BIOQUIMICA MOLECULAR, 36

Autor: POYATOS BELIO IRENE.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS, U.A.M..

Resumen: La glicina es uno de los principales neurotransmisores inhibidores de la médula espinal y el tallo cerebral de mamiferos, donde ejerce importantes funciones en el procesamiento de la información sensorial y motora. Ademas, la glicina juega un papel fundamental en la neurotransmisión excitadora, ya que es coagonista, junto con el glutamato, de los receptores NMDA. La acción sináptica de la glicina es terminada mediante su recaptura por transportadores situados en la neurona presináptica o en las células de glía adyacentes. En este estudio, hemos demostrado que existen señales derivadas de las neuronas que modulan la expresión de uno de estos transportadores de glicina,GLYT1, en las células gliales. También se ha demostrado que el transportador neuronal GLYT2 es responsable del fenotipo glicinérgico de las neuronas que lo expresan. A continuación hemos realizado un análisis de las secuencias que detrminan la localización subcelular de estos transportadores, y utilizando modelos experimentales de celulas MDCK y neuronas en cultivo, hemos identificado diferentes señales que dirigen el tráfico intracelular de estos transportadores. Finalmente, identificamos una nueva proteina que interacciona con ellos, PKCI2.

Autor: ALFONSO RUBI JULIO.
Año: 1999.
Universidad: POLITECNICA DE MADRID.
Centro de lectura: INGENIEROS AGRONOMOS.
Centro de realización: ETS INGENIEROS AGRONOMOS.

Resumen: El arroz (Oryza sativa L.) es uno de los cultivos más importantes del mundo. Se estima que cada año esta especie reduce en un 50% su rendimiento máximo teórico debido a plagas y enfermedades. La finalidad de esta tesis ha sido transferir, integrar y expresar el gen Itrl de cebada, que codifica el inhibidor de tripsina BTI-Cme, a celulas desdiferenciadas(callos) de cultivares indica y japonica de arroz y regenerar plantas completas de arroz a partir de celulas transformadas. Se han establecido sistemas de propagación in vitro de plantas de arroz mediante embriogénesis somática, y se han optimizado las condiciones de transferencia de genes mediante bombardeo de partículas. Se han diseñado construcciones génicas que portan el gen Itrl y genes selectivos que permiten unicamente el crecimiento de las células transformadas en medios selectivos. Utilizando como molde ADN de arroz y como cebadores nucleótidos deducidos de la secuencia del gen Itrl de cebada, se ha amplificado mediante la técnica de PCR un fragmento de ADN del tamaño esperado, pero no se ha detectado la correspondiente proteina en ninguno de los tejidos de arroz no-transgénico analizados (semillas y hojas). Las plantas transformadas seleccionadas han sido analizadas molecular y bioquímicamente. Se han obtenido 12 plantas transgénicas de arros, 7 de la línea IR58 de tipo indica y 5 del cultivar Senia tipo japónica, que portaban el transgén y expresaban la correspondiente proteina. Ensayos invitro de inhibición de tripsina han demostrado la funcionalidad de la proteina BTI-Cme en los arroces transgénicos. Futuros bioensayos con insectos determinaran la capacidad insecticida de dichas plantas.

Autor: FUERTES FISCHER ANTONIO.
Año: 1999.
Universidad: POLITECNICA DE MADRID.
Centro de lectura: INGENIEROS AGRONOMOS.
Centro de realización: CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGIA.

