caracteriza. Además se ha purificado y secuenciado la proteína p53 que interacciona con el 3' UTR del mRNA. Esta proteína candidata a regular la traducción del mRNA durante el desarrollo es la aspartin-tRNA-sintetasa de rata.

Autor: SANCHEZ GOMEZ PILAR.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGIA MOLECULAR (SEVERO OCHOA).

Resumen: Con en fin de identificar moduladores específicos de las PKCs atípicas se realizó un "screening" de una librería de ADNs complementarios de riñón humano, utilizando como molécula diana en dominio v1 de pkc lambda y mediante el sistema de dos híbridos en levaduras. Así se ha identificado la proteína p62, que interacciona selectivamente con las PKCs atípicas. Asimismo se ha determinado que p62 no es un regulador de la actividad enzimática de dichas PKCs ni un substrato de las mismas. P62 y las PKCs atípicas colocalizan con marcadores endosomales. Asimismo se ha demostrado la colocación de p62 con receptores de factores de crecimiento y citoquinas inflamatorias en células activadas. La proteína p62 interacciona potentemente con rip, un componente clave en la ruta de señalización del receptor de TNFa. Se ha demostrado que tanto p62 como las PKCs atípicas, debido a la unión rip_p62 juegan un papel esencial en la vía de activación de NF-kB.

Autor: ZUÑIGA LUCAS SONIA.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGIA MOLECULAR "SEVERO OCHOA".

Resumen: En la primera parte de la tesis se presentan los resultados obtenidos en el proyecto de analisis funcional de ORFs del genoma de la levadura Saccharomyces cerevisiae; producto de la participación de laboratorio en el proyecto europeo EUROFAN. A continuación se presentan los resultados obtenidos en un análisis más profundo de la función de la ORF YDL100c. Observamos que este gen parece estar implicado en la homeostasis de metales en la levadura. Mediante diversoso métodos de cuantificación realizamos medidas de la concentración de metales en las cepas de estudio. También realizamos estudios de microscopía electrónica, y de funcionalidad de la vacuola en las cepas silvestre y mutante. Estudiamos la localización de la proteína mediante diversas técnicas, encontrando finalmente que la proteína está localizada en la membrana de retículo endoplásmico. Estos resultados nos han abierto el camino para varios estudios, actualmente en curso, sobre el posible papel de Ydl100p en la regulación post-traduccional por degradación de algún transportador de metales, ya sea específico o de amplio espectro. Además parte del trabajo se centra en el estudio de la función ATPasa de la proteína y su posible implicación en la desintoxicación de arsénico en la levadura por su homología con la arsénico ATPasa de E. coli.

Autor: SERGHINI KHADIJA.
Año: 1999.
Universidad: CORDOBA.
Centro de lectura: INGENIERIOS AGRONOMOS.
Centro de realización: E.T.S.I.A.M..

Resumen: La presente TESIS aborda el estudio de la inducción y dustribución de tres cumarinas en plantas de girasol sometidas a diferentes tratamientos abióticos y bióticos.Las cumarinas estudiadas son: escopoletina, escopolina y ayapina.Los tratamientos empleados fueron: adición de sacarosa a raíces, exposición de la parte aérea a rediación U.V., aplicación de metalaxyl a discos de hoja, inoculación con mildiu e inoculación con jopo. Los resultados muestran una inducción de las cumarinas, si bien ésta fue diferente según el tratamiento inductor y la cumarina estudiada. Las cumarinas se sintetizan en mayor cantidad en la parte aérea que en la raíz, siendo la síntesis mayor en plantas adultas que en plántulas. Cabe destacar la inducción diferencial de cumarinas en respuesta a la infección por mildiu y por jopo según la resistencia o susceptibilidad de las variedades de girasol empleadas. Además, a partir de los resultado de síntesis y traslocación de las cumarinas y de la actividad de varios enzimas se discuten aspectos del metabolismos de las cumarinas.

Autor: FUENTE DE LOS LLANOS NATALIA DE LA .
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA. DEPARTAMENTO BIOQUIMICA.

