BIOQUIMICA MOLECULAR, 34

Autor: ZAMARRO MOLINA M.TERESA.
Año: 1999.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: GLAXO WELLCOME, S.A..

Resumen: La aspergilosis presenta dificulatades para conseguir un rápido diagnóstico y frecuente fracaso terapéutico. Para resolver los problemas de profilaxix y tratamiento deben encontrarse nuevas moléculas con capacidad antifúngica. Aspergillus fumigatus, especie más patógena del género Aspergillus princial responsable de la aspergilosis en sus formas más severas, es el objeto de estudio del presente trabajo. El objetivo es encontrar y caracterizar aspectos bioquímicos, dentro de su fisiología, que sean susceptibles de ser inhibidos eficaz y selectivamente, afectando a su viabilidad celular. Todo ello, deberá traducirse en el desarrollo de ensayos bioquímicos que permitan la búsqueda de compuestos inhibidores a traves de programas de screening. De todas las posibles o potenciales dianas antifúngicas, se ha elegido el proceso de síntesis de proteínas frente a otras dianas más explotadas, como las pared celular o la membrana plasmática. Se ha conseguido la optimización y estandarizqación de las condiciones de cultivo de A. Fumigatus, tanto en matraz como en fermentador, para obtener sistemas libres de células cona ctividad en síntesis de proteínas. Coneste material biológico se ha desarrollado un ensayo de elongación a aprtir de un mensajero sintético, adpatado a un formato que permite el desarrollo de programas de HTS. El procesode screeing realizado ha rendido melóculas que finalmente se han mostrado no selectivas o tóxicas, por lo que no han podido progresar a estudios posteriores. Analizado el efecto de los derivados de Sordarina, se ha puesto en evidencia que producen un efecto de inhibición reversible en el proceso de síntesis de proteínas, responsable del efecto fungistático del crecimiento de A. Fumigatus, demostrándose que la diana molecular dentro del ciclo de elongaciónd e estos agentes antifúngicos en A. Fumigatus es el factor de elongación EF-2. De todos los derivados analizados, el dierivado GM 222712 es el que se ha mostrado mayor potencia de inhibición, tanto en sistemas libres de célula como en célula entera. Por otra parte, se ha comprobado que el transpsorte del derivado GM 237354 en A. Fumigatus se psroduce por un mecanismo de difusión pasiva dependiente del gradiente de pH establecido a través de la membrana, al descartase la participación de proteínas transportadoreas y la necesidad de energía metabólica. También se ha conseguido poner a punto otros ensayos para enzimas implicadas en la modificación lipídica de proteínas de A. Fumigatus, que permitan abordar progrmas de screening, dirigidos a encontrar inhibidores selectivos. En concepto se ha optimizado un ensayo en formato SPA para la enzima N-mirisoiltransfersa y un ensayo radioquímico para la enzima 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima a reductasa.

Autor: GOMEZ FABRE PEDRO MANUEL.
Año: 1999.
Universidad: MALAGA.
Centro de lectura: CIENCIAS.

Resumen: La enzima glutaminasa activada por fosfato(EC 3.5.1.2; PAG) se sobreexpresa en ciertos tipos de tumores, pero su papel en el crecimiento y proliferación de células tumorales se desconoce. En esta Memoria se describe el aislamiento de un clon de cDNA completo de PAG de células de cáncer de mama humano ZR-75,mediante una combinación de rastreo de una genoteca en el vector lamda-gt10 y la técnica de RACE(ampliación rápida de los extremos de un cDNA). El cDNA de la PAG humana tiene 2408 nucleótidos, con un marco abierto de lectura de 1806 nucleótidos que codifican una proteína de 602 aminoácidos con una masa molecular teórica de 66309 Da. La secuencia deducida de aminoácidos contiene una putativa presecuencia de importe a lamitocondria compuesta por los primeros 14 residuos en el extremo amino terminal. La expresión de la proteína recombinante en bacterias produjo un producto del tamaño esperado, que fue reconocido por anticuerpos anti-PAG. El análisis de la secuencia mostró que la PAG humana es muy similar a la isoenzima L de rata. Análisis por hibridación Northern reveló que este gen se encuentró un único tránscrito de 2.4 kb. No se encontró señal de hibridación en riñón, corazón, músculo esquelético,pulmón y placenta. Estos resultados sugieren que la primera glutaminasa humana y tumoral clonada, la PAG de cáncer de mama humano, y presumiblemente las enzimas de hígado y cerebro humano, son isoenzimas tipo L, lo que entra en closión con el paradigma vigente de expresión de PAG en mamíferos.