Resumen: En la presente tesis hemos abordado el analisis funcional de la familia de reguladores de la transcripción R2R3-MYB utilizando como sistema modelo A.thaliana por su utilidad para el analisis genetico y molecular. Con este objetivo, hemos iniciado una estrategia basada en tecnicas de genetica reversa para identificar mutantes en genes de la familia R2R3-MYB, que en A.thaliana se compone de cerca de 100 miembros. Esta estrategia ha consistido en el aislamiento de lineas mutantes mediante el cribado por PCR de colecciones de lineas de A.thaliana mutagenizadas por inserción de T-DNA o transposones. Se obtuvieron inserciones en 10 de los 18 genes analizados, lográndose una eficiencia de cribado cercana a la esperada por calculos teoricos. De esta manera, queda demostrado que en A.thaliana la aproximación por genetica reversa al estudio funcional de miembros de familias genicas es factible desde el punto de vista de la disponibilidad y de la eficiencia de los recursos existentes. Los mutantes encontrados en éste y en similares trabajos consituyen el punto de partida para el análisis sistemático de la función de los miembros de la familia de factores transcripcionales R2R3-MYB. Mediante la construcción razonada de múltiples mutantes se facilitar dicho estudio ya que se sortearon los fenomenos de redundancia entre genes de la familia. En esta tesis, atendiendo a la localizacion de las inserciones respecto a los genes R2R3-MYB se ha analizado en mayor detalle los mutantes Atmyb 14-1 y Atmyb 56-1, en los que se comprobó la ausencia de transcrito de sus genes silvestres mediante técnicas de RT-PCR. El analisis de expresión efectuado mediante ensayos de actividad GUS apunta hacia la expresión especifica de AtMYB56 en apices radiculares y en la base del hipocotilo. La expresión ectópica en plantas de A.thaliana de dicho gen produce efectos pleiotrópicos entre los que se encuentran el menor tamaño de raices y parte aerea, la perdida de dominancia apical y las hojas curvadas sobre si mismas. El analisis fenotípico del mutante nulo Atmyb56-1 mostro reducciones en el crecimiento radicular anque no se ha podido confirmar(ni descartar) que dependan de la mutacion en AtMYB56. Este conjunto de resultados es competible con un papel de AtMYB56 en procesos de division celular. Los experimentos llevados a cabo con plantas transgenicas que portaban fusiones traduccionales del gen delator uidA con secuencias reguladores AtMYB14 permitieron localizar su actividad en los pices radiculares y en el meristemo apical. También se comprobo que esta actividad se inducia por adición exogena del regulador de crecimiento citoquinina, implicado en procesos como la división celular, la fotomorfogénesis y la prevención de senescencia. El análisis fenotípico detallado del mutante Atmyb14-1 reveló sintomas de senescencia acelerada respecto a plantas testigo. El estudio multigeneracional llevado a cabo reflejó una clara desventaja reproductiva del alelo Atmyb14-1 frente a su alelo silvestre. Estos resultados sugieren la implicacion de AtMYB14 en la prevención de senescencia.

Autor: MORALES LEÓN M. VICTORIA .
Año: 1999.
Universidad: LAS PALMAS DE GRAN CANARIA.
Centro de lectura: CIENCIAS MÉDICAS Y DE LA SALUD.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS Y DE LA SALUD.

Resumen: Durante cada ciclo ovárico, las células granulosa proliferan, se diferencian y finalmente mueren por apoptosis. Una glucoproteína de origen hipofisario, la FSH (hormona folículos estimulante), regula de forma principal la expresión o represión en la célula granulosa de proteínas específicas que acompañan a cada uno de estos procesos. El receptor de FSH, de siete dominios transmembranales, está acoplado a la generación de AMPc. De acuerdo con esta última observación, la expresión de la mayoría de las proteínas de las que dependen la proliferación, diferenciación y posiblemente la apoptosis de las células granulosa está en alguna media regulada por el CRB, el factor de transcripción activado por la proteína quinasa dependiente de AMPc (PKA). Después de ser fosforilado, el CREB forma dímeros que se unen a un elemento de respuesta específico (CRE: elemento de respuesta a AMPc) en el promotor de los genes cuya transcripción activa. La transcripción dependiente de CREB se modula por un conjunto de proteínas producto del procesamiento alternativo de un gen denominado cREM (elemento modulador de la respuesta a AMPc). Las diferentes isoformas de CREM contienen al menos uno de los dos dominios de unión al DNA, de alta homología con los de CREB, dos o más dominios de fosforilación y, dependiendo de su carácter coactivador o represor, uno o más dominios de transactivación. Un segundo promotor intrónico, direige la expresión de cuatro isoformas inducibles de CREM, que funcionan como represoras de la transcripción activada por AMPc y se denominan ICER (represor tempranamente inducible de la repuesta a AMPc). Considerando lo anteriormente expuesto, nos planteamos estudiar: 1- La expresión de las isoformas no inducibles de CREM en las células granulosa durante la maduración del ovario y del folículo, es decir, desde el nacimiento hasta la iniciación de los cilos ováricos y a lo largo de cada uno de estos ciclos. 2- La expresión de las isoformas inducibles de CREM en respuesta a FSH y su participación en la regulación de la expresión de la P450 arom, proteína que puede ser considerada como marcadora de la diferenciación de la célula granulosa. 3- El efecto del GnRH y el TNFa, que inhiben la diferenciación e inducen la apoptosis de las células granulosa, sobre la expresión de las isoformas no inducibles de CREM. 4- La capacidad de los antagonistas nombrados para modificar la expresión de ICER, y los mecanismos por los que tal modificación podeía ocurrir.

Autor: SOLA VILARRUBIAS MARIA.
Año: 1999.
Universidad: POLITECNICA DE CATALUÑA.
Centro de lectura: INGENIEROS INDUSTRIALES.

