BIOQUIMICA MOLECULAR, 33

Autor: MESA GARCIA M. DOLORES.
Año: 1999.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: FARMACIA .
Centro de realización: DPTO. DE BIOQUIMICA, INSTITUTO DE NUTRICION Y TECNOLOGIA DE LOS ALIMENTOS.

Resumen: Las enfermedades cardiovasculares constituyen una de las primeras causas de mortaldiad y la primera de morbilidad en los países desarrollados. La oxidación de las LDL, que depende de la generaciónintracelular de peróxidos lipídico, juega un papel fundamental en el desarrollo de la aterosclerosis. La curcumina es el pincipal compnenente del extracto de Curcuma longa que además contiene varios polipéptidos concapacidad antioxidante como la turmerina y otros que todavía no han sido identificadors. Está comprobado el efecto antioxidante, antiinflamatorios, inmunomodulador, hepatoprotector, y anticanercoso de los extractos de esta planta y de alguno de sus componentes. Algunas de estas actividades podrían ser beneficiosas para la prevención de las aterosclerosis, al evitar la oxidación de las lipoproteínas y la formaciónde la placa de ateroma. Este trabajo de tesis doctoral tratará de evaluar el efecto antiaterogénico de un extracto de hidroalcohólico de cúrcuma sobre la susceptibilidad a la oxidación de las lipoproteínas, y sobre la protección de la aplaca de ateroma, así como sobre la susceptibilidad a la aoxidación de las membranas de eritrocito, los microsomas y las mitocondrias hepáticas y sobre el sistema de defensa antioxidante celular hepático. La administración oral de 1,6mg/kg/d/ y 3,2 mg/kg/d de un extracto hidroalcohólico de Curcuma longa (10,8% encurcuminoides), dosis similares a las utilizadas por poblaciones humanas consumidoras habituales de cúrcuma, durante un periodo relativamente corto (10-30 días), disminuye la susceptibilidad a la oxidación de las LDL de conejos con aterosclerosis experimental producida por la ingesta de una dieta rica en grasa animal y colesterol, y protege la intefridad de la aorta, limitando el desarrollo y la progresión de las lesiones ateromatosas. La ingestión de dicho extracto de cúrcuma disminuye la susceptibilidad a la peroxidación lipídica de las membranas de eritrocito, los microsomas y mitocondrias hepáticas de los conejos con aterosclerosis experimental, sobre todo en los estados más avanzados de la enfermedad. No obstante, esta bajas dosis de cúrcuma no corrigen las alteraciones del sistema de defensa antioxidante celular hepático.

Autor: CALZADA LOMBANA JOSE EDUARDO.
Año: 1999.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA, U. DE GRANADA.

Resumen: En la presente investigación se analiza la posible influencia de los genes: HLA de clase I, NOS2, CCR5, TGFb1 y NRAMP1, sobre la susceptibilidad a la infección por Trypanosoma cruzi y bre el desarrollo de formas severas de esta efnfermedad. Con este fin se estudiaron 156 sujetos no relacionados pertenecientes a una región rural del Sur de Perú, considerada endémica para la enfermedad de Chagas. Según los resultados de tres pruebas serológicas la población de estudio se dividió en controles seronegativos y pacientes seropositivos. El grupo de serpositivos se subdividió en asintomáticos y cardiacos basados en los resultados de exámenes clínicos y electrocardiogramas. Las frecuencias de los polomorfismos genéticos fueron comparadas en estos distintos grupos. Al analizar los genes HLA de clase I se observó que el haplotipo B*15-Cw*01 ejercía un efecto protector dominante en la infección por T. Cruzi, mientras que el haplotipo extendido A*02-B+3505-Cw*04 confería una mayor susceptibilidad a la infección. Los polimorfismos estudiados de los genes NOS2, TGFb1 y NRAMP1 no se encontraron asociados de forma significativa conla susceptibilidad a la infección o con la predisposición a padecer cardiomiopatía chagásica en la población evaluada. Por otra parte el genotipo A/G del polomorfismo 59029 del gene CCR5 parece ejercer un efecto protector sobre el desarrollo de cardiomiopatía chagásica.

Autor: SANCHEZ DE MIGUEL M. LOURDES.
Año: 1999.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: QUIMICA.
Centro de realización: FUNDACION JIMENEZ DIAZ.