Autor: SANCHEZ SEVILLA JOSE FEDERICO.
Año: 1999.
Universidad: MALAGA.
Centro de lectura: CIENCIAS .
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: En este estudio se ha puesto a punto la aplicación de la técnica de marcadores moleculares AFLP en fresa (Fragaria x ananassa). Esto ha permitido la identificación de variedades en fresa no identificables previamente usando la técnica de isoenzimas o RAPDs. Como resultado del análisis se ha observado un bajo nivel de polimorfismo entre todas las variedades comerciales analizadas y entre éstas y la varieda silvestre Fragaria Chiloensis. Este polimorfismo fue mayor cuando se comparó la variedad silvestre diploide Fragaria vesca. Además se ha observado una herencia disómica enla mayoría de los marcadores AFLP analizados aunque no se ha podido descartar que parte del genoma de Fragaria x ananassa presenteuna herecia polosómica. Adicionalmente se ha caracterizado un gen de fresa (FaMIP21) inducible durante el proceso de maduración del fruto. La proteína codificada con este gen presenta homología conproteínas intrísncias de membrana plasmática. Estudios de la expresiónde FaMIP21 determinó que se expresa en todos los tejidos analizados aumentado su expresión enfrutos durante la maduración y que además su expresión está regulada en hojas por el estadío hidrico. Estudios por Sout¡hern determinó la presencia de varias secuencias homólogas en fres. Nuestra hipótesis es que FaMIP21 podría estar asociada conproceso de ajuste osmótico para el mantenimiento de la turgencia.

Autor: ALVARADO PERAL M. EUGENIA.
Año: 1999.
Universidad: OVIEDO.
Centro de lectura: MEDICINA .
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: La regulación de la expresión génica es un aspecto fundamental en procesos tales como el crecimiento celular, la diferenciación de organismos pluricelulares o la respuesta celular a condiciones ambientales cambiantes. Uno de los mecanismos genéricos de control transcripcional en levadruas es la Represión catabólica por nitrógeno, fenómeno mediante el cual la presencia en el medio de cultivo de fuentes nitrogenadas de fácil utilización, reprime la síntesis de permeasas y enzimas necesarios para la utilización de fuentes de nitrógeno secundarias. En esta Tesis se ha aislado y secuenciado el gen cpy1+ que codifica la carbopeptidasa Y de la levadura de fisión Shizosaccharomyces pombe, una preproteína de 1002 aminoácidos, en cuyo extremo carboxilo terminal se localiza el dominio típico de serín carboxipeptidasas de la familia S10. La transcripción del gen cpy+esta regulada mediante represión catabólica por nitrógeno, elevándose los niveles de mensajero y de actividad enzimática al eliminar la fuente de nitrógeno del medio o al proporcionar a las células una fuente de dificil utilización como la Prolina. Además, el dipeptido A-Phe-Leu-OH parece comparterse como un inductor de la expresión del gen. Situaciones de estrés, como el choque térmico y osmótico, parecen no tener efecto sobre la expresión del gen, el cual no está sometido a represión catabólica por glucosa. El análisis informático de la región promotora reveló la presencia de nueve secuencias consenso para la unión de factores de transcripción de la familia GATA, implicados en el metabolismo del nitrógeno. La región comprendida entre las posiciones -195 y -154, que contiene dos secuencias TATC orientadas cabeza/cola separadas por 25 pb, es capaz de unir posibles factores de transcripción, tanto en condiciones represores, como depresores, como de ayuno corto de nitrógeno. La región comprendida entre las posiciones -116 y -93,que contiene dos secuencias TATC unidas cabeza/cola no solapadas entre sí, es capaz de unir posibles factores reguladores de la transcripción en todas las condiciones nutricionales ensayadas.

Autor: DIAZ TRELLES RAMON.
Año: 1999.
Universidad: OVIEDO.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: la terfenadina(TEF) es un antagonista no sedativo de los receptores H que posee un amplio espectro farmacológico. Así, se ha visto que bloquea canales iónico sensibles a voltaje o que se le une a la glicoproteina P en células no neuronales. Nosotros hemos utilizado cultivos primarios de neuronas granulares de cerebelo de rata para estudias de que manera la TEF podria modular la neurotransmisión por aminoácidos excitadores y los posibles efectos de la TEF sobre la activación de los receptores del glutamato. Nuestros datos sugieren que la TEF a concentraciones micromolares potencia el influjo de calcio y excitotoxicidad tras la estimulación de los receptores NMDA y no-NMDA a través de mecanismos que implican la modulación del calcio intracelular y la producción de radicales libres. Por otra parte, a concentraciones nanomolares la TEF puede reducir la descarga de glutamato tras una despolarización permitido a la vez la síntesis de segundos mensajeros.

Autor: CAGIGAS PACHECO M. ELENA.
Año: 1999.
Universidad: OVIEDO.
Centro de lectura: MEDICINA.