Resumen: Para ampliar el estudio de proteínas transductoras de señal de dos componentes iniciado en el laboratorio y, a la vez, mantenernos en el marco de las proteínas que interactúan con el DNA, escogimos el factor de transcripción PhoB, que es una proteína bacteriana reguladora de respuesta. Así, se decidió amplificar y clonar el segmento de DNA del gen phoB correspondiente al dominio receptor del fosfato (residuos del 1 al 125), expresar este dominio y, posteriormente, purificarlo en grado suficiente para facilitar la futura obtención de cristales. Más tarde se buscarían condiciones de cristalización para obtener cristales de calidad suficiente para su ulterior difracción empleando rayos X. Con los datos de difracción se determinaría la estructura tridimensional de la proteína, la cual posteriormente, se afinaría, verificaría y, finalmente, se interpretaría la estructura cristalográfica. Se lograron los objetivos planteados, consiguiéndose cristales nativos y cristales derivados con un átomo de oro. Con éstos últimos se realizó un experimento de difracción anómala a múltiples longitudes de onda, que sirvió para obtener unas fases iniciales y calcular un mapa de densidad electrónica, con el que se trazó el modelo. Mediante remplazamiento molecular usando este modelo se resolvieron los datos de difracción del cristal nativo (que llegan hasta 1.9 A de resolución), cuya estructura se afinó y verificó. La determinación de la estructura tridimensional del dominio receptor del fosfato revela un plegamiento de doble vuelta (AlfaBeta)5. En el centro activo se conserva la interacción electrostática entre los aminoácidos esenciales Asp53-Lys105 y Glu-9-Lys105. El área más flexible es la zona Beta4-Alfa4-Beta5Alfa5, característica de los dominios receptores de las reguladoras de respuesta, aunque a diferencia de éstos se produce, en PhoB, el desplazamiento de la hélice Alfa4 a lo largo de la secuencia. En la unidad asimétrica del cristal hay dos moléculas que interactúan entre sí a través de una superficie autocomplementária hidrofóbica; ésta incluye la hélice Alfa1, el lazo Beta5Alfa5 y el segmento N-terminal de la hélice Alfa5, que contiene el aminoácido funcionalmente esencial Lys105 del centro activo. Las características de la zona de interacción sugieren que ésta sea la superficie de dimerización.#

Autor: RIOS BENITEZ VIVIAN MAYTHE DE LOS.
Año: 1999.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: QUIMICA.

Resumen: La Sticholisina II (Stn II), citolisina producida por la anémona S.helianthus interacciona con membranas modelo de diferente composición lipídica, induciendo su permeabilización. El mecanismo mediante el cual produce ésta parece implicar la formación de poros discretos de carácter oligomérico. El proceso de liberación de contenidos acuosos se ajusta a un mecanismo todo o nada. La interacción con membranas modelo induce cambios conformacionales a nivel de estructura secundaria, que supone un aumento en su contenido de estructura Beta. Bajo determinadas condiciones experimentales, alta temperatura y disoluciones con valores extremos de pH, Stn II, muestra estados parcialmente plegados, caracterizados por retener un elevado porcentaje de estructura secundaria regular, carecer de estructura terciaria nativa y poseer capacidad de unir sondas fluorescentes hidrofóbicas. La citolisina se comporta en disolución como un sistema asociativo monómero-tetrámero. Finalmente, se ha clonado y expresado el gen de la Stn II, lo que permitirá modificar selectivamente residuos que puedan estar implicados en la interacción.#

Autor: RUIZ DIEZ BEATRIZ.
Año: 1999.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: QUIMICA.

Resumen: El objetivo principal de esta Tesis fue el desarrollo de técnicas moleculares específicas para el hongo patógeno humano Scedosporium prolificans, encaminadas a adquirir un mayor conocimiento de su taxonomía, variabilidad genética y patogenicifdad, así como aportar alternativas al problema de su resistencia total a los antifúngicos. El análisis de la región del rDNA nuclear que comprende los dos espaciadores transcritos y la subunidad 5,5S (ITSI-5,8S-ITSII) confirmó la relación filogenética entre las dos especies de Scedosporium (S.prolificans y S.apiospermum). Se estudió la resistencia intrínseca de S.prolificans a los antifúngicos, y en particular a la anfotericina B. Como alternativa a este problema se evaluaron combinaciones de antimicrobianos, encontrándose un resultado sinérgico en el caso de la anfotericina B combinada con cicloheximida. La comparación de aislados clínicos y ambientales de S.prolificans no reveló diferencias que pudieran afectar a su virulencia. La amplificación aleatoria de DNA polimórfico (RAPD) y la amplificación con iniciadores únicos dirigidos a secuencias de minisatélites de eucariotas ("PCR-fingerprinting") se emplearon para tipificar cepas de S.prolificans y estudiar dos brotes de infecciones hospitalarias causadas por S.prolificans. Se aislaron mediante la luz ultravioleta mutantes de S.prolificans deficientes en la síntesis de melanina que presentaron la misma resistencia a los antifúngicos que la estirpe salvaje original. También se desarrolló un método de transformación genética de S.prolificans por electroporación, empleando la resistencia a higromicina B como marcador de selección, y la región del rDNA secuenciada previamente para construir un vector específico de S.prolificas.#

Autor: RAMON OLAYO FERNANDO ANTONIO.
Año: 1999.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGIA.