Resumen: En esta tesis se describe por primera vez la existencia de un elemento cis en el extremo 3'-UTR del ARNm de la óxido nítrico sintasa endotelial. Esta región es rica en citidinas y uracilos e interacciona con una proteína citosólica endotelial con un peso molecular aparente de 60 kDa. Esta interacción está regulada por el factor de necrosis tumoral-a que estimula dicha interacción a la vez que induce la disminución de la vida media del ARNm de la óxido nítrico sintasa endotelial. El factor de necrosis tumoral-a induce parcialmente la síntesis de esta proteína. La simvastatina, uninhibidor de HMG-CoA-reductasa, es capaz de prevenir los efectos producidos por el factor denecrosis tumoral-a, previene la estimulación de la interacción del extremo 3'-UTR del ARNm de NOSe conla proteína citosólica endotelial y aminora la disminución en los niveles de ARNm de NOS. Además, el estado de proliferación de la célula entotelial también modifica el nivel de expresión de la óxido nítrico sintasa endotelial. El estado proliferativo o subconfluente jpresenta unos niveles mayores de ARNm de óxido nítrico sintasa y una interacción menor de la proteína citosólica conel extremo 3'-UTR del ARNm de la óxido nítrico sintasa endotelilar respecto al estado no proliferativo o subconfluente.

Autor: GUALIX SANCHEZ FRANCISCO JAVIER.
Año: 1999.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: QUIMICA.
Centro de realización: BIOQUIMICA, FACULTAD VETERINARIA, UNIV. COMPLUTENSE.

Resumen: Los nucleótidos de adenina, cuya representante más característico es el ATP, así como una serie de compuestos estructuralmente relacionados, como son los denominados genéricamente diadenosina polifosfato, son importantes moléculas señalizadoras que median en un gran variedad de acciones biológicas a travésde su interacción con recptores específicos en la superficie de céluas diana. Como paso previo a su liberación al medio extracelular, estas sustancias son almacenadas en vesículas de secreción en tejidos neurales y endocrinos. Para llegar a dilucidar el papel de los nucleótidos y dinocleótidos de adenina en la señalización celular es necesario analizar su transporte a los gránulos secretores. Esto se ha llevado a cabo, en un primer momento, empleando como modelo los glánulos cromafines de la médula adrenal. Para caracterizar el transporte de nucleótidos y dinucleótidos a los gránulos se han empleado técnicas tanto flurimétricas como radiométricas. Una mayor conocimiento de esta etapa de transporte vesicular se ha conseguido aplicando la técnica puntera de citometría de flujo. Mediante el uso de estas metodologías se ha podido obtener complejas curvas de saturación del transporte, con varias etapas, para cada uno de los sustratos ensayados. Por analogía con otros transportadoras y enzimas que presentan un comportamiento cinético similar, el transportador puede ser definido como mnemónico. Esto implica la existencia de diferentes formas de la proteína transportadora que difieren en sus propiedades cinéticas y se interconvierten entre sí, lentamente, bajo la acción de los sustratos. Estos ensayos han puesto también de manifiesto la existencia de actividades enzimáticas en el interior de los gránulos que catalizarían la transferencia de grupos fosfato entre los nucleótidos almacenados. La puesta a punto de una técnica para la medida del transporte de nucleótidos a vesículas sinápticas ha permitido llevar a cabo el estudio de las propiedades cinéticas y farmacológicas de la proteína transportadora presente en estos orgánulos y la comparación con el modelo de los gránulos cromafines.

Autor: MINGOT ASCENCAO JOSE MANUEL.
Año: 1999.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: CENTRO DE INVESTIGACIONES BIOLOGICAS (CSIC).

Resumen: En el trabajo realizado en esta Tesis Doctoral se han estudiado diferentes aspectos de factores de transcripción PacC(factor que media la regulación por pH de la espresión génica en Aspergillus nidulans) en respuesta a un pH ambiental alcalino. Se ha demostrado que el producto primario de traducción de pacC se procesa proteolíticamente para dar lugar a una forma activa de la proteína mucho más estable y que la ruta de transducción de la señal de pH ambiental alcalino codificada por los genes pal, es necesaria para que este procesamiento pueda tener lugar; se ha caracterizado el principal punto de corte de la proteasa procesativa y se han obtenido evidencias muy consistentes que favorecen la hipótesis de que el pH ambiental, más que regular la actividad de la proteasa, regula la accesibilidad de PacC a esta proteasa. Así mismo se ha comprobado que el pH ambiental regula la localización nuclear de PacC; que, a diferencia de lo que ocurre con el producto primario de traducción, la localización nuclear de la forma procesada de PacC es independiente de la funcionalidad de la ruta pa1 y que la región de PacC que contiene los dedos de zinc es necesaria para que proteínas PacC similares en tamaño a la forma procesada de la proteína se localicen en el núcleo. Finalmente lo resultados obtenidos en esta tesis muestran que pacC no regula positivamente su propia expresión y que el producto primario de traducción de pacC no es inactivo y parece modular negativamente la función pacC.

Autor: LLORÉNS FERRERO MÓNICA.
Año: 1999.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: QUIMICA.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS.