Resumen: Se ha analizado la variabilidad genética en seis línea de piscifactoría y en 46 muestras nautrales de trucha común (Salmo Trurra L.) basándose en 25 loci enzimáticos, tres micorsatélites de locus único y nueve "RAPDs". Las muestras hasn sido capturadas en ríos de las siguientes regiones: mediterránea (Navarra), cantábrica oriental (Guipúzcoa), cantábria occidental (Asturias) y noratlántica (León). En este trabajo se pretende: a) Conocer el grado de diferenciación entre poblaciones mediterráneas y cantábricas b) evaluar los efectos genéticos que la repoblación con líneas domésticas causa en las poblaciones naturales c) buscar nuevos marcadores que pudieran ayudar a entender las relaciones genéticas entre las poblaciones españolas de trucha común. Los resultados más relevantes en relación con los objetivos planteados en este trabajo son los siguientes: a) Efectos de la repoblación: La combinación de alelos específicos detectados en las líneas de piscifactoría (AAT-1*130, MDHA2*200, G3PDH-2*50, GPI-B*103 y SOD-2*75) y en las poblaciones neaturales (ADH*-65, IDHP-4*130, LDH-C*104, MEP-3*90, PGDH-2*106 y SOD-2*110) complementa el uso clásico del locus LDH-C* como marcador de repoblación, mejorando sustancialmente la valoración de las relaciones genéticas que se establecen en condiciones naturales entre ambos tipos de pobalciones. Se estima que en aquellas muestras en las que se ha detectado el alelo LDH-C*90 entre el 13 y el 19% del genoma original como término medio ha sido desplazado por elelos foráneos. Asimismo se constata que el acervo génico de las poblaciones localizadas en áreas protegidas (no repobladas), se encuentra amenazado ya que en el 36% de las mismas (5/14) se han detectado alelos específicos de la línea de piscifactoría. La hibridación e introgresión entre individuos naturales y domésticos provocan un incremento en el nivel de variabilidad (Na, P y H) en las muestras en las que se han detectado alelos específicos de piscifactoría en relación con aquéllas que aún mantienen sus características originales. Sin embargo, debido a la utilización de una única línea de piscifactoría, el grado de diferenciación interpoblacional (Gst) se reduce en un 28% respecto a las muestras de la misma área que conservan su acervo génico nativo. b) Diferenciación atlántica-mediterránea: las poblaciones en las que no se ha detectado el alelo LDH-C*90 presentan variantes y distribución de frecuencias alélicas características de los grupos establecidos en las poblaciones españolas, linajes II y IV, si bien el nivel de variabilidad (Na, P y H) es ligeramente superior al observado en cada uno de los linajes anteriores. El grado de diferenciación a escala microgeográfica , entre las regiones mediterránea y cantábrica oriental, es menor que el descrito en un nivel macrogeofráfico, aunque las poblaciones que ocupan dicha área microgeográfica son signigicativamente heterogéneas en sus frecuencia salélicas y presentan una estructura poblacional altamente subdividida. Las características genéticas peculiares de la regiónnoratlántica, como son la casi fijación de variantes específicas (MDH-B1*, -B2*80, Str-15*210 y OPF-03*C), determina una diferenciaciónsignificctiva de ésta frente al resto de las regiones dentro de la vertiente atlántica, mayor incluso que la existente entre las regiones del área microgeográfica, lo que sugiere la posible existencia de una estirpe menor dentro del linaje II en la península Ibérica. C) Aplicación de microsatélites de locus único y RAPDs. Los análisis de microsatélites de locus único y de los RAPDs proporcionan mayor nivel de variabilidad genética (Na, P y H) que el obtenido mediante loci enzimáticos, aunque confirman el patrónde diferenciación obtenido previamente mediante estos últimos. Ambas metodologías establecen diferencias significativas entre las muestras de la región mediterránea y atlántica y, denro de esta última, también entre la región noratlántica y el binomio cantábrica oriental-occidental. Sin bien cada una de las metodología empleadas (loci enzimáticos, microsatélites de locus único y RAPDs) detectan marcadores específicos de población y/o región, los microsatélites d elocus único proprocionan un mayor número de variantes y permiten, como término medio, un mayor porcentaje de clasificación de los indiviudos en su muestra de origen que con los loci enzimáticos.

Autor: GARCIA JIMENEZ M. JESUS.
Año: 1999.
Universidad: OVIEDO.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACUTAD DE MEDICINA.