Resumen: En un trabajo anterior llevado a cabo en el laboratorio, se aislaron mutaciones en seis genes (APA2, APA3, APA4, APA5, APA6 y APA7) que afectaban a la regulación de los niveles de la H+-ATPasa de la membrana plasmática de Saccharomyces cerevisiae. El objetivo del presente trabajo fue la caracterización bioquímica y molecular de estos genes. Los genes APA3, 4, 5 Y 6, no pudieron ser clonados debido a la presencia en la genoteca de dos supresores no específicos de alelo que se correspondían con MAT1 y SRK1. Los genes APA2 y APA7 pudieron ser identificados y resultaron ser RSP5 y YOR137c, respectivamente. YOR137c codifica una proteína de membrana de función desconocida. Su deleción no afecta a la cantidad de H+-ATPasa presente en la membrana plasmática pero afecta al incremento de la Vmax cuando activamos con glucosa. RSP5 codifia una ubicuitina ligasa implicada en la ruta de degradación proteolítica ubicuitina-proteasoma. Mutaciones en dicho gen afectan al descenso que se produce en la Km en presencia de glucosa. Su estudio nos llevó a postular la existencia de una hipotética proteína negativa del proceso de activación de la H+-Atpasa. En el intento de determinar la posible naturaleza de dicha proteína, mediante el empleo de diversas estrategias, encontramos que la ruta WSC2-RHO1-PKC1-BCK1-MKK1/2-MPK1, el factor de transcripción HAL7/YAP6 y dos proteínas de función desconocida, codificadas por los genes YJR134c e YMR102c, debían estar implicados en la regulación de la expresión de genes que intervienen en la activación de la ATPasa.

Autor: FLORES MAURIZ CARMEN LISSET.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA UAM/ INSTITUTO DE INVESTI..

Resumen: La glucosa, al igual que otros azucares, inhibe el crecimiento de mutantes glicolíticos de levaduras en fuentes de carbono alternativas, probablemente por la represión de enzimas necesarias para la utilización de dichas fuentes. En un intento de identificar genes implicados en la (s) ruta (s) de señalización de la presencia de azucares en Saccharomuces cerevisiae, se han buscado mutaciones supresoras que permitieran crecer a mutantes glicolíticos en presencia de azúcares. Utilizando como material de partida un mutante afectado en el gen GPM1, que codifica la fosfoglicerato mutasa, hemos aislado una serie de mutantes portadores de mutaciones supresoras de los efectos tóxicos de variso azúcares para esta cepa. Una de las mutaciones caracterizadas que suprimia especificamente la toxicidad de galactosa, resultó afectar al gen GAL 4, un regulador de la síntesis de los genes GAL. En un mutante GAL4 con baja expresión de los genes GAL, el consumo de galactosa es bajo y se libera la represión catabólica de una serie de genes que permiten al mutante original crecer en presencia de esta azúcar. Se ha aislado un mutante con una mutación dominante, DDR2-1 que suprime los efectos de glucosa, fructosa y galactosa. El flujo glocolítico no está afectado por esa mutación. Durante el crecimiento en glicerina +etanol+glucosa, los niveles de metabolitos ensayados en el mutante DDR2-1 fueron similares a los de la cepa parental, excepto en el caso de las triosas fosfato que eran ligeramente mayores en el mutante. La caracterización del gen respondable de la mutación está en curso. Otros mutantes aislados estaban afectados en la hexoquinasa 2 o en la fosfofructoquinasa. Estos mutantes resistían el efecto de los tres azúcares an tes mencionados.

Autor: RODRIGUEZ DE LEDESMA VEGA ANA M..
Año: 1999.
Universidad: EXTREMADURA.
Centro de lectura: VETERINARIA .
Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA.

