BIOQUIMICA MOLECULAR, 35

Autor: RODRIGUEZ SANCHEZ PALOMA.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.

Resumen: Neurogranina (Nrg) presenta un patrón de desarrollo telencefálico que, en ratas, se inicia a los 18 días de vida embrionaria en Amígdala y Corteza Piriforme y alcanza sus máximos en Corteza cerebral, Hipocampo y Cuerpo Estriado. Durante la primera semana de vida postnatal, la distribución de Nrg responde a un gradiente rostro-caudal y lateral mientras que, durante la segunda semana, Nrg se extiende de forma difusa por el neuropilo. Nrg se localiza en el compartimento somatodendrítico formando pequeños acúmulos dispersos por el citoplasma y asociados a la cara citosólica de membranas celulares. A partir de la segunda semana de vida postnatal, Nrg aparece también en el núcleo de algunas neuronas. La expresión de Nrg se encuentra muy reducida en sistema experimentales "in vitro", como líneas celulares, cultivos primarios o cultivos organotípicos. Nrg es una fosfoproteína cuya fosforilación se incrementa tras la activación de receptores de Glutamato, siendo máxima la estimulación de la fosforilación activando receptores AMP/KA , intermedia con agonistas de receptores NMDA y mínima con agonistas de receptores metabotrópicos. La expresión heteróloga de Nrg en células PC12 genera: desaceleración de la proliferación celular, aplanamiento y aumento del perímetro celular, desarrollo de lamelipodios y neuritas cortas, aparición de células multinucleadas, aumento de la endocitosis en fase fluida, cambios en los niveles de algunas proteínas (calmodulina, MAP1B, tubulina beta III y alfa acetilada) y modificación de la respuesta a NGF. Nrg interacciona con membrana a través del dominio IQ. Esta interacción podría ser incompatible con la fosforilación por PKC o por unión previa con calmodulina.

Autor: CERVANTES MARTINEZ MARIA.
Año: 1999.
Universidad: MURCIA.
Centro de lectura: BIOLOGIA .

Resumen: En este trabajo se han estudiado las funciones de varios genes del super-operón carB-carA de Myxococcus xanthus, implicado en la síntesis de carotenoides. Se ha encontrado que el producto del gen orf2 del operón carBestablece con Crtl una novedosa colaboración para la deshidrogenación de fitoeno, siendo responsable de su isomerización y de, al menos, la primera de sus deshidrogenaciones a fitoflueno. Se trata del primer caso de bacteria no fotosintética que convierte al cis-fitoeno en trans-licopeno con el concurso de dos enzimas diferentes. Se ha encontrado también que los productos de orf7 y orf8 del operón carA son necesarios y suficientes para la ciclación de licopeno. Estos productos muestran similitudes con el segmento con actividad ciclasa de licpeno de unas proteínas bifuncionales ciclasa de licopeno-sintetasa de fitoeno descritas en algunos hongos. En este caso, son necesarios dos productos génicos distintos para realizar la función que lleva a cabo un fragmento de una sola proteína en dichos hongos. En cuanto a funciones reguladoras, se ha demostrado la función del Orf10 del operón carA regulador negativo de la expresión de carB en la oscuridad, y su aparente no implicación en la regulación de otros genes car. Así mismo, se ha descartado a priori la participación de Orf11 en la regulación de carB y de otros promotores car. Tanto Orf10 como Orf11 poseen un dominio de unión a DNA tipo HTH. Se ha demostrado la capacidad de unión de ambas proteínas al DNA del promotor de carB, detectándose la posible formación de varias asociaciones moleculares de Ord10 y Orf11 en dicha unión. Por otro lado, se ha encontrado en estas mismas proteínas un dominio de unión a vitamina B12, típico de las enzimas que utilizan metilcobalamina como cofactor. Son las primeras proteínas descritas que presentan un motivo de unión a DNA y a vitamina B12. Tras el estudio de la posible influencia de la vitamina B12 en el proceso de la carotenogénesis, se ha constatado la existencia de un claro efecto de super-activación de la misma por dicho compuesto. Este efecto positivo es reflejo del aumento en la respuesta a la luz que presentan al menos los promotores de carB y de carQRS en presencia de un suplemento de vitamina B12. Finalmente, se ha demostrado que el promotor de carQRS no es absolutamente dependiente de cobalamina para su activación en respuesta a la luz, aunque dicha activación se ve claramente multiplicada si en el medio hay vitamina B12, descartándose un efecto nutricional de la misma en este fenómeno. El promotor de carB, sin embargo, sí presenta una dependencia absoluta de la presencia de vitamina B12 en el medio para su activación en respuesta a la luz. Se apuntan además otras posibles relaciones entre la vitamina B12 y otras proteínas reguladoras de la carotenogénsis.

Autor: GOMEZ OLIVARES JOSE LUIS.
Año: 1999.
Universidad: MURCIA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.