Resumen: En este trabajo se ha abordado el análisis de los mecanismos moleculares que activan la producción de colagenasa-3. Esta proteína es una enzima hidrolítico perteneciente a la familia de las metaloproteasas de la matriz extracelular o MMPs, y que fue inicialmente identificado en nuestro laboratorio en muestras de cáncer de mama. Desde su descubrimiento, numerosos grupos en todo el mundo pusieron de manifiesto la posible implicación de la colagenasa-3 en el desarrollo de enfermedades de tanta relevancia como el cáncer, la artritis o la aterosclerosis. Por otra parte, la colagenasa-3 parece desempeñar un importante papel en la formación del hueso, gracias a su capacidad de degradar diversos componentes de las matrices óseas y cartilaginosa, como los colágenos fibrilares tipo I y II y el agrecano. Se ha demostrdo asimismo que esta proteasa se expresa durante el desarrollo en condrocitos hipertróficos y osteoblastos, y su expresión se reactiva durante la reparación de fracturas óseas, en la formación de hueso ectópico y en enfermedades degenerativas de las articulaciones, como la artrosis y la artritis reumatoide. Dada la importancia de estos procesos nuestro trabajo se ha centrado en el estudio de la regulación de la expresión de la colagenasa-3 en el proceso de formación osea. Tras el aislamiento y análisis detallado de la región promotora del gen de la colagenasa-3 hemos demostrado que este gen posee un sitio AP-1 funcional en su promotor, y es capaz de ser activado transcripcionalmente en respesta a TCF , un factor generalmente implicado en la inhibición de la síntesis de MMPs. Por otra parte, hemos comprobado que la presencia en su promotor de un elemento de respuesta a Cbfa-1, el primer factor de transcripción implicado en la expresión de genes específicos de osteoblastos, está relacionada con la expresión de esta proteasa en osteoblasts y condrocitos tanto in vitro como in vivo. Asimismo, hemos demostrado que el ácido retinoico induce el gen de la colagenasa-3 en células de condrosarcoma, probablemente como parte de un efecto diferenciador sobre los condrocitos. Finalmente hemos intentado aclarar los mecanismos moleculares que subyacen a esta activación, y hemos comprobado que las actividades PKC, tirosín-quinasa y p38 MAPK son necesarios para la inducción del gen de esta proteasa en las células de condrosarcoma. Estos estudios pueden contribuir al desarrollo de métodos que permitan bloquear la inducción de la colagenasa-3 durante el desarrollo de procesos patológicos tan importantes como el cáncer o la artritis.

Autor: HERNANDEZ LANTIGUA INGRID.
Año: 1999.
Universidad: OVIEDO.
Centro de lectura: MEDICINA .
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: En la tesis presentada se ha clonado por complementación funcional el gen cps1+,codificador de la carboxipeptidasa S de la levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe, secuenciandose toda la pauta abierta de lectura y las regiones 5´y 3´flanquantes. La proteína codificada pertenece a la familia M20 de metalocarboxipeptidasas, habiendose localizado residuos implicados en la unión del metal y en la actividad catalítica del enzima. Mediante extensión del cebador se identificó el sitio de inicio de la transcripción para el gen cps1+, localizado en la posición -194, a partir del cual sugerimos que la secuencia que actúa como caja TATA en el promotor se sitúa en la posición-367. Se ha estudiado la expresión del gen mediante Análisis Northern realizado en diferentes condiciones nutricionales y ambientales. Se ha comprobado que los niveles del ARN mensajero correspondiente se elevan significativamente en presencia de fuentes de nitrógeno. Este compportamiento es típico de genes sometidos a un sistema genérico de control transcripcional denominado Represión Catabólica por Nitrógeno. Se han identificado y comprobado la funcionalidad, mediante ensayos de retardo en la movilidad electroforética, tres partes de secuencias consenso de unión a factores de transcripción pertenecientes a la familia GATA. Se han identificado varios de estos factores trans implicados en la regulación de la expresión del gen y se han purificado algunos de ellos mediante cromatografía de afinidad, utilizando extractos proteicos obtenidos de células en condiciones desrepresoras.

Autor: GUTIERREZ VILORIA CRISTINA.
Año: 1999.
Universidad: OVIEDO.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: El trabajo recogido en esta Tesis Doctoral versa sobre las relaciones Estructura-Función de dos de los componentes de la cascada de señalización originada en respuesta a la hormona TRH en células adnohipofisarias GH3:el Receptor de TRH y el Canal de K+ implicado en la regulación de la actividad eléctrica celular por la hormona, utilizando para ello el canal homólogo humano h-erg. En el Receptor de TRH se estudian residuos y/o dominios implicados en la activación del receptor, y en concreto, una secuencia conservada ERY situada al inicio del lazo intracelular II, así como dominios implicados en el acoplamiento a las proteínas G, específicamente el lazo intracelular III. En el canal de K+ h-erg se estudia el papel regulador específico que ejerce el dominio proximal del extremo amino terminal sobre la activación del canal, y que es dependiente de la presencia del dominio eag implicado en el cierre del canal, y de la presencia de secuencias específicas en dicho dominio proximal. En concreto, se ha determinado que es importante una región de 19 aminoácidos situada en el extremo carboxilo de dicho dominio. Se han estudiado también residuos del segmento S4 y del lazo S4-S5,que posiblemente forman parte del sitio de interacción en el cuerpo central del canal del dominio eag de dicho extremo amino terminal.