Resumen: Los estudios realizados en nuestro laboratorio demuestran que la inhibición proliferativa asociada a la sobreexpresión de la manganeso superóxido dismutasa (MnSOD) queda parcialmente revertida en una atmósfera baja de oxígeno (3%). A pesar de que numerosos estudios demuestran que la sobrexpresión de la MnSOD se asocia a una pérdida del fenotipo maligno in vitro y disminuye la capacidad de formar tumores in vivo, no está claro cómo la MnSOD afecta a la proliferación celular. Dentro de la mitocondria, la MnSOD cataliza la reacción de simutación del superóxido a peróxido de hidrógeno (H2O2), el cual es posteriormente metabolizado por acción de las enzimas catalasa o dela glutatión peroxidasa. En el presente trabajo hemos estudiado si la inhibición proliferativa asociada a la sobreexpresión de la MnSOD es debido a un aumento del producto de dismutación, el H2O2. Para ellos hemos sobreexpresado la catalasa en células que sobreexpresan altos niveles de MnSOD (HT15) con el uso de plásmidos recombinantes para dirigir la catalasa a la ñmitocondria y al citosol. La sobreexpresión de la catalasa tanto en la mitocondria como es el citosol revertió la inhibición proligerativa y clonogénica asociada a la sobrexxpresión de la MnSOD. Sin embargo, el uso de sondas reductoras no nos ha permitido demostrar un aumento de peróxidos intracelulares en las células que sobreexpresan la catalas. Nuestros resultados también demustran que le consumo de oxígeno aumenta en todas las células que sobreexpresan la catalasa independientemente de que la actividad de la MnSOD esté aumentada. Los niveles de ATP, que están significativamente disminuidos en las células que sobreexpresan la MnSOD, son además, revertidos a niveles normales con la sobreexpresión de la catalasa. Por otro lado, la sobreexpresión de la MnSOD aumenta la sensibilidad de las células a los dadores del óxido nítrico (NOº). El NOº reacciona con el superóxido para formar peroxinitrito (ONNOº). Nuestros resultados indican que la alta actividad de la MnSOD disminuye la formación de ONNOº que resultaría en una mayor disponibilidad del NOº, el cual podría estar involucrado en los efectos antiproliferativos asociados a la sobreexpresión de la MnSOD. Por otro lado, aún cuando no hemos podido demostrar directamente un aumento de H2O2 como consecuencia de la sobreexpresión de la MnSOD, nuestros resultados apuntan a que el H2O2 esun factor dterminante en la inhibición proligerativa observada.

Autor: TAO JIANMING.
Año: 1999.
Universidad: EXTREMADURA .
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: DPTO. BIOQUIMICA Y BIOL. MOLECULAR Y GENETICA.

Resumen: La tromboastenia de Glanzmann (TG) es una enfermedad poco frecuente que se hereda con carácter autosómico recesivo. Los pacientes presentan hemorragias mucocutáneas como consecuencia de un defecto en la agregación plaquetaria debdio a un déficit cuantitativo o cualitativo del recptor de fibrinógeno, integrina GPIIb-IIIa. Los principales objetivos de este trabajo han sido: 1) el estudio de la correlación estructura-función de este recptor en pacientes de TG, y 2) el análisis estructural de esta integrina en especies de interés experimental. En el análisis de seis casos de TG detectamos cuatro nuevas mutaciones puntuales, una localizada en el exón 11 de GPIIIa, y las otras tres en el gen de GPIIIb, en los exones 2,12 y 19. Básicamente, estas alteraciones se podrían separar en dos grupos: las que dan lugar a una disminución o ausencia de RNAm y, por tanto, de proteína; y las que no alteran los nivles de mensajero, pero producen una proteína; y las que no alteran los nivles de mensajero, pero producen una proteína anómala que no puede seguir sus procesamiento normal. La caracterización funcional de estas mutaciones mediante estudios de contransfección y análisis de sus expresión nos ha proporcionado importantes datos sebre la biogénesis y el procesamiento de este receptor. En otro s de los casos estudiado, l,a expresión del receptor en la superficie plaquetaria es normal y no hallamos lesión estructural en los genes de GPIIb-IIIa, lo cual sugiere un tercer mecanismo en la etiopatogenia de la TG, que sería un defecto en la ruta de señalización que lleva a la activación del recptor. Finalmente, el análisis comparativo de las secuencias humanas y las de perro, cerdo y conejo, analizadas en este trabajo, revela un alto grado de conservación, en especial en el caso de GPIIIa, lo cual denota la gran importancia funcional de los diferentes dominos de estas proteínas. El conocimiento de estas secuencias facilitará el diseño de antígenos para producir anticuerpos con reactividad cruzada en estas especies, perimitiendo así probar sus posibles efectos terapéuticos.