Resumen: Las colinesterasas (ChEs) son enzimas que hidrolizan ésteres de colina. Existen dos tiposde ChEs: acetilcolinesterasa (AChE 3.1.1.7. E.C.) y butirilcolinesterasa (BuChE 3.1.1.8.E.C.). En los músculos estriado y cardíaco, la membrana del sarcolema matiene su integridad debido a una red protectora constituida por dímeros de distrofina, glicoproteínas asociadas y proteínas de la lámina basal. La deficiencia de alguna de esas proteínas produce alteraciones funcionales del receptor nicotínico y de la actividad de la AChE. Los ratones de la estirpe Lama2dy homocigóticos, no expresan la cadena alfa-2 (merosina) de la laminina, sintetizan niveles normales de distrofina, y presentan fenotipo distrófico. La patología queda reflejada por la fibrosis y necrosis de las fibras musculares, unas características histopatológicas semejantes a las de los pacientes con distrofias musculares. El objetivo principal de este estudio fue conocer si la condición distrófica afecta a la síntesis o estructura de las colinesterasas de varios tejidos de ratón. Se eligieron corazón, eritrocito e hígado, ya que aunque el corazón e hígado expresan laminina. Además, se han observado cardiopatías graves en enfermos distróficos, atribuibles a la deficiencia de laminina, lo que lo ocasiona la desorganización del eje distrofina-laminina-lámina basal. En eritrocito de pacientes distróficos cambia la actividad AChE. En hígado de animales distróficos se aprencian cambios ultraestructurales y modificaciones en la funcionalidad de determinadas proteínas. En corazón de ratón, la actividad BuChE fue 2,5 veces mayor que la AChE. La actividad AChE se debe a componentes moleculares asimétricos y globulares ligeros, antifílicos e hidrofílicos. A la actividad BuChE contribuyeron principalmente dímeros y monómeros anfifílicos. La unión a soportes hidrofóbicos demostró las propiedades anfifílicas de ambas enzimas. Las formas ligeras de AChE poseen un dominio hidrofóbico de glicosilfosfatidilinositol (GFI), y la conversión limitada por la fosfolipasa-C (FLC-FI) demostró una variación en el dominio GFI. Los resultados demuestran que los componentes de AChE y BuChE proceden del corazón y node infiltraciones de componentes plasmáticos. Pese a la falta de merosina, no hubo cambios en la síntesis o ensamblado de las formas moleculares de AChE en el corazón. Los dímeros de eritrocito se convirtieron en monómeros por reducción y alquilación de los grupos tioles. La unión de las ChEs eritrocitarias con lectinas inmovilizadas demostró que las subunidades de AChE están glicosiladas de manera distinta, unos monómeros se ligan a las lectinas WGA y RCA, y otros no. Los dímeros anfifílicos convertidos en hidrofílicos (por exposición a la FLC-FI), se purificaron por cromatografía de afinidad en una matriz de edrofino-Sepharose. El rendimiento fue menor de lo esperado, por la limitada conversión de las formas anfifílicas en hidrofílicas (40%). En hígado de ratón, la relación BuChE/AChE fue 150. Se identificaron dímeros y monómeros anfifílicosde las ChEs en los extractos hepáticos. La deficiencia en merosina no alteró los patrones de formas moleculares de ambas ChEs hepáticas. Parte de las formas ligeras anfifílicas de AChE se convirtieron en hidrofílicas por exposición a la FLC-FI; por tanto, deben tener un dominio GFI. Es posible que el hígado produzca dos clases de dímeros de AChE, unos con subunidades H (sensibles a FLC-FI) y otros con subunidades T (resistentes). En hígado distrófico, los dímeros y monómeros de AChE fueron más resistentes a la fosfolipasa-C, y se fijaron en mayor medida a la lectina LCA, que las isoformas de tejido normal. Los resultados indican que la distrofia afecta a la función hepática, provocando alteraciones en el procesamiento del GFI y glicosilación de las formas ligeras de AChE. La semejanza en distintas propiedades estructurales de los dímeros y monómeros de BuChE en hígado, corazón, cerebro y plasma de ratón sugieren que las subunidades están plegadas de formas parecida y que, posiblemente, los tetrámeros, dímeros y monómeros del plasma se general en el hígado.

Autor: GONZALEZ BLASCO GRACIA.
Año: 1999.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: UNIVERSITAT DE VALENCIA.

Resumen: Una importante utilidad de las técnicas de ingenieria de proteínas es la obtención de nuevos tipos de enzimas especialmente diseñados con vistas a su aplicación industrial. En una proteína, la contribución de residuos aminoacídicos individuales a su estabilidad y funcionalidad es un problema todavía sin resolver, sin embargo, la disponibilidad de genes clonados permite modificar las características de los enzimas codificadas por ellos, mediante técnicas de mutagénesis aleatoria y dirigida. En este trabajo de esta tesis doctoral se han modificado las propiedades de una Beta-glucosidasa codificadapor el gen bg1A de Paenibacillus plymyxa. Se ha puesto a punto dos métodos de -mutagénesis aleatoria para la modificación de las propiedades de Bg1A basados en la técnica de PCR. Mediante mutagénesis aleatoria se han aislado y caracterizado seis mutaciones distintas que aumentan la resistencia térmica de Bg1A. La combinación de las distintas mutaciones en una misma molécula nos ha permitido obtener un mutante múltiple de Bg1A con una vida media de tres minutos a 70 grados centígrados, que puede calificarse como enzima termorresistente. Una de las mutaciones, T385A además, produce un aumento de aproximadamente 20 veces la producción de enzima Bg1A por Escherichia coli.

Autor: NAVARRO BOHIGUES IGNACIO.
Año: 1999.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAT DE CIENCIAS BIOLOGICAS-UNIVERSITAT DE VALENCIA.

Resumen: En la presente tesis se han realizado una serie de trabajos encaminados a profundizar en el estudio de algunos aspectos funcionales del ASBVd, la especie tipo de la familia de viroides con ribozimas de cabeza de martillo. Más concretamente: 1. Se ha identificado el cloroplasto como el orgánulo donde tiene lugar la replicación de este viroide mediante la localización de sus cadenas de polaridad complementaria, y se han caracterizado molecularmente los intermediarios replicativos del mismo. 2. Para discriminar cual de las dos RNA polimerasas del cloroplasto( de tipo NEP de "nuclear endoded polymerase o de tipo PEP de "plastid encoded plymerase") está implicada en la replicación del ASBVd, se han ensayado la capacidad de una preparación de cloroplastos purificados para sintetizar RNAs especificos del ASBVd, así como de cuatro genes representativos de las tres clases en las cuales sehan dividido los genes del cloroplasto según la estructura de sus promotores(psbA, 16SrDNA, accD y rpoB). Sin embargo, mientras que la transcripción de los cuatro genes cloroplásticos fue suprimidad a concentraciones muy bajas de tagetitoxina(5-10 uM), no se observó ningún efecto sobre la síntesis de los RNAs viroidales. Estos resultados sugieren que la RNA polimerasa de tipo NEP que es insensible a la tagetitoxina y no la de tipo PEP que es sensible al inhibidor mencionado, es muy probablemente la actividad implicada en la replicación del ASBVd, aunque no puede ser excluida la participación de otra RNA polimerasa del cloroplasto resistente a la tagetitoxina aún no caracterizada. 3. Por último , se ha identificado el inicio de la síntesis de los RNAs del ASBVd. Dichos sitios se encuentran en regiones ricas en A+Ul situadas en el bucle terminal derecho de las moléculas circulares de ambas polaridades de este vioride. Las sencuencias situadas alrededor de los mismos son similares en ambos casos, por lo que es probable que sean reconocidas por el mismo factor(es) específico que recluta la RNA polimerasa. Por otro lado, dichas regiones presentan ciertas similitudes con los promotores reconocidos por la RNA polimerasa clocorplástico de tipo NEP.