Autor: REDRUELLO TRELLES Mª BEGOÑA.
Año: 1999.
Universidad: OVIEDO.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: El gen ACR1 de S.cervisiae resulta esencial para la utilización de fuentes de carbono no fermentables como etano, acetato glicerol y ácido oleico. Codifica un miembro de la familia de los transportadores mitocondriales cuya función es intercambiar el susccinato citosólico por el fumarato mitocondrial. La expresión del gen se ve favorecida en presencia de etanol, glicerol, lactato y ácido oleico mientras que se reprime completamente cuando la glucosa está presente. Este fenotipo es típico de genes gluconeogénicos como ICL1 o FBP1. En el análisis de la secuencia promotora del gen se identificaron tres elementos de tipo CSRE cuya funcionalidad se demostró mediante análisis de deleción y de expresión heteróloga. Ensayos de retraso de la movilidad electroforética pusieron de manifiesto la formación de complejos de unión específicos CSRE-proteínas. Además, los CSRE de ACR1 compitieron con el elemento CSRE del promotor ICL1 por unirse a determinadas proteínas. La proteína quinasa Cat1 es esencial para la actividad de estos elementos. Entre los factores transcripcionales que participan en la regulación de proteínas mitocondriales, se demostró que la expresión del gen ACR1 se ve afectada en cepas deficientes en el gen HAP2 pero no en el gen HAP1. En el promotor ACR1 existen además dos elementos de tipo STRE que participan en la respuesta general al estrés de numerosos genes y cuya funcionalidad se demostró al delecionarlos específicamente. Además, la falta de los factores Msn2 y Msn4, que se unen directamente a ellos, hace disminuir la expresión de ACR1. De acuerdo con ello, ésta se ve afectada al someter a las células de levadura a situaciones consideradas de estrés para las células.

Autor: ALVAREZ PIÑERA JESUS.
Año: 1999.
Universidad: OVIEDO.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: Se ha investigado la expresión de los colágenos tipo II y X de la matriz y de la colagenasa-3 en las placas de crecimiento de la tibia de ratas caracterizadas por tener distintos ritmos de crecimiento. El colágeno tipo II forma el armazón estructural básico de la matriz, el colágeno tipo X se asocia con los estadios terminales del ciclo de maduración de los condrocitos y la colagenasa-3, debido a su amplio espectro la acción sobre los componentes de la matriz podría jugar un importante papel en los procesos de remodelado necesarios para la correcta actividad de la placa de crecimiento que es el órgano efector del crecimiento óseo longitudinal. Por ello, hemos considerado la expresión génica de estas proteínas como un buen indicador de la dinámica de síntesis y degradación de la matriz extracelular de la placa de crecimiento. Con el fin de estudiar los procesos de síntesis y degradación de los colágenos mayoritarios de la matriz y si estos procesos mostraban una correlación con el ritmo de crecimiento de los animales, se utilizaron ratas normales en tres estadíos del desarrollo postnatal normal(21,35 y 80 días de edad) y ratas con hipocrecimiento asociado a la insuficiencia renal crónica. Este último grupo se dividió en animales sin tratamiento alguno y en animales tratados con hormona de crecimiento (GHrh). Se encontró que la expresión de los colágenos de la matriz y de la colagenasa-3 fue específicamente activada o desactivada en diferentes estadíos del ciclo de diferenciación del condrocito y que estos cambios ocurrieron con una secuencia temporal que varió dependiendo del ritmo de crecimiento del animal. Además, se observó que la expresión de estas proteínas de la matriz por un condrocito de la placa de crecimiento del animal. Además, se observó que la expresión de estas proteínas de la matriz por un condrocito de la placa de crecimiento fue acelerada o disminuida dependiendo del ritmo de crecimiento. A diferencia de los resultados que hemos descritos sobre la expresión de los colágenos tipo II y X, se observó que la expresión de la colagenasa-3 constituye un suceso constante en la serie de cambios en la expresión génica que tienen lugar durante el programa de diferenciación de los condrocitos. Se observó una íntima relación entre los cambios morfológicos y cinéticos asociados con la hipertrofia de los condrocitos y los cambios en los patrones de expresión de los colágenos de la matriz y de la colagenasa-3. El presente trabajo prueba que la dinámica de síntesis y degradación de la matriz del cartílago de la placa de crecimiento varió dependiendo del ritmo de crecimiento y este resultado apoya la hipótesis que considera a los cambios en la síntesis y degradación de la matriz del cartílago de la placa de crecimiento varió dependiendo del ritmo del crecimiento y este resultado apoya la hipotesis que considera a los cambios en la síntesis y degradación de la matriz como un proceso crítico en la secuencia de sucesos regulados de forma precisa que conducen a la diferenciación del condrocito.

Autor: BLASCO CABAL JOSE LUIS.
Año: 1999.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGIA.