Resumen: El método de producción, extracción y purificación de la D-Aminoácido Oxidasa a partir de células de Rhodotorula gracilis se ha optimizado. También se ha puesto a punto un método de purificación de la enzima clonado en células de Escherichia coli. Se ha realizado una caracterización estructural y funcional de la enzima usando, entre otros, estudios cinéticos de modificación química, de unión de cofactor y de mutagénesis dirigida. Los efectos de inhibición por producto y de inactivación ejercidos por el peróxido de hidrógeno también se han estudiado. Integrando los resultados obtenidos con los publicados anteriormente para ésta y otras oxidasas, se ha podido sugerir un modelo de mecanismo químico para la oxidación de D-aminoácidos catalizada por esta enzima.#

Autor: MARQUEZ ARAGONES ANTONIA.
Año: 1999.
Universidad: MALAGA.
Centro de lectura: MEDICINA.

Resumen: Este trabajo investiga la frecuencia de mutaciones del GEN BRCA 1 en las mujeres jóvenes con cáncer de mama de Málaga. Un 13,7 % presenta alguna mutación en este gen. El estudio de los antecedentes familiares de cáncer de mama y ovario en estas mujeres no fue un factor predictivo de la existencia de la mutación. Las características clínico patológicas y la supervivencia de las mujeres con cáncer de mama hereditario fue similar a las de las que padecian cáncer de mama esporádico.#

Autor: ROMERO SALVADOR CARLOS .
Año: 1999.
Universidad: POLITECNICA DE VALENCIA.
Centro de lectura: INGENIEROS AGRÓNOMOS.
Centro de realización: INSTITUTO DE BIOLOGIA MOLECULAR Y CELULAR DE PLANTAS..