Autor: BERNIER VILLAMOR VICTOR.
Año: 1999.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: INS. DE PARASITOLOGIA Y BIOMEDICINA "LOPEZ NEYRA" CSIC.

Resumen: Trypanosoma cruzi es un protozoo parásito flagelado causante de la enfermedad de Chagas, una enfermedad endémica en países de Lationaméricana que afecta a unos 18 milones de personas y a la que unos 100 millones están expuestas. Hoy en día no existe tratamiento ni vacuna eficaz contra el prásito, por lo que una aproximaciónracional consistiría en la caracterización de enzimas blanco de acción de fármacos. La desoxiuridina 5'-trifosfato nucleótido hidrolasa (dUTPasa) catliza la hidrólisis de dUTP a dUMP y pirofosfato, desempeñando un papel biológico esencial en el control de los niveles intracelulares de dUTP e impidiendo una incorporación tóxicade uracilo al DNA. Se ha islado el gen que codifica la dUTPasa de Truypanosoma cruzi mediante un screening de complementación genética en una cepa de E. Coli deficiente en actividad dUTPasa. El gen aislado codifica una enzima carente de similitud con dUTPasa descritas en otros organismos pero con un alto grado de similitud con la secuencia de la dUTPasa del tripanosomátido Leishmania mahor. Ambas secuencias comparten ciertos dominos comunes con las enzimas dUTPasa-dCTPasa de los bacteriófagos T2 y T4. Se ha sobreexpresadola proteína recombianante en D. Coli utilizando el sistema de expresión pET. La proteína recombinante se purificó y se llevó a cabo una caracterización cinética exhaustivas, así como la deteminación de ciertas características fisico-químicas. Se determinó que la unidad funcional de la enzina es un dímero con unos parámetros cinéticos semejantes a los encotrados en otras dUTPasas en cuanto a hidrólisis del dUTP y espcificidad de sustrato. Sin embargo, el dUDP es también un sustrato de la enzima, característica que la diferencia de las dUTPasas descritas en la mayoría de organismos. LA improtancia funcional de determinados residuos conservados con las enzimas dUTPasa-dCTPasa de los bacteriófagos T2 y T4 se estudió por medio de mutagéneisis dirigida. Los resultados inidcaron que los residuos Lisina 60, lisina 63, Glutámico 77 y Aspático 80 son importantes para la eficiencia catalítica. Por último, como aproximación a la determinación de la estructura tridimensional de la enzima se ha puesto a punto condiciones de cristalización que permiten de foram reproducible la obtención de cristales tridimensioanles que difractan los rayos X conuna resolución de 4 A. Las diferencias econtradas en la dUTPasa de Truypanosoma cruzi en comparación con la enzima humana sugieren una jposible inhibición selectiva de la enzima del parásito que podría ser utilizada en el trtamiento de la enfermedad de Chagas.

Autor: MANZANERA RUIZ MAXIMINO.
Año: 1999.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: CIENCIAS .
Centro de realización: ESTACIÓN EXPERIMENTAL DEL ZAIDÍN.

Resumen: En esta Tesis Doctoral se ha estudiado el factor sigma de la ARN-polimerasa encargado de la transcripción del promotor de la ruta meta durante la fase de crecimiento exponencial, conocido como RpoH ó o32. Se ha estudiado el papel del inductor 3-metilbenzoato como agente que dispara la respuesta a estrés necesaria para el estímulo del promotor citado. Además se ha estudiado los residuos del activador de esta ruta, Sy1S, implicados en la unión al promotor. Por último, concluimos esta Tesis con un estudio de los promotores del gen xy1S y xy1R en fondos genéticos carentes de IHF, sigma-54(o54) ó Sy1R, así como la influencia del extracto de levadura sobre la expresión de los promotores Pr1,Pr2,Ps1 y Ps2 en los mismos fondos genéticos.