Resumen: La técnica DDRT-PCR ha permitido aislar dos fragmentos de ADNc que muestran expresión diferencial en Phycomyces blakesleeamus en respuesta a la luz. Estos fragmentos no muestran homología significativa con ninguna secuencia de las bases de datos. Se han aislado también mediante esta técnica cuatro fragmentos de ADNc que muestran patrones de expresión diferentes en las formas de crecimiento de levadura, transición y micelio de Mucor circinellides. El fragmento ddT67 hibrida con un transcrito presente en la fase de transición de levadura a hifa y ausente en la fase miceliar, y posee una alta semejanza con genes codificantes de ornitina descarboxilasas (ODCs). Se han aislado y secuenciado el ADNc y la copia genómica del gen ocdA de M. Circinelloides. La proteína deducida de la fase de lectura abierta muestra una gran semejanza con otras ODCs. Se ha puesto a punto el método de análisis de extensión del cebador automático no radiactivo. Se han determinado mediante este método cuatro sitios de inicio de la transcripción en el gen odcA. El gen odcA se expresa diferencialmente durante la transición de levadura a hifa. La máxima acumulación del transcrito se produce a los 120 min de crecimiento aerobio. Este transcrito es indetectable a las 30 h de crecimiento miceliar en la estirpe CBS227.49. Este patrón de expresión difiere del observado en otros hongos dimórficos, en los que los niveles del mensajero no cambian druante la transición. La actividad ODCásica es superior en la fase de transición que en la de levadura o micelio, lo que se correlaciona con el aumento del nivel de transcrito durante la transición. La regulación transcripcional observada durante la transición,junto con la ausencia de regiones PEST en esta proteína, y la localización celular propuesta, podrían reflejar un mecanismo diferente de regulación de los niveles de ODC en este organismo,en comparación a otros hongos.

Autor: GARCÍA SÁNCHEZ M. ISABEL.
Año: 1999.
Universidad: SEVILLA.
Centro de lectura: QUÍMICA.
Centro de realización: CENTRO DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS (CARTUJA).

Resumen: En esta tesis, se ha caracterizado la interacción funcional entre la ferredoxina (Fd) y la enzimas NiR y GOGAT del alga eucariota Chalnydomonas reinhardtii, mostrando la formación de un complejo Fd;NiR de estequiometría 1:1 y de dos complejos Fd:GOGAT con este quiometría 1:1 y 2:1.Los datos obtenidos implican la existencia de un único sitio de unión a Fd en Nir mientras que GOGAT posee dos sitios de interacción a la proteína. Ademñás se ha observado que el proceso de itneracción entre Fd y GOGAT se ve favorecido en células crecidas en amonio o sometidas a carencia de nitrógeno correlacionándose conla mayor actividad de la enxima observda en cultivos bajo estas condiciones nutricionales. Se ha obtenido también, una estructura teórica de la ferredoxina de C. Reinhardtii, en la que se meustra que está formada por un cuerpo central compuesto por 5 hojas plegadas b y una hélice a. La existencia además, de dos hojas plgadas b cortas, una hélice a2, así como una vuelta hlicoidal corta (a3), en el extremo carboxi-terminal de la proteína, la hace asemejarse más da la Fd de hoa de espinaca que a la proteína de organismos procariotas. A su vez hemos trabajado con una serie de mutantes situados en las hélices a1 y a3 para determinar regiones específicas implicdas en el mecanismo de interacción con las enximas. La combinación del cálculo de potenciales superficiales sobre el modelo de estructura, así como medidas de actividad enzmática, potenciales redox y estudios de itneracción de muestran la implicación de los glutámicos 91 y 92 y de la región que comprende a los aminoácidos aspárico 25 y glutámicos 28 y 29 en la unión a las enzimas. En el desarrollo de esta tesis también se ha llevado a cabo la clonación de un cDNA parcial (CrFG-3) que codifica Fd-GOGAT de C. Reinhardtii y que se encuentra como una única copia en del genoma. CrFG-3 presenta una fse de lectura abierta de 847 aminoácidos. La comparción de secuencias conotras GOGATs. Muestra la alta homología entre CrGF-3 y las secuencias dependientes de Fd. Presentando mayor identidad con las proteínas de plantas. Con el fin de encontrar secuencias comunes en aquellas enximas dependientes de Fd que pudieran estar implicadas en la interacción con la Fd, se llevaron a cabo comparaciones de secuencias entre ellas. Sólo una región que comprende los aminoácidos 10-345 de CrFG-3 se meustra como posible zona involucrada en la unión a Fd y por tanto diana para la obtención de mutantes dirigidos.

Autor: JIMENEZ GORDILLO M. DOLORES.
Año: 1999.
Universidad: SEVILLA.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: En esta memoria se ha valorado el efecto protector del aminoacido L-arginina, dosis equimolares con ibuprofeno(0.6/0.6 mm/kg) en un modelo de ulcerogénesis gástrica provocada por la administración del AINE y tras 6 h de tratamiento. La valoración microscópica confirma los resultados macroscópicos. Las determinaciones bioquímicas corroboran el potente efecto antilipoperoxidante de L-arginina al reducir los niveles de malonildialdehído. La actividad xantin oxidada por ibuprofeno resultó ser significativamente más elevada que los referentes al control sano. L-arginina no modifica los niveles de antioxidantes endógenos como son el glutation total ni la actividad de la enzima glutation peroxidasa y superóxido dismutasa. En mucosas sometidas al tratamiento de ibuprofeno observamos un incremento de la actividad óxido nítrico sintetasa inducible que fue revertido tras la administración del aminoácido. Los niveles de GMPc aumentaron significativamente con la asociación ibuprofeno/L-arginia a partir de los 90 min y siendo máximos a las 6 h. La medida realizada de los niveles de prostaglandina E2 nos indica la capacidad de L-arginina en promover un incremento del eicosanoide. Este estudio fue completado con ensayos de PCR-RT para las enzimas óxido nitrico sintetasas y Wester-Blooting para la expresión de las proteínas COX/COX-2.