Resumen: El ajuste osmótico es una respuesta generalizada de las plantas que se enfrentan a condiciones de estrés hídrico y salino. En este proceso las células vegetales acumulan iones tóxicos en la vacuola para evitar su interacción con los enzimas en solución, y solutos compatibles u osmolitos en el citoplasma. Los osmolitos son compuestos de bajo peso molecular que se acumulan en grandes concentraciones sin afectar al metabolismo, manteniendo el balance hídrico celular y en muchos casos (osmoportectores) protegiendo a proteínas y lípidos frente al estrés hídrico, salino, térmico, etc. Facilitando su estabilización. La trehalosa es un disacárido no reductor (1-a-D-glucopiranosil-1-a-D-glucopiranosido) y osmoprotector que se encuentra presente en diferentes organismos, aunque no en la mayoría de las especies vegetales superiores, y que diversos estudios han relacionado con la tolerancia al estrés térmico e hídrico en levadura. La síntesis de trehalosa en Saccharomyces cerevisiae se produce a tráves del complejo enzimático trehalosa-6-fosfato sintetasa (TPS1)/fosfatasa (TPS2), siendo el paso limitante el catalizado por la subunidad TPS1. Este enzima interviene además en el metabolismo de la levadura controlando el flujo de glucosa en la glicolisis y regulando otros sistemas de respuesta a estrés térmico y osmótico a nivel transcripcional. Rel objetivo principal del presente trabao era mejorar la tolerancia de las plantas a los estreses hídrico y salino mediante la expresión, en Nicotiana tabacum. Del gen TPS1 (trehalosa-6-fosfato sintetasa) de Saccharomyces cerevisiae, implicado en diversos mecanismos de tolerancia a estrés en levadura y responsable de la síntesis del osmolito trehalosa. Además se pretendía profunizar en los mecanismos de tolerancia a estrés salino en levadura mediados por TPS1 y estudiar las posibles implicaciones de su expresión en el metabolismo de carbohidratos de las plantas transgénicas tratando de ampliar los conocimientos establecidos sobre sus funciones en levadura. El gen TPS1 de Saccharomyces cerevisiae se introdujo en plantas de tabaco mediante transformación con Agrobacterium tumefaciens, integrándose de manera estable en el genoma y expresándose a niveles detectables.Sin embrgo, las cantidades de trehalosa acumuladas en estas plantas transgénicas son muy reducidas (alcanzando concentraciones máximas de 0,17 mg(gr peso fresco)-1, lo que podría deberse a su degradación por trehalasa o a la competencia por los substratos necesarios para la biosíntesis de trehalosa y sacarosa como la UDP-glucosa. La expresión de TPS1 en plantas transgénicas de tabaco produce alteraciones fenotípicas, que incluyen la pérdida de dominancia apical, reducción del crecimiento, hojas lanceoladas, cierta esterilidad y alteraciones morfológicas en las flores, como estambres petaloideos o menor número de piezas por verticilo.Además, las plántulas transgénicas etioladas presentan un fenotipo similar a la triple respuesta a etileno (inhibición de la elongación del hipocotilo, incremento de la expansión radial y crecimiento horizonal) de forma constitutiva. El estudio de cosegregación del gen marcador NPTII que confiere tolerancia a kanamicina y PTS1 relacionó la expresión de TPS1 con la aparición del fenotipo de hojas lanceoladas y descartó que este efecto se deba artefactos derivados del cultivo de tejidos. La expresión del gen TPS1 de levadura en plantas de tabaco transgénicas confiere tolerancia al estrés hídrico atenuando los síntomas de deshidratación y marchitamiento. La combinación de estos resultados sugiere que el mecanismo de mejora de la tolerancia al estrés hídrico, en plantas que expresan TPS1 y acumulan pequeñas cantidades de trehalosa, es complejo y no se reduce a una contribución parcial al ajuste osmótico. Los efectos fenotípicos observados inducen a especular que la expresión del gen TPS1 podría afectar a rutas metabólicas y hormonales dando lugar a cambios pleiotrópicos que incluyen la toleracia al estrés hídrico. Las plantas que sobreexpresan TPS1 son más tolerantes a LiCl que los controles presentando un reducido número de pústulas necróticas y una menor pérdida de clorofila. Una posible causa de esta tolerancia es que las plantas transgénicas acumulan en sus hojas hasta un 20% menos de Li*. Las pequeñas cantidades de trehalosa acumuladas (0,5 nM) pueden ser también suficientes para contribuir con su efecto protector estabilizando estructuras celulares, membranas y macromoléculas. La respuesta de las plantas de tabaco al estrés con LiCl es similar a la que se produce frente al ataque de organismos patógenos. La aparición e lesiones ncróticas sobre la superficie de las hojas recuerda ala HR que se origina como consecuencia del ataque de ciertos virus, bacterias u hongos. La acumulaicón de cpmpuestos fenólicos, como el ácido salicílico se correlaciona con la inducción de la respuesta SAR y la activación de las defensas de la planta.Finalmente la inducción observada en las plantas de tabaco sometidas a estrés con LiCl de genes sAR como PR1 y PR5 (osmotina), que codifican proteínas PR (pathogenesis related), parece sostener la relación entre la formación de lesiones y la expresión de proteínas relacionadas con la defensa frente a patógenos en plantas.Todas estas respuestas se ven claramente atenuadas en las plantas transgénicas donde los efectos de la toxicidad por litio son menos acusados. Estos cambios metabólicos no inducen sin embargo una SAR (Systemic Adquiered Resitance) ya que no confieren tolerancia a la infección por patógenos (TMV y Pseudomonas syringae) en plantas pretratadas con litio. Además de los ácidos salicílico y gentísico también se acumula en las plantas tratadas con LiCl un compuesto que estudios realizado mediante HPLC, espectrometría de masas y resonancia magnético nuclear (HMNR) señalan como falvonoide. La sobreexpresión de TPS1 enl evadura no altera la expresión de genes inducidos por estrés salino como ENA1 (ATPasa de Na*-Li*), y GPD1 (glicerol-3-fosfato deshidrgenasa), ni incrementa la acumulación de trehalosa o glicerol que actúan comosmolitos en levadura, pero reduce el potencial de membrana en las células dificultando la entrada de cationes tóxicos como higromicina B. Tetrametilamonio y Mn2+, y confiriendo toelrancia a LiCl. Los principales reguladores del potencial eléctrico de membrana son la H*-ATPasa y el sistema de transporte de potasio Trk1,2. El efecto observado es independiente de la actividad H*-ATPasa y parece estar relacionado con la ruta de activación del sistema Trk1,2, ya que la transformación de los mutantes hal4,56 y trk 1,2 con TPS1 no tiene ningún efecto en su tolerancia a la salinidad. Por último, la expresión del gen TPS1 de Saccharomyces cervisiae en tabaco transgénico altera el metabolismo de carbohidratos favoreciendo, el crecimiento y desarrollo de las plantas en presencia de azúcares en el medio, y este efecto no se debe a una mayor tolerancia al estrés osmótico sino a un mejor aprovechamiento de la fuente de carbono o a una menor sensibilidad a la paresencia de azúcares en el medio, ya que concentraciones equimolares de sorbitol, un azúcar nometabolizable por las plantas, afectan de manera similar a controles y transgéncias.Estas últiams presentan una mayor acitividad invertasa acumulando azúcares solubles, reduciendo el contenido en clorofila, y preprimeitno la expresión de genes regulados por carbohidratos e implicados en la fotosíntesis como CAB16, RBCS y TPT. La inhibición de la hexokinasa de tabaco por la trehalosa-6-fosfato producida en la biosíntesis de trehaolsa podría ser la causa de una menor seensibilidad a los azúcares del medio. Alternativamente, un sistema tampón en el que TPS1 consume glucosa-6-P y UDP-glucosa, impediría la depleción de los niveles de ATP y Pi libre, como consecuencia de la fosforilación de la glucosa, permitiendo a la spalntas transgénicas mantener unas mayores reservas energéticas y crecer mejor en medios suplmentados con azúcares.