Resumen: El metabolismo celular es capaz de responder a cambios tanto en sus parámetros internos(constantes cinética, concentraciones enzimáticas, etc.) como en las restricciones externas. El tiempo que tardan las variables de un sistema metabólico en llevar a cabo dicha respuesta es de fundamental importancia para entender el proceso de optimización evolutiva, así como para diferentes aplicaciones biotecnológicas. Las magnitudes propuestas hasta el momento para estimar el tiempo de respuesta en rutas metabólicas eran sólo válidas bajo condiciones especialmente restrictivas, y no eran aplicables a sistemas que muestren algún tipo de oscilación en su evolución hacia el estado final. Por ello este trabajo se centra en la búsqueda de una definición completamente general del tiempo de respuesta, válida para cualquier tipo de variable (flujos de entrada, de salida,velocidades intermedias y concentraciones enzimáticas),para sistemas evolucionando bajo cualquier clase de restricción(flujo constante, afinidad constante…), independiente del estado final(de equilibrio, estacionario, oscilatorio), y aplicable a cualquier forma de dinámica(monótona en el tiempo, mediante oscilaciones amortiguadas, etc.). Con esta finalidad se ha definido el tiempo característico, Tc, que es el promedio de la derivada de la función cuya evolución se pretende caracterizar y que puede ser interpretado como el tiempo el cual puede considerarse concentrada toda la transición. Se ha corroborado la absoluta generalidad de esta magnitud, comparándola con las previamente dadas por otros autores. Asimismo, se ha comprobado su aplicabilidad empleando para ello datos experimentales obtenidos de modelos in vitro. Por último, con el fin de estudiar el papel que ha podido desempeñar el tiempo de respuesta en la evolución del metabolismo, se ha analizado la optimización de esta función en sistemas metabólicos sencillos.

Autor: CASCANTE BURGOS VICENTE.
Año: 1999.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: HOSPITAL UNIVERSITARIO. LA PAZ.

Resumen: El receptor soluble de la transferrina (sTfR), es un nuevo marcador clínico del metabolismo del hierro, cuya utilidad diagnóstica todavía no está bien aclarada. El objetivo de este trabajo es evaluar la relación existente entre la concentración sérica de sTfR, y el metabolismo férrico en condiciones patológicas. Para ello se ha evaluado una serie de 172 pacientes con diversas enfermedades hematológicas, en quienes se realizó un examen hematimétrico completo, parámetros habituales del metabolismo del hierro, y estudiod e médula ósea. Los resultados demuestran que la concentración sérica de sTfR aumenta en situaciones de deficiencia funiconal de hierro tanto en la ferropenia como en el bloqueo del metal en los macrófagos, y también enla hiperplasia eritropoyética. Los niveles del parámetro descienden en la hipoplasia eritropoyética. En pacientes con alteraciones patológicas en la maduración de la serie roja, el comprotamiento del sTfR no es afectado por estos factores en la misma maginitud que en el resto de los pacientes. Este marcador no se comporta como un reactante de fase agusa. El sTfR no es un parámetro sensible ni específico para detectar la feropenia, porque no es un marcador del compartimento de depósito orgánico de hierro. Este parámetro puede ser utilizado como indicador de la deficiencia funcional de hierro, y también del grado de eritropoyesis . Pero si se utiliza como índice de deficiencia, se necesita conocer el grado de actividad eritropoyética del paciente. Y viceversa, su utilización como indicador de eritropoyesis, precisa el conocimiento del status férrico del individuo.

Autor: RODRIGUEZ FRADE JOSE MIGUEL .
Año: 1999.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGIA.

Resumen: Las quimioquinas son una familia de proteinas de bajo peso molecular caracterizada por su capacidad de inducir la migración y activación de diferentes poblaciones leucocitarias. En los últimos años ha cobrado importancia el papel que juegan en otros procesos como son la hematopoiesis, angiogenesis, rechazo de tumores o la infección por HIV-1. Las quimioquinas ejercen sus efectos mediante su interación con receptores de siete dominios transmembrana acoplados a proteinas G. Estos receptores constan de un extremo amino terminal y tres bucles extracelulares, implicados en la interacción con el ligando, y de un extremo carboxilo terminal y tres bucles intracelulares que colaboran en la traducción de la señal. La activación de los receptores de quimioquinas por sus respectivos ligandos induce la activación de las vias de señalización aclopadas a proteinas del tipo Gi. Tomando como modelo la quimioquina MCP-1 y su receptor, CCR2, nos hemos planteado identificar los mecanismos que se activan tras la unión de la quimioquina a su receptor. Para ello, se han obtenido anticuerpos monoclonales especificos frente al CCR2. Estos anticuerpos nos han permitido detectar la presencia de dicho receptor en poblaciones linfocitarias. De especial interés es la presencia de CCR2 funcional en la superficie de los linfocitos B. El hecho de que alguno de los anticuerpos obtenidos presente actividad inhibitoria de algunas cepas del virus HIV-1,asi como actividad agonista o antagonista del MCP-1, nos ha permitido definir aquellas regiones del CCR2 que juegan un papel importante en la interacción con el MCP-1 y con la proteina gp120 del HIV-1. En lo que se refiere a la activación del CCR2, hemos identificado que el MCP-1 induce la fosforilación en tirosinas del CCR2 y la activación de quinasas de la familia JANUS, que incluye la asociación y fosforilación de JAK2 y de factores de transcripción de la familia STAT. Tras este paso previo enel cual juega un papel critico la tirosina 139 del receptor, se producen los cambios conformacionales que posibilitan la asociación de la proteina Gi y la consiguiente activación de las vias con ella relacionadas. En el estudio también se han identificado las señales implicadas en la desensibilización de dichos receptores. En este sentido, la activación con MCP-1 conduce a la formación de un complejo macromolecular formado por el propio receptor, la GRK2 y la arrestina que desacopla la proteína G. El CCR2 es finalmente internalizado en vesiculas de clatrina, proceso en el que juega un papel fundamental la dinamina.