Autor: ESTEVE NUÑEZ ABRAHAM.
Año: 1999.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: CIENCIAS .
Centro de realización: ESTACION EXPERIMENTAL DEL ZAIDIN, CSIC.

Resumen: El explosivo 2,4,6-Trinitrotolueno (TNT) está presente en suelos y aguas subterráneas cercanas a instalaciones militares o civiles donde se haya realizado actividades de producción, almacenaje y procesamiento, dando lugar a frandes volúmenes de aguas residuales contaminadas con el explosivo. La toxicidad del TNT y su carácter mutagénico hacen que la limpieza de lugares contaminados con este compuesto xenobiótico constituya una prioridad para las agencias medioambientales. A través del desarrollo experimental descrito en esta Tesis Doctoral, se ha aislado y caracterizado una cepa bacteriana, denominada Pseudomonas sp. JLR11, capaza de utilizar eficientemente el TNT como única fuente de nitrógeno en condiciones anóxicas. El proceso de eliminación de TNT ha sido optimizado en un reactor de 2 litros, manteniendo en codndiciones anóxicas y operando en condiciones estancas. Se ha mostrado que el explosivo TNT desempeña en Pseudomonas sp JLR11 un doble papel: el de nutriente y el de substrato respiratorio. El metabolismo de TNT requiere de un cosubstrato adicional que actúe como donar de electrones. Distintos compuestos carbonados (glucosa, sacaros, acetato, citrato, benzoato, p-hidroxibenzoato) son cpaces de desempeñar esta función. La asimilación del nitrógeno del TNT por Pseudomonas sp.JLR11, en condiciones de narerobiosis, tiene lugar a través de la eliminación de los grupos nitro en forma de nitrito, el cual es posteriormente reducido a amonio por la enzima nitrito reductasa. El 85% del nitrógeno del TNT y el 45% del carbono de su anillo aromático se incorporaron a material celular. El hecho de que este nitroaromático pueda actuar como aceptor de electrones en el metabolismo anaerobio de esta cepa le confirere una ventaja selectiva al permititle, no sólo sobrevivir en ambientes anóxicos como sedimientos o aguas subterráneas, sino tambieén ejercer de forma activa sus capacidades degradadoras en ambientes pobres en oxígeno contaminados con TNT.

Autor: BARROSO DEL JESUS ALICIA.
Año: 1999.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: INST. PARASITOLOGIAY BIOMEDICINA "LOPEZ-NEYRA" CSIC.