Autor: VAZQUEZ BERMUDEZ M. FELIX .
Año: 1999.
Universidad: SEVILLA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: INSTITUTO DE BIOQUIMICA VEGETAL Y FOTOSINTESIS (CSIC-US).

Resumen: Las cianobacterias utilizan preferentemente compuestos de nitrógeno inorgánico para su crecimiento, siendo el amonio la fuente de nitrógeno preferida, que ejerce una represión de la expresión de genes implicados en la asimilación de fuentes de nitrógeno alternativas. NtcA es el activador transcripcional de genes sometidos a control por nitrógeno en las cianobacterias. Se ha colonado y secuenciado el gen responsable de la actividad de transporte de amonio/metilamonio de Synechococcus sp.PCC 7942. El gen amt1 es un gen regulado directamente por NtcA y su expresión depende de las condiciones nutricionales de carbono y nitrógeno. La permeasa Amt1 se requiere para el crecimiento a expensas de amonio a concentraciones micromolares y en la recuperación del amonio que se pierde del interior celular dada la gran permeabilidad de las membranas biológicas al amoniaco. Para profundizar en el mecanismo de actuación de NtcA se ha medido la afinidad que muestra este proteína por los distintos promotores regulados por nitrógeno, deduciéndose que la secuencia de los promotores influye en dicha afinidad, asi como por versiones alteradas de los mismos, lo que ha subrayado la importancia de las secuencias GTA y TAC, que son los tripletes más conservados, así como la influencia de las secuencias flanqueantes del sitio de unión de Ntca en el DNA. El estudio de la posible modulación de NtcA ha sugerido que dicho regulador transcripcional podría ser una proteína alostérica cuya actividad se viese regulada por los niveles intracelulares de 2-oxoglutarato,un posible indicador de la relación C/N celular. La caracterización de la mutación Ser 126 Phe de NtcA ha indicado que dicha mutación no afecta a su capacidad de unión al DNA, si bien la proteína con dicho cambio puntual es defectuosa en la activación de la transcripción.

Autor: MONTERO BALAGUER MERCEDES.
Año: 1999.
Universidad: VALENCIA .
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: El rastreo de una genoteca de expresión de C.albicans crecida en condiciones de miceliación,han permitido la identificación de un gen que codifica una proteína de la maquinaria traduccional. Este gen, que ha sido dominado CaYST, presenta una pauta abierta de lectura de 783 nucleótidos que codifica una proteína, de 261 aminoácidos. El gen CaYST se encuentra en una sola copia en el genoma de C. Albicans, pero se detectan dos transcritos de diferente tamaño. La expresión del mismo es mayor en condiciones de miceliación. Además la expresión del gen CaYST aumenta cuando se emplea prolina, una fuente de nitrógeno dificilmente asimilable. La proteína es localizada en citosol, ribosomas y membranas, presentando una movilidad en gel SDS-PAGE de 37 kDa. La secuencia aminoacídica presenta una elevada homología con numerosas proteínas ribosomales, entre las que se encuentran Yst1p e Yst2p de S. Cerevisiae,con un 70% de identidad. Tiene además homología con proteínas receptoras de laminina. Los estudios de complementación realizados en cepas de S. Cerevisiae mutantes en los genes YST demuestran que CaYstp tiene una función similar a la de sus homológos. Además la sobreexpresión de CaYST en S. Cerevisiae y en C. Albicans produce un incremento en la filamentación de las cepas en condiciones de ayuno de nitrógeno, mientras que la interrupción de un alelo del gen CaYST produce un defecto en la filamentación en las mismas condiciones. Este resultado, indica que dicho gen puede estar implicado en el cambio de morfologia.

Autor: GONZALEZ DOMINGUEZ MONICA.
Año: 1999.
Universidad: A CORUÑA .
Centro de lectura: CIENCIAS.

Resumen: En este trabajo se ha caracterizado el gen HEM1 de K. lactis (KlHEM1), que codifica el primer enzima de la ruta de biosíntesis de hemo en esta levadura: la 5-aminolevulinato sintasa. La transcripción de KlHEM1 se reduce en presencia de oxígeno y hemo. La disrupción de KlHEM1 determina la pérdida de la capacidad respiratoria en el mutante, descartándose la existencia de una segunda ALAS en K. lactis, duplicidad muy común en otros eucariotas. El análisis transcripcional de genes de K. lactis relacionados con el metabolismo oxidativo revela que la respuesta a oxígeno puede ser mediada por hemo. Por tanto, en K. lactis, hemo intervendría como efector de la señal de oxígeno en mecanismos de control transcripcional, al igual que sucede en S. cerevisiae. En K. lactis hemo no sólo actía sobre la expresión génica a nivel de la transcripción, sino que también tiene un efecto regulador en etapas posteriores: hemo inhibe el importe mitocondrial de la 5-aminolevulinato sintasa. Así pues, en K. lactis, hemo ejerce un doble control "feed-back" sobre la primera etapa de su biosíntesis, actuando tanto sobre la transcripción como postranscripcionalmente.