Autor: HERNÁNDEZ GARRIDO MARITA.
Año: 1999.
Universidad: VALLADOLID.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: En esta memoria se han analizado las características de la señalización puesta en marcha en células de astrocitoma humano 1321N1 por dos agonistas involucrados en procesos inflamatorios: sPLA2 y TNF-a. Ambos median sus respuestas por interaccióncon estructuras de membrna e inducen la liberación de AA como consecuencia de la activación de la cPLA2. La translocación de esta enzima a la membrna puede ser mediada por calcio, en el caso de la sPLA2, puesto que se asocia a un aumento rápido y transitorio de la concentraciónde calcio citosólico, mientras que en el casod el TNF-a deben existir mecanismos alternativos. Ambos estímulos activan la cascada de las MAPK-a deben existir mecanismos alternativos. Ambos estímulos activan la cascada de las MAPK, pero presentan diferencias determinantes, en cuanto a los miembros de la familia reclutados y al perfil temporal de activación, lo que explicaría las diferentes respeustas observadas: proliferación mitótica, en el casod e la sPLA2, y apoptosis en el casod el TNF-a. También existen diferencias en cuanto a la capacidad de inducir cambios fenotípicos, ya que el TNF-a induce la expresión de COX-2 y la producción de prostaglandinas, dependiente de la activación del factor d etranscripción NFrB, lo que no se observa en respuesta a la estimulación con sPLA2. Estos datos permiten definir distintos tipos de respuesta funcional en células de astrocitoma dependientes del tipo de agonista.

Autor: PLAZA MARIÑA JOAQUIN.
Año: 1999.
Universidad: VALLADOLID.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: ESCUELA DE FISIOTERAPIA DE SORIA.

Resumen: En la actualidad no existe ninguna duda acerca de la influencia que la "anemia del deportista" tiene sobre el rendimiento físico, sobre todo cuando se realizan deportes de competición. Los deportistas son tendentes al descenso de hierro, fundamentalmente por un incremento en sus pérdidas. Si a ello añadimos que la toma dietética de Fe suele ser marginal, que la práctica de ciertos deportes, como la pelota, producen hemólisis añadida, y que el estrés del ejercicio compromete su absorción, podría pronosticarse la apariciónd e una anemia ferropénica, con efectos adversos sobre el rendimiento físico. Entre los mecanismos causantes de la hemólisis en los deportistas, destacríamos: A- El trauma mecánico sufrido por los hematíes durante el golpeo de la pelota. B- El aumento de la temperatura corporal. C- La acidosis del ejercicio. D- Los cambios sen la osmolaridad plasmática y eritrocitaria con el esfuerzo. E- Las microturbulencias en el flujo sanguíneo de los pequeños vasos de lso músculos en actividad. F- La compresión de los hematíes por la activación de grandes masas musculares. Teniendo en cuenta lo expuesto, pensamos que el pelotari es una atleta conriesgo de padecer la anemia del deportista, ya que las peculiaridades del juego de la pelota a mano conducen a un golpeo continuo de la pelota (microtraumatismo) que ocasionan hemólisis, a pesar de las protecciones (tacos) que se utilizan. Además, este ge sto se realiza más de 250 veces a lo largo de cada partido, que hay que sumar a los que ejecuta diariamente durante los entrenamientos, calentamientos y preparacióndiaria de la mano. Por todo esto, en el pelotari se puede producir a una situación de déficit marginal de Fe que tendría un efecto directo sobre el rendiiento deportivo y, a largo plazo padecer anemia. Así, y dado que en la literatura existen suficientes datos acerca de los mecanismo de producción de la anemia del deportista en diferentes especialidades deportivas, nos propusimos la realización de esta Tesis Doctoral. De los resultados obtenidos destacamos que en los pelotaris ocurre unincremento significativo de los niveles séricos de Fe psotesfuerzo, posiblemente debidos por una parte a la hemoconcentración, y por otra a los cambios en la capacidad total de fijación de hierro que puede ocurrir después del ejercicio prolongado. También observamos, que los niveles de ferrtina fueron superiores, en reposo y postesfuerzo, respecto los controles, sin embargo, estas diferencias no eransignficativas en ningún caso. Esto es posiblemente debido a un incremento de la síntesis y liberación de ferritina desde las células reiculoendoteliales y células parenquimatosas del hígado (depóstios de reserva de hierro) puesto que, algunos de los efectos del ejercicio prolongado son el hipercatabolismo eritrocitario y una reacción pseudoinflamatoria, producidos por la hemólisis intravascular y el consiguiente aumento del turnover eritrocitario. Por su parte, las cifras medidas de la concentración de hemoglobina y hematíes no presentaban grandes diferencias entre los pelotaris-reposo y el grupocontrol, y entre los pelotaris-postpartido y el grupo control. Con respecto a los posibles fenómenos de hemolisis provocados por el golpeo de la pelota, los resultados que ofrecen las variables bioquímicas determinadas en la orina (bilirrubina, heamtíes y proteínas, entre otras) hacen pensar que efectivamente se producen, aunque no alcanzan una entidad suficiente pues no parece hemoglobinuria. Además, en la visión macroscópica del suero, también se observa cierto grado de hamturia, que sin embargo, y según informe del laboratorio, no afecta a las variables bioquímicas analizadas. Pensamos que, a pesar de los signos externos y la violencia del impacto de la pelota sean importantes, las protecciones utilizdas en las manos (tacos) junto a un proceso de calentameinto adecuado y la técnica bien realizada, minimizan los efectos tramáticos del golpeo de la pelota sobre las manos y por tanto su repercusión sobre los hematíes. Pero estas observaciones, no deben inducir a despreciar una vigilancia constante de estos fenómenos para detectar cualquier problema que a lo largo plazo puediera afectar el rendimiento del pelotari. No obstante y a pesar de lso resultados obtenidos en este grupo reducido de pelotaris profesionales jóvenes, nos atrevemos a decir que en el juego de la pelota a mano existe riesgo de destrucción hemática que se suma al efecto del ejercicio sobre la absorción intestinal de nutrientes, por lo que estimamos que la suplementación dietética y/o farmacológica puede estar justificada en periodos de gran exigencia física originada por las competiciones.