Resumen: La ribozima hairpin es una molécula de RNA capaz de catalizar enzimáticamtne el corte de otra molécula de RNA de una manera eficiente y específica.Estas propiedades de capacitan como herramienta molecular en la destrucciónde RNAs de interés y por tanto como un potencial agente terapéutico. El trabajo desarrollado en la tesis colabora en el desarrollo de la tecnología necesaria para el diseño y uno racional de ribozimas hairpin como silenciadores o supresores génico. En primer lugar se ha abordado la optimización de la actividad basal del motivo ctalítico tipo hirpin. Para ello se handeseñado y analizado comparatiavamente diferntes variantes con modificaciones simples de la estructura primaria y secundaria de la secuencia salvaje (WT), así como distintas comibanciones entre ellas. Del estudio cinético es posbile concluir que dos de esas moficiaciones (subtitución U39C y extensiónd e la hélice IV) comportan un efecto postivo redundando en un aumento de la eficiencia del 1,7 y 3 veces respectivamente en relación al aribozim aWT. El segundo objetivo del trabajo se ha centrado en la determinaciónd e lores requerimientos de secuencia que ha de cumplir una molécula de RNA para poder ser procesada por la ribozima. Esta informaciónresulta de vital importancia para la búsqueda teórica de sposibles dianas en el interior de RNAs. Hasta el momento, los datos dipsonibles resultaban incompletos y poco fiables., Bajo esta premisa decidimos analizr todas las posibles combinaciones de secuencia posbles para la región J2/1 del sustrato, región que concentra la mayoría de los requerimientos. LA G+1 esencial para la actividad de la ribozima se mantuvo fija, lo que arrojó un total de 64 sustratos distintos. De ellos solo 40 resultaron aptos para el procesamiento por la ribozima ahirpin. Aunque no es posible establecer un consenso genral, se ha obtenido informacióncinética detallada de la catálisis para cada variante del sustrto. Además de han identificdo secuencias óptimas excluídas hasta el momento de las búsquedas teóricas en los ensayos de iactivacióngénica. Se ha demostrado que la utilización de laribozima hairpin dirigida contra una de estas dianas (conteniendo la secuencia GGUU en la región j2/1) permite la destruccióni n vivo de aproximadamente un 50% del RNA mensajero de la polimersa del BDV (virus de la enfermedad de Borna). Por último, el objetivo más ambicioso ha consistido en el desarrollo de un método experimental, basado en técnicas de selección molecular invitro, que permite, dado un RNA modelo, analizar simultáneamente todas las posibles secuncias diana contenidas en él y detrminar de fomra rápida y fiable cuales de entre todas ellas son las mejores en términos de secuencia y accesibilidad. Paralelamente, este potente método proprociona, tras varios ciclos consecutivos de selección, información relativa a la secuencia de las ribozimas más efecientes en el procesamiento de lso sitios identificados. El desarrollode esta metodología jpermite prescindir de las determinaciones teóricas de dianas y ribozimas, y los posteriores ensayos de prueba y error, lo que supone un considerable ahorro de tiempo y recursos y posiblemente un aumento de la tasa de éxito de los experimentos de inactivación génica mediada por ribozimas haripin.

Autor: AMATE GALVEZ LAURA.
Año: 1999.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: FARMACIA.

Resumen: Los ácidos grasos polinsaturados de cadena larga (AGPI-CL) juegan un papel importante en la estructura y función de la membrana celuar y sonprecursores de importantes mediadores lipídicos. Se ha planteado la semiesencialidad de estos ácidos grasos en el periodo perinatal y, por tanto la conveniencia de suplementar las fórmular infantiles con los mismos. Dada la importancia de los AGPI-CL en el desarrollo de la función visual y del SNC se ha realizado muchos estudios en niños a término y pretérmino para evaluar la influencia de los AGPI-CL de la dieta sobre el desarrollo visual y cognitivo. En dichos estudios y fórmulas, se han empleado diferentes fuentes de AGPI-CL que difieren en su origen, composición y forma química. La forma química en que se presente los AGPI-CL, la distribución posicional que presenten estos ácidos grasos en la molécula y la presencia de otros componentes lipídicos pueden condicionar su digestión, absorción, biodisponiblidad y utilización biológica. En este proyecto los principales objetivos que se plantearon son: 1-Determinación de la composición lipídica y estudio posicional de distintas fuentes de AGPI-CL. 2-Estudio de la absorción de grasa en ratas alimentadas con dietas que contienen diferentes fuentes de AGPI-CL. 3-Estudio de la composición tisular y el metabolismo de lipoproteínas en cerdos alimentados con dietas que contienen diferentes fuentes de AGPI-CL. CONCLUSIONES: 1- Las distinas fuentes de AGPI-CL. Presentan diferencias no sólo en su composición y naturaleza química (triglicéridos o fosfolípidos), sino también en la distribución posicional de los ácidos grasos que las componen. 2- La absorción de g rasa total y de ácidos grasos específicos en ratas alimentadas condietas que contiene AGPI-CL procedentes de distintas fuentes no depende de si los AGPI-CL se adicionan a la dieta en forma de triglicéridos o fosfolípidos, sino más bien de las características propias de cada fuente. 3- La distribución molecualr de los AGPI-CL, de la dieta en triglicéridos y fosflípidos se mantiene tras el proceso de absorción, incorporándose los primeros a la fracción de triglicéridos y los segundos a la de fosfolípidos de los quilomicrones. Este hecho condiciona una distinta distribución de los AGPI-CL entre las fracciones lipídicas de las liproteínas plasmáticas. 4- La administración AGPI-CL en forma de fosfolípidos afecta al empaquetamiento y producción de lipoproteínas a nivel intestinal dando lugar a una disminución del tamaño de los quilomicrones infáticos y un aumento de la síntesisi de HDL en el intestino. 5- El ácido araquidónico de la dieta se incorpora de forma menos eficaz al plas y las tejidos que el ácido docosahexaenoico. Esto corrobroraría la existencia de diferentes funciones y vías metabólicas para ambos ácidos grasos en los tejidos. 6- La composición en ácidos grasos del cerebro y de la retina de cerdos lactantes responde de igual forma a la suplementación de la dieta con ácido docosahexaenoico esterificado a triglicéridos o fosfolípidos, por lo que para estos tejidos aún no completamente desarrollados en el peridodo postnatal temprano, ambas fuentes de AGPI-CL serían biológicamente equivalentes.