Autor: HURTADO RUIZ MÓNICA ASUNCIÓN.
Año: 1999.
Universidad: POLITECNICA DE VALENCIA.
Centro de lectura: IGENIEROS AGRÓNOMOS.
Centro de realización: INSTITUTO DE INVESTIGACIONES AGRARIAS.

Resumen: La especie albaricoquero (P. Armeniaca L.), originaria de China y Asia Central, se cultiva en España principalmente en Murcia y Valencia. La aparición y extensión del virus de la Sharka ha puesto de manifiesto la necesidad de obtener nuevas variedades resistentes al virus. La Sharka es actualmente la virosis frutal de mayor importancia económica en Europa. Todas las variedades europeas tradicionales de albaricouero son susceptibles, incluso se teme por la continuidad del cultivo en España. Con el fin de introducir resistencia a Sharka en variedades autóctonas se iniciaron una serie de progrmas de mejora genética en España y en otros países.La presente tesis pertenece al programa de mejora que se desarrolla actualmente en el IVIA. El objetivo principal de la tesis es la puesta a punto de las técnicas moleculares para la especie albaricoquero y la obtención de marcadores que permitan simplificar y ayudar en la selección de indiviudos procedentes del programa de mejora del IVIA. Para ello se han utilizado los marcadores moleculares que se han definido útiles en los procesos de selección en programas de mejora: RFLPs (Restriction Fragment Lenght Polimorphism), RAPDs (Random Amplified Polimorphic DNA) y AFLPs (Amlified Fragment Length Polimorphism). Con ellos se ha realizado un estudio de diversidad genética, utilizando 16 variedades de albaricoquero procedentes de Francia, España y Norteamérica, que incluyen variedades resistentes y susceptibles a Sharka. Algunas de ellas se están utilizando como genitores en el programa de mejora del IVIA. Se ha elaborado el primer mapa genómico de la especie albricoquero, basado en los marcadores moleculares RAPDs y AFLPs. Se ha estudiado la herencia del carácter resistencia a Sharka y se ha establecido la hipótesis de herencia basaa en 2 genes independientes. Con el fin de obtener marcadores moelculares ligados a los caracteres auto incompatibilidad y androesterilidad en albaricoquero, se ha utilizado la técnica del Bulk Segregation Analysis (BSA) combinado con marcadores tipo RAPD.

Autor: PEREZ BARBACHANO RAQUEL.
Año: 1999.
Universidad: NAVARRA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE NAVARRA.

Resumen: La administraciónde dosis bajas de IGF-I tiene un efecto hepatoprotector en la cirrosis hepática (CH) experimental inducida por CCl4. Este efecto podría estar relacionado con mecanismos de protección de la mitocondria. Por ello, los objetivos fueron: 1)Caracterizar la disfunción mitocondrial en la CH,2) Confirmar y estudiar en que consiste el efecto de IGF-I sobre la funcion mitocondrial. Se utilizaron 5 grupos de animales, CO(Controles sanos), CO+IGF-I (Controles tratados con IGF-I),CO+F (Controles que recibieron fenobarbital), CI (Animales con una cirrosis compensada) y CI+IGF-I (Cirróticas, que recibieron IGF-I a dosis de 2ug/100pc/dia). Antes del inicio del tratamiento se confirmo, analiticamente, que no existian diferencias entre los dos grupos de animales cirróticos. La función mitocondrial se evaluó mediante citometría de flujo con Rodamina-123,y se encontró una disminución del potencial de membrana, que se verificó en el estado 3 y 4, en los animales cirróticos, que se normalizó con el tratamiento. La cantidad de H2O2, (medida con CMXRos H2) aumentó significativamente en el grupo CI y revirtió en el grupo CI+IGF-I. La peroxidación de los lípidos en la membrana aumentó en los dos grupos cirróticos, ya que, aumentó el porcentaje de lípidos polares, medido con el fluorocromo rojo nilo. El contenido de la cardiolipina(CL) fue mayor en el grupo CI y se normalizó con el tratamiento. Los complejos I y III, de la cadena transportadora, incrementarion su actividad en los dos grupos de animales cirroticos, particularmente significativo fue el aumento del Complejo I en el grupo CI+IGF-I. La ATPasa disminuyó su actividad en el grupo CI y recuperó su actividad hasta valores semejantes a los controles en el grupo tratado con IGF-I. Las enzimas antioxidantes, PLA2,PHGPx y G6PDH, aumentaron su actividad en los dos grupos cirroticos. IGF-I incrementó la actividad, aunque no significativamente, de todo los complejos de la cadena transportadora de electrones,sobre controles sanos (CO+IGF). La disfunción, en este modelo se caracteriza por una caida de potencial de membrana y un aumento de la producción de radicales libres. El incremento de CL, por un mecanismo de defensa, no resulta eficaz debido a la peroxidación de la membrana. Los complejos incrementan su actividad in vitro, como mecanismo de adaptación ante la disfunción que ocurre in vivo,además la ATPasa disminuye su actividad y aumenta la actividad de las enzimas antioxidantes. El efecto del tratamiento con IGF-I incide en un incremento del complejo I, y de la ATPasa. Por ello logra recuperar el potencial de membrana y reducir la fuente de radicales libres intramitocondrial.