Autor: BILBAO CATALA JOSE RAMON.
Año: 1999.
Universidad: PAIS VASCO.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: HOSPITAL DE CRUCES.

Resumen: La diabetes tipo 1 es una enfermedad autoinmune caracterizada por la destruccion autoinmune de la celula B pancreática y en las fases iniciales se detectan autoanticuerpos circulantes contra diferentes moléculas pancreáticas, que puden ser utilizados en el diagnóstico precoz. Se pusieron a punto técnicas de detección autoanticuerpos anti-islote(ICA) por inmunofluorescencia y radioensayos de inmunoprecipitación de insulina(IAA) y otros antígenos producidos in vitro(GAD,IA2 y CPH) y se ha valorado su sensibilidad y especificidad en pacientes con diabetes tipo 1 al inicio y personas de la población en general, incluyendo sangre de cordón de recién nacidos. Los ICA y los anticuerpos anti-CPH son de limitada en el despistaje de diabetes por su baja especificidad y sensibilidad, respectivamente, Los anticuerpos IAA,IA2A y GADA presentan una sensibilidad del 77%,61% y 50%,respectivamente, con una especificidad>99%. IAA e IA2A se correlacionan de forma negativa con la edad de diagnóstico, reduciéndose su prevalencia en diabéticos >20 años. Los IAA son los anticuerpos más frecuentes en niños diabéticos < 5 años. En >90% de los recién nacidos normales, se detecta una actividad anti-insulina no debida a IgG. Los GADA son más frecuentes en mujeres diabéticas, sobre todo en aquellos entre 11 y 20 años de edad. Los tres ensayos en conjunto identifican el 90% de los diabéticos al inicio y entre las combinaciones de dos ensayos, la sensibilidad de GADA/IAA es 87,5%, la GADA/IA2A 86% y la IAA/IA2A 78%. Esta última no es adecuada a partir de los 20 años. GADA/IAA es una mejor elección, sobre todo en niños pequeños.

Autor: NADAL CLANCHET EULALIA DE.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: VETERINARIA .
Centro de realización: FACULTAD CIENCIAS.UAB.

Resumen: Los componentes de la respuesta al estrés celular pueden ser identificados correlacionando los cambios en la tolernacia al estrés con la perdida o la sobrexpresión de genes definidos. Estos genes pueden estudiarse en S.cerevisiae, un organismo eucariota donde la manipulación genetica y el posterior estudio biológico se pueden llevare a cabo de manera mucho más eficaz que en organismos más complejos. Se ha demostrado que tanto el gen PPZI como el HAL3 intervienen de manera opuesta, en el fenomeno de la homeostasis salina. Ambos genes modulan con una extensión similar,tanto los niveles basales como los inducidos por sal, al gen ENA1 y,consecuentemente no parecen estar involucrados en la via de transmisión de señal de estrés salino. Además,tanto la sobreexpresión de la proteina Hal3 como la delección del gen PPZI suprimen la sensibilidad a sal que provoca la interrupción de la calcineurina, sugiriendo que ambos genes actúan de una manera independiente a la PP2B. Las similitudes existentes entre la proteína Hal3 y la fosfatasa Ppz1 nos llevaron a investigar la posible relación funcional quen podrían tener ambas proteinas reguladoras. En esta memoria presentamos datos bioquímicos y geneticos que demuestran que la proteina Hal3 es una subunidad inhibidora de la fosfatasa Ppz1 en diversas funciones celulares, como la homeostasis salina y el mantenimiento de la integridad celular. Se ha descrito que la mutación de las subunidades reguladoras de la caseína quinasa 2 resulta en un fenotipo de sensibilidad a sal, pero no es conocido qué tipo de proceso celular, relevante en la tolerancia salina, involucra a esta quinasa. Como consecuencia del interes de nuestro laboratorio en estudiar la función de la fosforilación de proteinas en la regulación de la tolerancia a sal en S.cerevisiae hemos realizado un estudio genético y bioquimico de los efectos de la ausencia de la subunidad reguladora Ckb1 en los diferentes procesos celulares que afectan la sensibilidad de Na+ y Li+. En este estudio mostramos que la función de la caseína quinasa 2 en la tolerancia salina es independiente de la salida de sodio que involucra la Na+-ATPasa ENA1, y del sistema TRK, principal responsable de la entrada de cationes a la celula. También demostramos que esta quinasa no interviene en el proceso de la salida de protones ni en la homoestasis salina vacuolar. Así, pues, se define un escenario donde la delección del gen CKB1 resulta en un hipersensibilidad a sodio, en ausencia de un incremento intracelular del contenido de este ion, situación compatible, con la posibilidad de que la falta de Ckb1 afectara algun componente de la maquinaria celular que fuera una diana para la toxicidad a sal.

Autor: FUENTES NAVARRO ANGELA M..
Año: 1999.
Universidad: PAIS VASCO.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA Y ODONTOLOGIA(UPV/EHU) .

Resumen: La potencialidad de formar metástasis depende de la adquisición de ciertas capacidades(invasividad, angiogénesis,etc.)por parte de algunas células presentes en el tumor primario de neoplasias malignas. Los mecanismos que controlan la función metástasica, son en gran parte, desconocidos; aunque estudios realizados en la última decada han contribuido a esclarecer el papel de ciertos mediadores celulares y moleculares en dichos mecanismos. Un posible planteamiento con respecto a la regulación positiva del comportamiento metastásico es pensar que ciertos factores microambientales puedan ser determinantes, ya que incrementan el potencial metastásico a costa de una alteración del nivel transcripcional de ciertos genes. Este presente trabajo planteó como objetivos: Determinar la actividad metastásica en hígado del melanoma B16 activado por endotoxinas bacterianas. Caracterizar el mecanismo de adhesión de las células del melanoma B16 al endotelio sinusoidal hepático en presencia de endotoxinas bacterianas y tras permanencia en hipoxia prolongada: Caracterizar y cuantificar la expresión génica de ciertas moléculas de adhesion, citocinas y factores angiogénicos, asociados a la vía transcripcional dependiente del factor nuclear Kappa-B, inducible por los desequilibrios del estado redox intracelular. Los resultados obtenidos permiten concluir que:Durante la fase intracapilar de la diseminación metastásica del melanona B16,la transcripción del gen de la integrina VLA-4 conlleva un aumento de la adhesión endotelial que incrementa su potencial metastásico. Este mecanismo implica la generación transitoria de variantes celulares metastásicas en el tumor, y está regulado por una activación transcripcional asociada al factor nuclear Kappa-B, que depende de la caída intracelular del G5H causada por factores microambientales de stress tales como endotoxinas, peróxido de hidrógeno o hipoxia.