Autor: GODINO GARCIA ANA.
Año: 1999.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: HOSPITAL CLINICO SAN CARLOS (A.CLINICOS). MADRID.

Resumen: El gen p16 (INK4A-MTS-1,CDKN22) se encuentra localizado en el cromosoma 9p21, un sitio de frecuentes pérdidas alélicas en muchos tumores humanos. Codifica una proteína de 15,8 kd de peso molecular llamada p16, la cual bloquea la progresiónd el cilo celular de la fase G1 a la fase S por unión conkinasas dependientes de ciclinas (CDK4 y CDK6, respectivamente), inhibiendo la acciónfosforilante de la ciclina D1 sobre la proteína del retinobastoma. Mediante un nuevo método llamado MSP (Meethlation-specific PCR) se estudia el estado de melitación del gen p16 en 44 carcinomas de pulmón no microcíticos (CPNM). También se estudia la LOH y la inestabilidad de microsatélites en la región 9p21 de p16 mediante PCR en 98CPNM. Se relacionan los resultados obtenidos con las variables clínico-patológicas y los factores pronóstico clásicos. Se estudia el valor pronóstico de las alteraciones genéticas estudiadas en cuanto a la supervivencia global y a la superviviencia libre de enfermedad de los pacientes con CPNM.

Autor: SISTIAGA HERNANDO ALESSANDRA.
Año: 1999.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FARMACIA.

Resumen: La Tesis Doctoral presentada por la doctoranda Dª Alessandra Sistiaga Hernando estudia el papel modulador, tanto de la vía NO/GMPc, como de la activación de los receptores metabotrópicos del grupo I, sobre la liberación de glutamato. En ella se pone de manifesto que los receptores metabotrópicos del grupo I son capaces tanto de potenciar como inhibir la transmisión sináptica y la liberación de glutamato, en función de la concentración de glutamato extracelular. Así, cuando la concentración de glutamato extracelular es baja (aproximadamente 1uM), el receptor facilita la liberación de glutamato y la transmisión sináptica por un mecanismo dependiente de la activación de la proteína quinasa C por el diacilglicerol generado tras la estimulación del receptor. Sin embargo, la activación repetida del receptor, que puede tener lugar por un ligero incremento en la concentración de glutamato extracelular, desnsibiliza la respuesta facilitadora, manifestándose un efecto inhibidor tanto de la transmisión sinàptica como de la liberación de glutamato. Esta inhibición se produce como consecuencia de una disminución en la actividad de los canales de Ca2+ del tipo N, y se produce por acoplamiento del receptor a una proteína G insensible a toxina pertúsica y el canal de Ca2+. El acoplamiento del receptor a la vía inhibidora podría ser debido a la fosforilación del receptor por la proteína quinasa C. Una proteína fosfatada del tipo 1/2 A está implicada en la defosforilación del receptor, y por tanto en la recuperación de la respuesta facilitadora. Los efectos inducidos tras la activación de este receptor sobre la transmisión sináptica, son debidos a una modificaión en la liberación de neurotransmisor, lo que indica una localización presináptica del efecto. La identidad del receptor que induce estos efectos no se conoce, aunque los experimentos realizados en ratones que carecen de mGluR1 indican que no es este receptor el implicado en estos efectos. Para observar el efecto facilitador durante la estimulación de 5 minutos utilizada en los ensayos de liberación, se requiere bien la activación persistente de la proteína quinasa C(con el agonista en presencia del ácido araquidónico), o bien la activación del receptor con el agonista y la inhibición de la proteína fosfatasa 2B. Estos resultados ponen de manifiesto que esta proteína fosfatasa es la implicada enla defosforilación de la diana de la proteína quinasa C en el efecto facilitador, que parece ser un canal de K+. En esta Tesis también se pone de manifiesto que la supresión de las acciones inhibidoras de adenosina tras la activación del mGluRs del grupo I, es debida a una fosforilación por una quinasa sensible a estaurosporina, y que la duración de las mismas está controlada por una proteína fosfatasa del tipo 2B. La activación de la vía NO/GMPc tiene un efecto dual sobre la liberación de glutamato: Por un lado, bajas concentraciones de GMPc tiene un efecto dual sobre la liberación de glutamato por un mecanismo dependiente de la activación de la proteína quinasa G. Sin embargo, mayores incrementos en los niveles de este mensajero, anulan el efecto inhibidor por un mecanismo en el que no parece intervenir la proteína quinasa G.