Autor: VILLAR RAMOS ANA VICTORIA.
Año: 1999.
Universidad: PAIS VASCO.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: Esta tesis doctoral comprende un estudio exhaustivo sobre el comportamiento de importantes fosfolipasas reguladoras de la transducción de señales celulares. Estos estudios se han realizado en membranas modelos diseñadas artificialmente. En conteto, se han estudiado los factores que regulan las actividades de las fosfolipasas específicas de fosfatidilinositol (PI-PLC) y de glicosilfosfatidilglicanos (GPI-PLC), asi como de la fosfolipasa D específica de GPI (GPI-PLC). Se ha demostrado que la PI-PLC es un enzima muy sensible al radio de curvatura de las membranas y que su actividad esta estrechamente controladas por la presencia de determinados lípidos distintos del sustrato. Una de las observaciones más importantes es que la PI-PLC, vía producción de diacilglicerol, induce la fusión de vesículas fosfolipídicas, lo cual indica que puede ser un enzima importante en la regulación de procesos fisiológicos que implican fusión de membranas tales como la fecundación o la neurotransmisión, o de procesos patológicos, como la infección vírica. También se ha demostrado que el GPI incorporado asimétricamente en membranas modelo sirve como sustrato a los enximas PI-*PLC, GPI-PLC y GPI-PLD, lo que podría tener consecuencias fisiológicas muy importantes. Además de estas observaciones se han desarrollado métodos analíticos importantes para la distitnción entre los procesos de hemifusión y fusión verdadera de membranas, así como para la obtención de inositol fosfoglicano IPG. El IPG es importante por sus propiedades insulinomiméticas, y por lo tanto por su potencial terapéutico en procesos diabétidcos. La obtención de IPG se realiza tradicionalmente de manera muy costosa a partir del hígado de animales. Sin embargo, en esta tesis se ha desarrollado un nuevo método que permite la producción de IPG a partir de su precursor GPI incorporado a la cara externa de liposomas artiticiales. Sin lugar a dudas, esta nueva tecnología podría sustituir a los métodos tradicionales utilizados hasta ahora. Por último, pero no menos importante, ha sido el diseño de membrnas modelo asimétricas con características similares a las caveolares de la membrana celular. Este es posiblemente un avance importante porque permite estudiar el comportamiento de enzimas que están específicamente localizados o son particularmente abundantes en este tipo de estructuras.

Autor: MURO GALINDO SILVIA.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGIA MOLECULAR.

Resumen: La acidemia propiónica, uno de los errores congénitos más frecuentes del metabolismo de ácidos orgánicos en humanos, está causada por la deficiencia del enzima mitocondrial propionil-CoA carboxilasa. Éste es un exnima heteropolimérico, estando constituido por dos tipos de subuniddes diferenes, a-y b-PCC, codificadas por los genes PCCA y PCCB respectivamente. En este trabajo se ha abordado el estudido de las bases moleculares de esta enfermedad, caracerizando, en primer lugar, la estrucutra del gen PCCB, en su región codificante, indentificándose los límites entre los diferentes exones e intrones y permitiendo el diseño de oligonucleótidos intrónicos facilitando así el análisis genético de los pacientes. El estudio mutacional realizado ha permitido la indentificaicón de un total de 25 mutaciones diferentes entre los 47 pacientes analizados, lo que supone el 98% de los 80 alelos independientes estudiados, 21 de las cuales son mutaciones nuevas, no descritas anteriormente. Asimismo, se ha llevado a cabo la caracterizaicón del efecto de las mutaciones identificadas utilizando diferentes aproximaciones experimentales. Los ensayos de Northern y Western blot han permitido conocer el efecto de estos cambios sobre el mRNA y proteína B-PCC habiéndose estudiado, adicionalmente la síntesis y estabiliad in vitro de péptidos mutantes, su afectación sobre los procesos de importació ny procesamiento intramitocondrial, plegamiento y ensemblaje de las subunidades B-PPC. Por último, los datos experimentales, junto con la información obtenida acerca del diagnóstico, clínica y seguimiento de estos pacientes, han permitido analizar la asociación entre la naturaleza de los cambios encontrados y la severidad de la enfermedad, lo que revela una clara asociación de ciertas mutaciones con fenotipos severos, mientras que otras estána sociadas a una sintomatología más suave.