Autor: ESTAPÉ IZQUIERDO DAVID.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: ESCUELA SUPERIOR DE INGENIERÍA .
Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y FORMACIÓN CONTINUADA.

Resumen: La aparición de agregados proteicos, conocidos como cuerpos de inclusión, son el resutlado que muy frecuentemente se obtiene de la síntesis de proteína heterologa en E. Coli recombinante. La proteína acumulada en forma de cuerpos de inclusión se caracteriza por la ausencia de su estructura tridimensional que a su vez representa la perdida de sus actividad biológica. En estos casos, es posible obtener proteína activa siguiendo un proceso de renaturalización. El objetivo del trabajo ha sido el estudio del proceso de renaturalización del factor de crecimiento básico del fibroblasto (hFGF-2). El trabajo esta orientado desde un punto de vista ingenieril y se propone como objetivo final la definición de las condiciones i la forma más idóneas de realizar el proceso de reaturalización que habrían de favorecer la formación de proteína activa. El trabajo esta dividido en cada uno de los pasos que componen el proceso de renaturalización. El lavado y la solubilización de los cuerpos de inclusión como pasos previos y el proceso repliegue por el cual la proteína adquiere su estructura tridimensional y a la vez su función biológica.El objetivo final ha sido identificar cada uno de los factores que tienen un papel clave en el rendimiento obtenido en cada. El principal objetivo ha sido el estudio del proceso de repliegue. Este representa el paso limitante del proceso de reanturalización y además tienen un alto interés científico.Este se ha dividido en los dos estudios: la estabilidad de la molécula de hFGF-2 y la cinética de desnaturalización y de repliegue. Además, se incluye el análisis de los fenómenos de agregación que generalmente se observan durante el proceso de repliegue y que son los responsables de los bajos rendimientos que se obtienen.

Autor: RIU PASTOR EFREN.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: VETERINARIA .
Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA.

Resumen: La diabetes mellitus es la enfermedad metabolica más frencuente que afecta colectivamente de un 2 a un 7% de la poblacion mundial y se caracteriza por hiperglucemia debida a la falta de insulina o bien por la falta de acción de la misma. El factor de transcripción c-myc reconoce la secuncia CACGTG, identificada en elementos de respuesta a glucosa en genes implicados en el control de la glocólsis y e la lipogénesis hepatica. Se han generado ratones transgenicos que sobreexpresan el gen c-myc bajo el control del promotor del gen de la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa(PEPCK). Los ratones transgenicos presentan un incremento en la captación, utilización y almacenamiento de la glucosa a nivel hepatico. Por otra parte, un incremento en la proteina c-Myc es capaz de contrarrestrar las alteraciones diabeticas a traves de su capacidad de inducir la captacion y la utilizacion hepatica de glucosa y de bloquear la activacion tanto de la gluconeogenesis como de la cetogénesis. Por tanto, este modelo corrobaria in vivo que un incremento en la captación y utilizacion de glucosa seria una aproximacion util para disminuir la hiperglucemia diabetica. El musculo esqueletico contribuye en alrededor de un 75% en la eliminacion de la glucosa del torrente sanguineo despues de la ingestión de alimentos. Durante un proceso diabetico, el musculo esqueletico es incapaz de captar glucosa de la sangre. En este Estudio se han generado ratones transgenicos que expresan insulina humana en este tejido. La produccion de insulina humana biologicamente activa a nivel muscular lleva a un aumento en la captación y en la utilización de la glucosa por parte de este tejido. Además, tras la induccion de diabetes experimental mediante estreptozotocina, estos animales presentan un disminución de la hiperglucemia diabetica, asi como una normalización del metabolismo muscular y hepatico. Por tanto, este modelo corrobaría in vivo que durante un proceso diabetico, la secrecion continuada de insulina posiblemente llevaria a una disminucion de la hiperglucemia diabetica.

Autor: CABOT CARDOS BEATRIZ.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y DE FORMACIÓN CONTINUADA.