Autor: ALAMINOS MINGORANCE MIGUEL.
Año: 1999.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: ESTACION EXPERIMENTAL DEL ZAIDIN (CSIC).

Resumen: La cepa Pseudomonas putida DOT-T1E presenta un enorme potencial catabólico debido a su capacidad para utilizar diversos tóxicos orgánicos como fuentes de carbono, lo cual la convierte enuna herramienta muy útil para la biodegradación de los mismos. Uno de los compuestos que pede metablizar esta cepa es el p-hidroxibenzoato, liberado al medio ambiente como producto de desecho por parte de numerosas industrias químicas y farmacéuticas, siendo muy tóxico para la mayor parte de los organismos vivos. En este trabajo, se han caracterizado tres genes relacionados con el metabolismo degradativo de p-hidroxibenzoato, que se denominaron pcaR, pcaK y pacaF. El gen pacaK se demostró que codificabauna proteína pcaK encargada del trasnporte de p-hidroxibenzoato hacia el citoplasma celulara para su degradación posterior por parte de los productos de los genes pca. El gen pcaR codificaba una proteína reguladora del ciclo de degrdación de este compuesto aromático, que se denominó ciclo del b-cetoadipato puesto que este compuesto se sintetizaba como producto intermediario de dicho ciclo. Finalmente, el producto del gen pcaF catalizaba la conversión del b-cetoadipil-CoA en intermediarios del ciclo de los ácidos tricarboxílicos, no liberándose ningún compuesto xenobiótico recalcitrante durante este proceso. Mediante la construcción de mutantes deficientes en el gen pcaK y posterior caracterización fenotípica de los mismos, pudeo demostrarse el papel fundamental del trasnportador PcaK en la incorporación de p-hidroxibenzoato a la célula, en especial a pH alcalinos, no apreciándose diferencias respecto a la estirpe silvestres cuando las células se cultivaron en medios mínimos enriquecidos consuccinato, glucosa o benzoato. Los experimentos de RT-PCR demostraron que los tres genes se transcribían independientemente unos de otros, formando tres unidades transcripcionales distintas y tres ARNm distintos. De igual modo, se comprobó el papel de PcaK como agente quimotáctico necesario para la migración polar de las células hacia una fuente de p-hidroxibenzoato en un grdaiente de este compuesto, así como la no influencia de esta proteína en la tolerancia a elevadas concentraciones de este ácido aromático. La síntesis de metionina es un proceso complejo que se ha descrito en enterobacterias y ciertos organismo gram-positivos. Sin embargo, no se conoce la ruta de síntesis de este aminoácido en la especie Pseudomans putida, patónego oportunista de animales y plantas. El conocimiento del mecanismo biosintético de la mitionina en Pseudomonas podría ser la base de una nueva generaciónde antibióticos que actuasen inhibiendo la síntesis de este compuesto, pues se ha demostrado una myor patogenicidad de las cepas autxótrofas para la metionina en especial en pacientes afectos de fibrosis quística. Además, un enzima implicado en la transformación de la metionina, denominado metioninasa, se ha demostrado útil en la lucha contra el cáncer en pacientes afectos de metástasisi sistématicas. En este trabajos, mediante técnicas de PCR e hibridación en southern, se han logrado amplificar los genes implicados enla ruta de síntesis de metionina,los cuales se utilizaron ulteriormente para la construcción de estirpes mutantes en estos genes. De este modo, se pudo determinar la implicaciónde los genes metX y netW en la transformación de la homoserina en O-acetil-homoserina, así como la transformación de este último compuesto en homocisteína por acciónd el producto delgen metZ, mediante una sulfhidrilacióndirecta. Finalmente, se comprobó la transformación de la homocisteína en metionina mediante el producto del gen metE, el cual no se había identificado previamente en especies del género Pseudomonas, o mediante el producto del gen metH,siendo ambas rutas paralelas. A continuación, se identificó un gen reguladro positivo de la ruta, que se denomió netR por su similitud realtiva conlos genes metR descritos previamente en Escherichia coli, Salmonella tiphymurium y Haemophilus influenzae. Es la primera vez que se demuestra la presencia de este regulador enPseudomonas. La construcción de mutantes deficientes en el gen metR demostró su papel como inductor de los demás genes implicados enla biosíntesis de la metionina en condiciones de deprivaciónde metionina, así como la posible existencia de otros genes reguladores o de otros agentes inductores de dicha ruta. Finalmente, se analizaron las distintas proteínas resultantes de la traducciónd e todos los genes secuenciados, comparándose enlos péptidos depositados en los bancos de proteínas disponibles en Internet para generar distintos alineamientos proteínicos. Después de analizar la parsimonia y la homología, se propusieron distintos árboles evolutivos de dichas proteínas, sugiriendo diversas teorías acerca del origen de los genes y de la relación filogenética de los microorganismos comparados.