Autor: VENTURA PANIAGUA JUAN JOSE.
Año: 1999.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: Hemos intentado caracterizar los mecanismos celulares implicados en la acción del TNF-a, utilizando los hepatocitos fetales de rata como sistema de trabajo. Hemos conseguido comprobar como en respuesta al TNF-a son activadas rutas de quinasas de la superfamilia de las MAKPKs, y factores de transcripción como AP-1,NF-KB. Además hemos esclarecido los efectos que esta citoquina produce sobre algunas funciones celulares, como la proliferación y la diferenciación, y la implicación en esta activdidad de las diferentes rutas antes mencionadas. Como punto central de nuestro trabajo, hemos tenido el de revelar los distintos mecanismos celulares utilizados por el TNF-a en su inducción de la respuesta inflamatoria en los hepatocitos. Para ello hemos contado con posibilidad de analizar la expresión de diferentes genes implicados en el proceso inflamatorio, que son modificados en su expresión en respuesta al TNF-a. Paralelamente, ha sido nuestra intención el conocer el modo de actuación de diversos antiinflamatorios, caracterizando las dianas moleculares específicas que son objeto de una regulación en el proceso de su actividad, así como la determinación de posibles efectos colaterales a la acción antiinflamatoria, que estás moléculas pueden ejercer sobre los hepatocitos. Hemos utilizado la dexametasona, como modelo representativo de antiinflamatorio esteroideo, y la curcumina y el salicilato como no esteroideos.

Autor: LOPEZ BORGES SUSANA A..
Año: 1999.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: CTRO. NACIONAL DE BIOLOGIA FUNDAMENTAL INSTITUTO DE SALUD CARLOS III.

Resumen: La línea celular SW756 de carcinoma cervial lleva ADN de HPV-18 integrado en la región cromosómica 12q14-15, loculs PAL 2. Se demuestra en este trabajo que la línea celular SK-v de uan lesión premaligna vulvar, lleva integrado ADN d eHPV-16 en el mismo clon cosmídico procedente de esa región cromosómica. Con esto puede afirmarse que la integración en este locus PAL-2 es una alteración genética recurente. Por ello es importante la identificación de un gen que pueda verse alterado en este tipo de lesiones como consecuencia de la integración viral, y que ayude en el conocimiento de los carcinomas cervicales. Como consecuencia de esta búsqueda se ha identificado una nueva proteína quinasa serina-treonina, llamada VRK1. Es una proteína nuclear que se autofosforila en múltiples residuos de serina y treonina. VRK1 fosforila la proteína supresora de tumores p53 en su domino aminoterminal, concretamente en la treonina 18. Este residuo se encuentra en la región que entra en el bolsillo hidrofóbico en su inhibidor MDM2. De esta manera la fosforilaciónpuede inhibir la interación p53-MDM2 y por lo tanto impedir el transporte al citoplasma y degradación de p53. Con esto se abre una nueva vía de señalización anterior a p53.

Autor: ZARAGOZA CASTELLANO M. ASUNCION.
Año: 1999.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FARMACIA .
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: En este trabajo se han investigado los efectos tóxicos de la cocaína utilizando como modelo experimental cultivos primarios de hepatocitos de ratas pretratadas con fenobarbital. El tratamiento de los hepatocitos con concentraciones crecientes de esta droga(0-1000 microM)provoca un incremento en la producción de especies reactivas de oxígeno y una disminución de glutation reducido y de la expresión de los enzimas antioxidantes(catalasa, Mn-superóxido dismutata, CuZn-superóxido dismutasa y glutation peroxidasa), generándose un daño mitocondrial, así como la inducción de la muerte celular, por apoptosis o necrosis, dependiendo de la dosis del hepatotóxico. La incubación de los hepatocitos en presencia de sustancias antioxidantes, N-acetil cisteína, precursor del glutation, y desferroxamina, quelante de hierro, junto con la cocaína, ejerce una acción protectora frente a los efectos tóxicos de la droga. Este efecto protector corrobora el papel de las especies reactivas de oxígeno en la hepatotoxicidad de la cocaína.

Autor: ALONSO PALACIOS JORGE.
Año: 1999.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: CENTRO DE INVESTIGACIONES BIOLOGICAS(C.S.I.C.).