Resumen: El objetivo principal de esta tesis doctoral ha sido el estudio de la variabilidad genética del virus de la hepatitis C (VHC) en muestras del hígado y suero de pacientes con hepatitis crónica. Hasta el inicio de nuestro estudio, la mayoría de trabajos se basaban en el análisis exclusivo de las muestras de suero. El genoma del VHC, como el de todos los virus RNA, presenta una estructura en cuasiespecie, es decir está compuesto por un conjunto de secuencias mutadas (que constituyen el espectro de mutantes) distribuidas alrededor de una o más secuencias principales. En un primer estudio realizado con cuatro pacientes, observamos que la complejidad de la cuasiespecie vírica circulante era dos o más veces menot que la de la cuasiespecie vírica hepática. A prtir de este resultado realizamos tres nuevos estudios: 1- Análisis de un población de 39 pacientes con hepatitis crónica y diferente grado de lesión hepática (estudio sincrónico) 2- Análisis de la evolución de la cuasiespecie del VHC en muestras sucesivas de hígado y suero de un paciente estacionario con poca lesión hepática (Estudio diacrónico). 3- Obtención de un método que permita el análisis de las secuencia minoritarias de la cuasiespecie vírica. Encontramos tres grupos diferentes de pacientes; Grupo A: pacientes con similar complejidad entre la población vírica hepática y circulante. Grupo B: pacientes cuya cuasiespecie vírica circulante era 2 ó más veces menos compleja que la hepática. Grupo C: pacientes cuya cuasiespecie vírica circulante era 2 ó más veces más compleja que la hepática. En más del 50% de los pacientes con hepatitis crónica existían diferencias entre la complejidad de ambos compartimentos. La relación entre la complejidad de la cuasiespecie vírica hepática y la circulante no era constante sino que variaba en el tiempo (no definía un grupo particular de pacientes sino un estado puntual de la población vírica). De nuestros resultados se concluye que: (i) casi todas de las secuencias hepáticas son capaces de salir al suero. (ii) la mayoría de las secuencias de suero se relacionan con las secuencias existentes en la primera o segunda muestra hepática. Por tanto, las hipótesis más probables para explicar las diferencias encontradas entre la complejidad de las dos poblaciones víricas son: A- Existencia de una compartimentalización funcional de la replicación vírica (implica la existencia de dos tipos de células hepáticas, unas crónicamente infectadas y otras recientemente infectadas. B- Diferente actuación del sistema inmune sobre el VHC mientras está en el hígado o en el suero. Al examinar la relación entre la complejidad de la cuasiespecie vírica y el grado de lesión hepática, vimos que sólo en los pacientes del grupo A (similar complejidad en ambos compartimentos) existía correlación positiva entre la complejidad a nivel de aminoácidos y la fibrosis hepática. Por último hemos puesto a punto una nueva metodología que permite el análisis de la topología de las cuasiespecies víricas. Con este nuevo método hemos podido determinar el límite del espacio de secuencias ocupado por la cuasiespecie vírica y cómo se distribuyen las secuencias víricas mutantes alrededor de la secuencia principal en dicho espacio.

Autor: ROCA CASTELLA F. XAVIER.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: UNIVERSITAT AUTONOMA DE BARCELONA.

Resumen: Las isoformas de CD44 se originan por mecanismos de splicing alternativo de la región central (exones v2-v10) de su pre-mRNA. En el primer bloque del trabajo se ha utilizado el carcinoma de mama humana como modelo para describir las vias de splicing alternativo que actuan en esta región ,las cuales explican el conjunto de isoformas de CD44 expresadas en este tejido. La via general de splicing alternativo induce la exclusión de los exones de la región variable en sentido 5´-3´,dirigiéndose a la sintesis de CD44H, exenta de exones variables. Este sistema aparece desregulado en el carcinoma, ya que se observa la inclusión gradual y progresiva de los exones de 3´a 5´, y a la aparición de isoformas de mayor peso molecular. Es un efecto posicional, correspondiente a un mecanismo de control de splicing alternativo que podría ser compartido por otros genes implicados en metástasis. La segunda via promueve la inclusión del exón variable 3, y se mantiene en ambos casos, fisiológico y patológico. En el segundo bloque de la tesis se describe el uso de nuevos splice sites 3´de los exones variables 5 y 7 del CD44, fenómeno que confiere mayor variabilidad a la proteína. El tercer bloque aborda una primera aproximación a la caracterización de los elementos cis-reguladores de la inclusión específica del exón variable 3 del CD44 en el tejido mamario humano. Se ha visto que la longitud de los intrones flanqueantes de v3 es un determinante de la exclusión mayoritaria de este exón en el mRNA, y se han acotado las posiciones de almenos dos enhancers de splicing de v3.

Autor: ROURA MIR CARME.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: HOSPITAL UNIV. GERMANS TRIAS I PUJOL.

Resumen: El objetivo de este trabajo es profundizar en el estudio de la respuesta celular en las patologías autoinmunes del tiroides y en concreto, en la enfermedad de Graves-Basedow(GD) y la Tiroiditis de Hashimoto(HT), caracterizando fenotípica y funcionalmente las celulas T autoreactivas y reguladoras implicadas. El análisis de las células T a B convencionales(T a B CD4+ o T a B CD8+) ha demostrado que a nivel poblacional los linfocitos T infiltrantes (ITLs) de los tiroides afectados por GD utilizan un repertorio muy amplio de familias TCRVB, reflejando las heterogeneidad de los epítopos autoantigénicos diana de la respuesta en la etapa crónica de la enfermedad. El repertorio TCRVB de las lineas clonales de células T autorreactivas aisladas a partir de los ITLs con especificidad antigénica conocida mantiene la misma heterogeneidad que en los ITLs, con predominancia de alguna familia VB en cada muestra, sin relación aparente con la especificidad antigénica. Estas lineas muestran baja afinidad por el antígeno. A nivel de CDR3, sin embargo, hay cierta restricción TCRVB. También es heterogéneo el patrón de sintesis de citocinas. En GD y HT se sintetiza tanto IL4 como IFNy,siendo las células T actividas, funcionalmente dominantes en GD, celulas CD4+ y productoras de IL4 y en HT,CD8+ y IFNy+. Tambien forman parte de los infiltrados celulas Ty que constituyen un 4-33% del total en GD, un 1-8% en HT y sólo un 1% en la muestra de MNG. El repertorio de TCR está más restringido, con dos familias V dominantes en los ITLs de GD y HT, V 3 y V 5,pero sólo V 5 representa una expansión intratisular en relación a los PBLs de individuos control. El clon TCRy aislado a partir de los infiltrados, 158RE.2, tiene TCR poco usual formado por las cadenas variables V 5 i Vy8. Además tiene especificidad por células epiteliales de origen endocrino y, especificamente, por células epiteliales tiroideas (CFT), independientemente del tipaje HLA. Por tanto es posible que moléculas no polimórficas como MIC o CD1 estén implicadas en el reconocimiento. 158RE.2 sintetiza tanto IL4 como IFNy y también IL10 por lo cual se ha propuesto que celulas Ty como el clon 158RE.2 podrían jugar un papel en el desarrollo incial de la respuesta autoinmune determinando el tipo de respuesta Th o bien regulando las celulas TaB Th1 o Th2 via la propia sintesis de citocinas. El tercer grupo corresponde a células TaBDN(NKT), que constituyen un 41% y un 65% de media en GD y HT respectivamente, de las células productoras de IL4 de los ITLs. El analisis del TCR de estas celulas ha permitido distinguir tres grupos de células TaBDN:(1) células Va24-JaQ-,(2) celulas Va24+JaQ-i(3) Va24+JaQ+. La presencia de los tres subgrupos celulares cambia en función de la patología tiroidea estableciendose la gradacion siguiente:1)TaBDNVa24+: MNG>HT>GD i, 2)TaBDN Va24+JaQ+:MNG>GD>-HT. Por tanto , en HT se da una disminución de células TaBDN Va24+JaQ+ menos evidente en GD y que no se observa en MNG. La reducción en el número de estas celulas detectada sobretdo en HT, comparado con MNG, sugiere que una falta de regulaciónm de la respuesta puede ser responsable, como minimo en parte, de la patología autoinmune. Las celulas TaBDN de los infiltrados expresan marcadores de células NK y tienen una característica especialmente interesante, reconocen moléculas de CD1, sobre todo CD1a y CD1c, pero también CD1d a traves de su TCR. Estudios muy preliminares sugieren que algunas de las lineas de celulas TaBDN reconocen la molécula de CD1 unida a un análogo sintético del Dolicol-P-manosa de Micobacterium Avium, glucolípido que es especialmente abundante en la glándula tiroidea i donde su sintesis esta regulada por la TSH. A falta de confirmación,en los tiroides afectados por procesos autoinmunes se han detectado celulas interfoliculares que expresan CD1, problamente células dentríticas, pero también se ha detectado la expresión de CD1a i CD1c en las células foliculares tiroideas (CFT).