Autor: GARCIA SAHUQUILLO ALMUDENA .
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.

Resumen: En esta Tesis Doctoral se resumen los datos originales obtenidos sobre el papel que juega la región transmembrana de la cadena beta del receptor de la célula T (TCR/CD3) en el ensamblaje con el resto del complejo y e la transmisión de señales. Mediante mutagénesis dirigida y transfección estable en células deficientes de cadena beta, se han obtenido líneas celulares reconstituídas en la expresión de su complejo TCR/CD3, tanto en su versión wild-type como mutante. Utilizando este modelo, se demuestra que los transfectantes que incluyen la mutación Y/L en la tirosina C-terminal del motivo presentan un defecto en el ensamblaje con la cadena zeta, lo que no influye funcionalmente en la secreción de IL-2, expresión de marcadores de activación, movilización del calcio, fosforilación total de proteínas e internalización del receptor. Se observa, sin embargo, que la señalización en las células mutantes no se traduce en la pérdida de viabilidad que es esperable tras la adecuada estimulación del complejo. Medidas de degradación del DNA junto con estudios a nivel de RNA mensajero demuestran que la escasa inducibilidad de Fase-L es el mecanismo básico que subyace en la resistencia de las células mutantes a la apoptosis. Ademas se muestra que las dos formas fosforiladas de zeta son inmunoprecipitadas y que la cantidad de ZAP70 asociada a zeta en esas células es insignificante. Ello a pesar de que ZAP70 es fosforilada normalmente y muestra una actividad kinasa semejante a la observada en inmunoprecipitados de células wild-type. En este contexto se demuestra que mientras que ZAP70 se recluta a un espacio proximal a la membrana en células wild-type estimuladas, se mantiene uniformemente distribuida en el citosol de las células mutantes activadas. Se puede concluir que el sistema experimental utilizado ha permitido corroborar que la activación de la célula T no es un fenómeno binario regulado bajo un proceso todo/nada, sino que las distintas funciones efectoras pueden estar desacopladas unas de otras. En este caso particular se revelan algunas pistas sobre cómo la proliferación y la apoptosis son reguladas de forma diferencial.

Autor: GONZALEZ LOPEZ SUSANA .
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.

Resumen: Esta Tesis se ha centrado durante estos cuatro años en el estudio de las regiones funcionales de la subunidad PB1 de la polimerasa del virus de la gripe, regiones implicadas en la interacción con las otras subunidades de la polimerasa viral y con los diferentes moldes de RNA virales, vRNA y cRNA. Las regiones de interacción de la subunidad PB1 de la RNA polimerasa del virus de la gripe con las subunidades PB2 y PA, han sido identificados por análisis mutacional de la proteína PB1. La región aminoterminal de la proteína PB1, definida entre las posiciones 1 y 78, es responsable de la interacción con la subunidad PA, mientras que la región próxima al carboxilo-terminal, definida entre las posiciones 506 y 659, interacciona con la subunidad PB2. La proteína PB1 interacciona directa y específicamente con ambos moldes virales, vRNA y cRNA. Las constantes de disociación para estas interacciones se han estimado en el rango de 10-8 M. La proteína PB1 es capaz de interaccionar preferentemente con el extremo 5'v del panhandle de vRNA y la unión es máxima cuando se utilizan a la vez ambos extremos, como análogo de panhandle. Sin embargo, los extremos 5' y 3' del panhandle de cRNA son reconocidos con una eficiencia similar. Los sitios de unión a RMA de PB1 están consituídos por residuos localizados en el amino-terminal, probablemente comunes para unir a vRNA y cRNA y, o bien residuos de la región central de PB1 para unir a cRNA o residuos del extremo C terminal, para unir a vRNA.

Autor: RUIZ DE MENA INMACULADA.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.

Resumen: La caracterización de genes nucleares que codifican proteínas mitocondriales es fundamental para comprender los mecanismos moleculares implivados en la comunicación entre el núcleo y la mitocondria, un proceso central en la biogénesis mitocondrial y la fisiología celular. En la presente Tesis Doctoral hemos determinado la estructura, y estudiado los mecanismos implicados en la regulación transcripcional de dos genes que codifican proteínas claves en la funcionalidad de la mitocondria, la enzima aminolevulinato sintetasa (ALAS) que regula el paso limitante en la biosíntesis del grupo hemo, y la proteína de unión a DNA de cadena sencilla (mtSSB), que interviene en la replicación del DNA mitocondrial.