Resumen: Los microorganismos patógenos han mostrado la sorprendente capacidad para adquirir o desarrollar mecanismos de resistencia a los antibióticos que se han ido introduciendo durante las pasadas cuatro décadas en la lucha clínica de las enfermedades infecciosas. En la actualidad, se hace necesaria la continua búsqueda de nuevos antibióticos con un mejor espectro de actuación. La industria farmacéutica está interesada en sustituir las clásicas metodologías químicas empleadas enla producción de los antibióticos denominados semisintéticos por bioprocesos donde intervienen diferentes enzimas que pueden modificar los antibióticos naturales u otras moléculas derivadas de ellos. La producción de dichas enzimas mediante técnicas recombinantes y la obtención a partir de ellas, de proteínas de fusión que pueden ser purificadas y/o inmovilizadas de forma sencilla, son estrategias deseables para facilitar la incorporación de la tecnología enzimática a los procesos industriales. La D-aminoácido oxidasa(DAAO) es una flavoproteína que cataliza estereoespecíficamente la desaminación oxidativa de D-aminoácidos de cadena corta e hidrofóbicos generando el alfa-cetoácido correspondiente, H2O2 y NH3. Dicha enzima también cataliza la biotransformación de la cefalosporina C en el GL-7ACA, una reacción que constituye la primera etapa del bioproceso para la obtención del núcleo B-lactámico 7-ACA, empleado en la síntesis de nueva cefalosporinas. Esta tesis describe la clonación de los genes TvDAO1 u RgDAO1 que codifican las DAAO de las levaduras Trigonopsis variabilis(TvDAAO) y Rhodotorula gracilis(RgDAAO), respectivamente. La presencia de istrones en ambos genes hizo necesario la síntesis de los cDNA correspondientes con el fin de lograr su expresión en E. Coli. Se han sobreproducido las TvDAAO y RgDAAO recombinantes que muestran una características semejantes a las de las enzimas nativas y se ha puesto de manifiesto que ambas proteínas recombinantes se obtienen como una mezcla de sus formas apoenzima y holoenzima, cuyo proporción relativa está en función de las condiciones de fermentación de los clones productores. Se ha diseñado un sencillo proceso para purificar la DAAO que permite disminuir considerablemente su inactivación enzimática. Por otro lado, se ha puesto a punto la obtención de mutantes de la RgDAAO y se ha demostrado mediante esta tecnica la importancia del residuo His329 en la catálisis, quizá implicado en la abstracción del protón alfa del sustrato. Además, se han obtenido proteínas de fusión entre las TvDAAO o RgDAAO y los dominios(His)6 de afinidad a cationes metálicos divalentes o C-CPL1 de afinidad a colina. Dichas proteínas quiméricas, que mantienen su actividad catalítica, se han purificado mediante una única etapa cromatográfica de afinidad utilizando resinas de IMAC. En el caso del dominio,(His)6 o resinas portadoras de lamolécula de DEAE, un análogo estructural de la molécula de colina, en el caso del dominio C-CPL1. La Prolina iminipeptidasa(PIP) es una peptidasa específica de residuos aminoterminales de L-Pro, un aminoácido cuya especial estructura impide al resto de peptidasas su actuación sobre él. La prolina iminopeptidasa de Xanthomonas campestris pv. Citri(XcPIP) también reconoce con alta eficiencia residuos aminoterminales de L-Ala, lo que le permite catalizar la biotransformación de la ascamicina, un antibiótico nucleósido, para rendir la desalanilascamicina, otro antibiótico con mayor potencial antibacteriano. En esta tesis se ha clonado y secuenciado el gen que codifica la XcPIP. Su expresión en E. Coli ha permitido sobreproducir, purificar y caracterizar la XcPIP recombinantes que muestra las mismas características que la enzima nativa. Se ha determinado que la XcPIP pertenece al grupo de enzimas denominadashidrolasas con plegamiento alfa-beta y que su centro activo está constituido por la tríada catalítica Ser110-Asp266-His294. La XcPIP se han fusionado al dominio C-LYTA de afinidad a colina y la proteína quimérica resultante antiva se ha purificado con unos altos rendimientos en una única etapa cromatográfica utilizando una columna de DEAE-celulosa.

Autor: AMBLAR ESTEBAN MONICA.
Año: 1999.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGIA.

Resumen: El trabajo de esta Tesis Doctoral se ha centrado en la caracterización de la actividad 5´de la DNA polimerasa I de Streptococcus pneumoniae. Mediante el análisis mutacional del dominio de actividad nucleasa y la determinación de las actividades enzimáticas de los derivados mutacionales, se ha establecido que mutaciones introducidas en los residuos D10,D190 y E114 afectan sólo las actividades relacionadas con el dominio nucleasa. Los estudios realizados han generado resultados, que indican la función de dichos residuos y apoyan un modelo catalitico que requiere la unión de dos metales (Me1 y Me2). El residuo D190 parece estar implicado en el evento catalítico interaccionado con el metal Me2 requerido para la actividad nucleásica. El residuo E114 estaría implicado en la unión al DNA sustrato y proximo al sitio del Me1. El residuo D10 estaría localizado en las proximidades del sitio Me1, sin interaccionar directamente con el metal, y siendo requerido para la actividad catalítica. El derivado mutacional D10A, carente de actividad nucleásica, ha sido analizado para su utilización en tecnicas de secuenciación de DNA manual y automática. Se ha comprobado que dicha proteína es capaz de elongar oligonucleótidos marcados fluorescentemente que emiten luz en el reango de infrarojo y de incorporar nucleótidos marcados con digoxigenina(marcaje interno) dando un patrón de bandas homogeneo, características que no presentan otras polimerasas, como las del bacteriófago T7 y la de Thermus aquaticus, utilizadas rutinariamente en técnicas de secuenciación.