Autor: GARCIA-PATOS BRIONES VICENTE .
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: UAB.

Resumen: Durante el embarazo se produce una transferencia de células desde el feto hacia la madre y viceversa. Algunas son células progenitoras hematopoyéticas capaces de persistir viables durante décadas, dando lugar a microquimerismos. Estos microquimerismos pueden estar implicados en la etiopatogenia de ciertas enfermedades, como la esclerois sistémica. Mediante nested PCR para amplificar secuencias de ADN y del gen SRY, específico del cromosoma y, realizamos un estudio prospectivo a fin de investigar la presencia de microquimerismos fetales en 25 muestras de sangre, piel afecta y piel sana de 10 pacientes afectas de morfea que había tendio uno o más hijos y/o abortos de sexo masculino o desconocido. La sensibilidad de la técnica fue del 0,01-0,004%. Se detectaron secuencias SRY en 3 pacientes (2 muestras de sangre periférica, 1 de piel afecta y 1 de piel sana perilesional). Los resultados fueron negativos en las 30 muestras procedentes de 16 pacientes control, 11 de ellas (5 afectas de liquen escleroatrófico) potencialmente expuestas a microquimerismos masculinos durante la gestación. Estos hallazgos sugieren que los microquimerismos fetales podrían estar implicados en la etiopatogenia de algunso casos de morfea. Sin embargo, su detección en piel aparentemente sana parece indicar que no son suficientes para el desarrollo de la enfermedad. PALABRAS CLAVES Morfea, embarazo, microquimera, PCR, cromosoma Y.

Autor: BARCENA MARTIN MONTSERRAT.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: Se han utilizado técnicas de microscopía electrónica y procesamiento de imagen para caracterizar tres helicasas hexaméricas: G40P de SPP1, RepA de RSF1010 y DnaB de Escherichia Coli. Las tres enzimas son proteínas hexaméricas que se ensamblan en estructuras con un canal central y forma de anillo. Se ha desarrollado una nueva aplicación del algoritmo del mapa auto-organizativo que permite detectar diferencias en la simetría de las imágenes de microscopía electrónica. Los resultados obtenidos evidencian la existencia de un polimorfismo estructural para las tres helicasas, con coexistencia de formas cuaternarias de simetria C3 y C6. Se ha delimitado el pH como el factor que controla este polimorfismo estructural in vitro. Sin embargo, el complejo formado entre DnaB y DnaC adopta una arquitectura C3, con independencia del valor del pH. La proteína auxiliar DnaC congela a la helicasa DnaB en una arquitectura de simetria rotacional de orden 3. La reconstrucción tridimensional de DnaB. DnaC a 27 A de resolución, muestra que tanto DnaB como DnaC forman dos trímeros de dímeros asimétricos que se disponen uno sobre otro y girados entre sí. El canal central de la helicasa DnaB resulta parcialmente ocluido en el complejo, lo que podría dar cuenta de su inactivación en el complejo.

Autor: BENITO GUZMAN M. JESUS.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: La artritis reumatoide (AR) se caracteriza por la hiperplasia de la membrana sinovial, la infiltración de células inflamatorias y la fibrosis. La ciclosporina (CsA) es un agente inmonosupresor que tradicionalmente se ha utilizado como tratamiento previo a los transplantes. Hoy en día CsA se utiliza cada vez más en pacientes con AR para controlar la progresión de la enfermedad, aunque se conoce poco acerca de su efecto sobre la membrana sinovial. En el presente trabajo se ha utilizado un modelo de artritis por adyuvante en conejos para estudiar la acción de la CsA sobre las lesiones sinoviales. Este modelo experimental presenta una patología muy similar a la de la AR, no solo en sus efectos inflamatorios, sino también en el depósito de proteínas de matriz. El estudio histopatológico demostró que la administración de CsA(10 mg/kg/día) disminuyo la hiperplasia de la membrana, el infiltrado de macrófagos y la proliferación sinovial. Entre las acciones antiinflamatorias de la CsA se encontraba la inhibición en la producción de COX-2, la ciclooxigenasa inducible responsable de la síntesis de PGE2. El tratamiento también consiguió reducir la exprexión y síntesis de dos de los principales factores pro-fibrogénicos, el TGF-B y el PDGF, así como el acúmulo de las proteínas de matriz colágenos I, III y fibronectina. Mediante ensayos in vitro se mostró que los sinoviocitos respondían de forma diferente a las acciones de la CsA en la expresión de TGF-B dependiendo de que se tratara de células sanas o artríticas, lo que explicaría la ausencia de fibrosis en los animales tratados. Por otra parte, en cuanto a los mecanismos implicados, en este trabajo se ha visto que la CsA no modula la activación de los factores nucleares NK-kB, AP-1 ni NF-AT en la membrana sinovial, y que incluso es capaz de activarlos en los sinoviocitos cultivados, por lo que debe ejercer sus efectos a nivel post-transcripcional. Además, son tanto los macrófagos infiltrantes como los sinoviocitos de la íntima las células que presentan el NF-kB y el AP-1 activados. No hay que olvidar que la CsA es un fármaco con marcado efecto dual dependiendo tanto del tipo celular como de la dosis utilizada. En conclusión, este trabajo muestra que la CsA es un buen tratamiento para la AR, tanto por sus efectos beneficiosos como por la ausencia de efectos adversos tales como la fibrosis que ocurre en otros tejidos.