Autor: ARNAUD ALEXANDRA.
Año: 1999.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: ABBOTT I+D BIOQ. Y BIOL. MOLEC. UNIV. GRANADA.

Resumen: Los nuleótidos, sillares estructurales de los ácidos nucleicos, son considerados como nutrientes semiesenciales. En estudios recientes, se ha evaludado el efecto preventivo y recuperador de los nuleótidos de la dieta frente al daño hepático caudado por la administraciónde tioacetamida. Estos efectos estarían a través de la modulación de la expresiónd e genes relacionados conla fibrogénesis. El objetivo de este trabajo fue evaluar los potenciales efectos de los nucleósidos sobre la expresión de genes marcadores de fibrogénesis y funcionalidad hepática, en cultivos celulares. Se han caracterizado tres modelos de cultivo de células estelares, de hepatocitos adultos y de cultivos de ambos tipos celulares, en cuanto a su tasa metabólica y su capacidad de síntesis de proteínas de la matriz extracelular, encontrándose que los cocultivos reproducen fielmente los estadios tempranos del proceso de fibrogénesis. Los nucleósidos adicionados a los medios de cultivo son captados e incorporados por las células estelares, los hepatocitos y los cocoultivos, modificando las concentraciones intracelulares de nucleótidos solubles, espcialmente ATP, GTP y UDP-glucosa, lo que se traduce en la modificación de la biosíntesis de glicoproteínas de la matriz extracelular. Los nuleósidos, en su rango de concentraciónde 1 a 100uM, no producen efectos tóxicos en los sistemas de cultivo ensayados. Asimismo, los cambios en el perfil de nucleótidos intracelulares no afectan a la proliferación de las células estelares y de los hepatocitos en los cultivos individuales y en los cocultivos. Los nucleosidos exógenos aumentan la producción de bibronectina y de laminina tanto en los cultivos de células estelares activadas como en los hepatocitos, Asimismo, la producción de colageno en las células estelares aumenta por efecto de los nucleósidos. La adición de los nuleósidos al medio de los cocultivos de células estelares y de hepatocitos disminuye los contenidos de fibronectina, de laminia y de colágeno, siendo la disminución de este último atribuible tanto a una disminución en su biosíntesis como a un incremento en su declaración. Los nucleósidos exógenos restauran parcialmente la carga energética celular, y como consecuencia, la funcionalidad de los hepatocitos en un sistema de cocultivo con células estelares activadas.