Autor: CAMPION ZABALZA FRANCISCO JAVIER.
Año: 1999.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: DEPT. B Y BM FAC. MEDICINA U.C.M..

Resumen: En el presente trabajo se demuestra que in vivo en ratas las catecolaminas y los mineralocorticoides son capaces de regular de forma tejido-especifica la expresión del gen del receptor de insulina. Siendo lo más significativo e incremento en expresión de este gen en el tejido adiposo en el caso de las catecolaminas y el incremento en expresión en el hígado en el caso de los mineralocorticoides. Por lo que se refiere a los efectos in vitro en promonocitos humanos ambas hormonas inhiben la expresión del gen del receptor de insulina de forma dosis y tiempo dependiente. Pero mientras el efecto de las catecolaminas parece ser el resultado de un efecto post-transcripcional: disminución de la vida media del ARNm del receptor de insulina; el efecto de los mineralocorticoides resultó ser transcripcional y regulado por elementos que responden a glucocorticoides localizados en el promotor de este gen.

Autor: SANCHEZ GARCIA CRISTINA.
Año: 1999.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAD DE CC BIOLOGICAS.

Resumen: Los cannabinoides son compuesto sintetizados por la especie vegetal Cnnabis sativa, común mente conocida como marihuana. Aunque su uso en medicina se remonta al quinto milenio a C. El estudio cintífico entorno al cannabis no comenzó hasta bien entrada la segunda mitad de este siglo. Hoy en día está descrito que estos compuestos producen sus efectos a través de receptores específicos de la superfamilia de receptores con siete fragmentos transmembranares acoplados a proteínas G. La presente Tesis Doctoral se centra en el estudio del mecanismo de acción de los cannabinoides en células gliales. Estas células desempeñan funciones muy relevantes dentro del sistema nervioso, entre ellas la regulación del metabolismo energético cerebral. En un primer capítulo se describenlos efectos metabólicos de los cannabinoides y se analizan los posibles mecanismos responsables de tales efectos. Los resultados han llevado a concluir que la estimulación metabólica general que producen estos compuestos es debida a la generación de ceramida y consiguiente activación de la cascada ERK/MAPK. Posteriormente se analizaron los posibles efectos apotóticos de los cannabinoides in vitro demostraron que estos compuestos producen apoptosis, y no necrosis, en células de glioma. Este proceso parece ser consecuencia de un aumento sostenido en los niveles de ceramida, lo que a su vez produce una estimualción sostenida de la cascada ERK/MAPK. Los estudios in vivo demuestran que los cannabinoides retrasan la muerte de los animales a los que se han inoculado células tumorales, y lo que resulta más interesante,un porcentaje significativo de ellos sobrevie a los tumores.

Autor: TALADRIZ MORENO SORAYA.
Año: 1999.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: CENTRO DE INVESTIGACIONES BILÓGICAS, CSIC.

Resumen: Las DNA polimerasa dependientes de DNA se agrupan en familias denominadas A, B y X en base a su similitud de secuencia. La familia X está constituidad principalmente por las DNA plimerasas beta y las desoxinuleotidil transferasas terminales (TdT). Pol beta es la enzima responsable de la reparación del DNA nuclear en eucariotas mediante le mecanismo de reparación por excisión de una base (BER). Hemos clonado el gen codificante de la proteína DNA pol beta delprotozoo parásito Leishmania infantum. El gen consta de 1131 pares de bases y codifica una proteína de 376 aminoácidos con una masa molecular estimada de 43kDa. Se ha demostrado que la proteína está codificada por un gen de copia única y transcribe un mensajero de 1200 nuleótidos. Los niveles tanto de mensajero como de proteína varían periódicamente a lo largo del ciclo del parásito. Se ha expresado la proteína por cromatografía de afinidad en columnas de agarosa cargada con níquel. La proteína purificada ha sido utilizada para la obtención de un antisuero policlonal en conejo. El suero ha sido utilizado en ensayos de localizaciónpor inmunofluorescencia mostrando una localización nuclear de pol beta, si bien el patrón de localización varía a lo largo del ciclo vital del parásito. Se ha ensayado la actividad DNA polimerasa insitu de la proteína recombinante, así como el fragmento catalítico obtenido por la degradación proteolítica de la proteína completa. Se ha desarrollado unmodelo molecular par la DNA polmersa beta de Leishmania infantum que muestra la estrucura en forma de mano característica común de todas las polimerasas.