Autor: LOSADA GONZALEZ ALEJANDRO.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: MEDICINA.

Resumen: El factor de transcripción TTF-1 tiene un papel esencial en la morfogénesis y desarrollo pulmonar. Además regula la expresión de las proteínas del surfactante, las cuales son imprescindibles para la función respiratoria. Los neonatos que presentan una hernia daiafragmática congénita mueren por un fallo respiratorio como consecuencia de la hipoplasia pulmonar y la inmadurez bioquímica asociada. Para profundizar en las causas de esta enfermedad y en el efecto de la terapia hormonal utilizada para el tratamiento de estos pacientes, hemos estudiado el factor de trasncripción TTF-1 como marcador de la morfogénesis pulmonar yla proteína SP-B como marcador de la maduración pulmonar. Usando un modelo de hipoplasia pulmonar en rata, hemos demostrado que los niveles de RNAm de TTF-1 y SP-B estándisminuidos en los pulmonares hipoplásicos. El tratamiento con dexametasona aumenta los niveles de ambos RNAm por encima de los valores de los controles cuando se tratan animales con los pulmones hipoplásicos,pero sin embargo no tiene ningún efecto cuando se adminsitra a animales controles. THR también aumenta los niveles del RNAm de TTF-1 y SP-B, pero en menor media que los glucocorticoides. Cuando se administran juntos, TRH inhibe parcialmente los efectos de la dexametasona. La disminución en los niveles del RNAm de TTF-1 se correlacionan con una disminución en los niveles de proteína y enla capacidad de ésta de unirse al DNA cuando se utiliza como sonda un oligonucleótido con el sitio de unión para TTF-1 del promotor de SP-B. Todos los parámetros se restablecen después del tratamiento condexametasona. Además,la regulación en la expresión de TTF-1 descrita anteriormente se acompaña con la regulación de la actividad de su promotor, como se demuestra en los experimentos de transfección transitoria con la línea celular humana H441. Hemos demostrado invitro que el nitrofen disminuye la capacidad de unión de TTF-1 al DNA y que ésta se recupera después de tratar con agentes reductores.Además, el tratamientocon este compuesto induce la proteína c-Jun y el tratamiento con dexametasona reduce la capacidad de unión del complejo AP-1 al DNA. En conclusión nuestros datos demuestran que la hipoplasia pulmonar y la disfunción respiratoria asociada, como consecuencia de la disminución en la expresiónde SP-B, se deben en parte a la inhibición de TTf-1. La observaciónde que el tratamiento prenatal conglucocorticoides induce la expresión de TTF-1, apoya el tratamiento con esta hormona de aquellos pacientes que probablemente desarrollen hipoplasia pulmonar.

Autor: MARTINEZ MAZA RODRIGO.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS .
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGIA MOLECULAR.

Resumen: La glicina es el principal neurotransmisor inhibidor junto con el GABA, es el sistema nervioso central de mamiferos. Su acción finaliza mediante recaptura específica de la hendidura sinaptica a traves de los transportadores de alta afinidad. GLYT1 y GLYT2, localizados en la membrana plasmática de neuronas y células de glía. Para conocer el mecanismo de funcionamiento de la neurotransmisión mediada por glicina, es necesario un estudio detallado de su estructura y biología molecular. En este trabajo hemos estudiado el papel funcional de diferentes dominios estructurales de los transportadores de glicina mediante la utilización de técnicas bioquímicas, de biología molecular y electrofisiológicas. Para este fin nos hemos planteado los siguientes objetivos:1.- Analisis de las propiedades diferenciales de los transportadores GLYT1 y GLYT2 en lineas celulares que expresan de forma estable estas proteinas.2.-Caracterizacion del papel funcional de los siguientes dominios estructurales en la actividad del transportador GLYT2:a) Regiones amino y carboxilo terminal. B) Cadenas oligosacarídicas unidas a residuos de asparagina(N-glicosilación). C)Bucles hidrofílicos extracelulares que unen dominos transmembrana. Se han hallado diferencias funcionales y electrofisiológicas entre los dos transportadores de glicina especificos del SNC,GLYT1b y GLYT2a,mediante la comparación de sus actividades en un sistema heterólogo de expresión estable. GLYT2 presenta diferente perfil farmacológio que GLYT1, una menor afinidad aparente por el ión C1, un mayor acoplamiento al gradiante quimiosmótico de Na+y una mayor dependencia del voltaje de las corrientes producidas tanto en presencia como ausencia de sustrato. Los extremos amino y carboxilo terminales de GLYT2 se localizan al igual que en el caso de GLYT1 en el interior celular. Estos dominios no afectan directamente a la actividad funcional del transporador sino que participan en la inserción correcta en la membrana y/o en la conducción de la proteína hacia la superficie celular. GLYT2 se encuentra N-glicosilado en el bucle extracelular 2. La N-glicosilación no es necesaria para la actividad funcional del transportador, pero si para el plegamiento, la estabilidad de la conformación activa e inserción correcta de la proteína en la membrana plasmática. El intercambio de extensas regiones entre GLYT1 y GLYT2 conduce a la formación de transportadores quiméricos inactivos. Sin embargo, el intercambio de bucles extracelulares de GLYT1 sobre GLYT2 genera quimeras activas con propiedades funcionales bioquímicas similares al transportador silvestre GLYT2. La alquilación con reactivos derivados de MTS los residuos de cisteína en las posiciones 62 de GLYT1, 223 y 224 de GLYT2 situados en el bucle extracelular 1, provoca una inhibición de la actividad de estos transportadores. Los substratos glicina, sarcosina y los iones Na+ y C1- protegen al transportador de la inactivación ejercida por los derivados de MTS, indicando que la región del buqle 1 de los transportadores de glicina estaría implicada en el mecanismo de transporte.