Autor: MENDOZA FERNANDEZ M. CARMEN DE.
Año: 1999.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGIA .
Centro de realización: HOSPITAL CARLOS III ISC III, MADRID.

Resumen: La introducción de la spruebas de carga viral ha supuesto un avance importante en la compresión y en el seguiemiento de los pacientes por VIH. Sin embargo, estas pruebas están en continua renovación, mejorando su espcificidad, linearidad y, sobre todo, su sensibilidad. Este último punto adquiere gran relevancia a la hora de evaluar la respuesta al tratamiento antirretroviral. En lo que se refiere a la evaluación de las técnicas de carga viral, hemos examinado: i) la sensibilidad de las distintas metodologías y las difrencias existentes entre ellas; ii) la linearidad en los rangos de viremia conimportante implicación clínica; y iii) la especificidad tanto para la cuantificación de las diferentes variantes del VIH, como para su uso en el diagnósitoco precoz de la infección por VIH. Más de la mitad de las muestrs analizadas convalores inferiores a 500 cop/ml presentaron viremia detectable suprior a 40 cop/ml. Además, una alta proporción de ellas informaron valores discrepatnes (0,5 log) en este rango de viremia. Por tanto,la linearidad de estas pruebas esta comprometida en muestras con valores reducidos de carga viral. Las técnicas de amplificación de secuencia proporcionaron valores más altos de carga viral que las de amplificación de señal, tanto enlos rangos inferiores (500 cop/ml), como en los usperiores (10,00 cop/ml). Por último, las pruebas de carga viral actualmente disponibles han sido diseñadas tomando como patrónel VIH-1 subtipo B. Por ello la cuantificación de otros subtipos, así como el diagnóstico de la infección por VIH utilizando estas pruebas, están comprometidos y pueden proprocionar resutlados incorrectros en la cuantificación de subtipos no-B o falsos positivos en el diagnóstico. En cuanto a la aplicación clínica de las pruebas de carga viral, muchos son los aspectos que requiren estudio. Sin embargo, únicamente nos hemos centrado en dos de ellos: i) la evaluación de diferentes tipo de terapia antirretroviral y el grado de supresión viral alcanzado; y ii) el significado clínico de la presencia de vitremia residual en pacientes en tratamiento antirretroviral. Los pacientes que incluyen en su combinaciónd e fármacos uninhibidor de la proteasa presentan unmayor grado de supresiónviral. La presencia de viremia dtectable a bajo nivel, definida como viremi residual, no predice un fracaso virológico importante (500 cop/ml) a un año, aunque los pacientes que logran viremia indetectable (40 cop/ml) en el nadir no desarrollan mutaciones de resitencia. Sin embargo, puesto que el mayor beneficio de la terapia antirretroviral se obtiene cuando el grado de supresión viral es mayor y más prolongado las estrategias de intensificación y/o el cambio selectivod e uno de los fármacos de la combinación podrían ser las opciones válidas en aquellos pacientes con supresiónviral insuficiente. Por último, pautas de tratamiento optimizadas para un mejor cumplimiento proprocionan una eficacia virológica comparable al resto de combinaciones convencionales. Esto es cierto enla práctica clínica en contraposición a los ensayos en fase III y IV, a pesar de las limitaciones farmacocinéticas de algunos antivirales.

Autor: LEDESMA FERNÁNDEZ AMALIA.
Año: 1999.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: FAC. BIOLOGÍA.

Resumen: La alergia atópica es un tipo de hipersensibilidad basada en la producción de anticuerpos IgE contra antígenos en principio inocuos(alergenos). El polen de gramíneas, arbustos y árboles constituye una importante fuente de alergia. Entre ello, el polen de olivo, destaca por su alta incidencia en los países mediterráneos. En la presente memoria se presenta el clonaje y expresión en E. Coli de dos alergenos del polen de olivo(Ole e 3 y Ole e 8). La primera es una proteína de 9.2 Kda que presenta reacción cruzada con proteínas homólogas presentes en distintas fuentes alergénicas. Ole e 8, tiene una masa molecular de 18.7 Kda y muestra una fuerte tendencia a dimerizar. Ambas proteínas contienen en su secuencia motivos estructurales de unión de calcio de tipo EF-hand, dos en Ole e 3 y cuatro en Ole e 8. Este último alergeno sufre importantes cambios conformacionales dependientes de la unión a calcio, dichos cambios conformacionales dependientes de la unión a calcio, dichos cambios se manifestan en cambios en la movilidad electroforética de la proteína, así como cambios en los espectros de dicroísmo circular y fluorescencia. Por otra parte se ha demostrado una menor afinidad de los anticuerpos IgE e IgG por las formas de estos alergenos libres de calcio. Así variantes hipoalergénicas de estas proteínas podrían ser utilizadas en tratamientos de inmunoterapia.