Autor: ESPADA REGALADO JESUS.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: El complejo cacherina E/cateninas se encuentra frecuentemente desorganizado en carcinomas, pero los mecanismos subyacentes a esta perdida funcional no estan bien caracterizados. Mas aun, la B catenina, es un componente del complejo achetina E/cateninas que tambien particia en la transduccion de la señal de Wnt, que esta alterada en muchas lineas celulares tumorales y canceres humanos. Ademas, la activacion del oncogen H-Ras es un suceso temprano en la progresion tumoral durante la carcinogenesis en piel de raton. En este contexto, el efecto de la activacion oncogénica de H-Ras se ha estudiado en queratinocitos epidermicos murinos, utilizando una combinacion de tecnicas de microinyección de H-V12Ras y analisis bioquimico de queratinocitos que expresan establemente H-V12Ras. La microinyeccion de H-V12Ras en queratinocitos murinos promueve la perdida de cadherina E y a catenina de las regiones de contacto celula-celula y la relocalización citoplasmática y nuclear de la Bcatenina. Estos efectos dependen de la actividad dela PI3K. En el mismo sentido, la expresión de H-V12Ras en queratinocitos induce la solubilización de los componentes del completo cadherina E/cateninas, aunque sin alterar el contenido de P-Tyr de estas proteinas. Interesantemente, existe una interaccion "in vivo" de la B catenina con las dos subunidades de la PI13K, p85a y p110a, fuertemente inducida por la sobreexpresión de H-V12Ras, asi como una interaccion directa "in vitro" de la B catenina con la p85a. Mas aun, la sobreexprsion tanto de H-V12Ras como de una forma constitutivamente de la P13K es suficiente para estabilizar metabólicamente a la B catenina y promover su acumulacion citoplasmatica y nuclear. La fosforilacion "in vivo" de la B catenina esta fuertemente disminuida en queratinocitos que expresan H-V12Ras, afectando fundamentalmente el contenido en P-Ser. Ademas, la interaccion de la B catenina con la proteina APC esta bloqueada en celulas que expresan H-V12Ras, aunque no existen cambios en la actividad de la quinasa GSK3B. El factor de crecimiento TGFB promueve la activacion de H-Ras en queratinocitos murinos. Interesantemente, las celulas tratadas con este factor tambien muestran la desorganizacion del complejo cadherina E/cateninas, la acumulación citoplasmática de la B catenina y el bloqueo de la interacción B catenina/APC. Estos resultados indican que la activación de H-Ras esta implicada causalmente en la desorgaizacion del complejo cadherina E/cateninas y promueve la relocalización y estabilización citoplasmatica de la B catenina, a traves de un mecanismo que implica su defosforilación y perdida de interaccion con APC y una nueva interaccion con APC y una nueva interaccion con la PI3K.

Autor: BONILLA GONZÁLEZ EDMUNDO.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE INVESTIGACIÓN BIOLÓGICAS.

Resumen: Se analizan los cambios en la expresión génica en oocitos de ratón cultivados in vitro en concidiones normales, o tras la exposición a los agentes adriamicina (antineoplásico), etil-nitrosourea (agente mutagénico) o monoetil hexil ftalato (empleado enla fabricación de plásticos). Los resultados obtendios muestran que adriamicina, ENU y el ftalato afectan la variabilidad de los cultivos de oocitos fetales.Estos agentes han mostrado alterar la regulación de genes que codifican para: 1,- Proteínas de la cadena respiratroia mitocondrial NADH deshidrogenasa, citocrmo o oxidasa. 2,- Enzimas que participan en la eliminación de radicales libres (superóxido dismutasa). 3,- Proteínas asociadas al transporte de moléculas (metaxina y sintaxina). 4,- Enzimas que participan en la transcripción y el metabolismo celular (RNA polimerasa II, adenosil metionina sintetasa). Por medio de transfecciones transitorias se ha determinado que las modificaciones en la expresión de algunos de estos genes están generadas por la acción de los agentes sobre sus regiones promotores, lo que representa una aproximación a la construcción de modelos celulares in vitro de toxicidad en células germinales.

Autor: PEREZ MAROTO M. TERESA.
Año: 1999.
Universidad: ALCALA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: Uno de los objetivos prioritarios de la investigacion sanitaria actual es la busqueda de nuevos sistemas de administracion de farmacos que permitan una liberacion controlada y selectiva de los mismos. En esta tesis se han utilizado los eritrocitos como portadores de principios activos, empleando la dialisis hipotonica-isotonica como tecnica que permite la incorporacion de sustancias mediante la apertura transitoria de poros en la membrana. En primer lugar se estudiaron diferentes propiedades funcionales y estructurales de los eritrocitos a fin de comprobar si tales propiedades habian sido alteradas durante el proceso de dialisis hipotonica-isotonica. En relacion con las propiedades funcionales, se realizaron medidas de actividad piruvato quinasa, enzima relacionada con el metabolismo celular, y de parametros relacionados con la hemoglobina (hemoglobina corpuscular media, capacidad de la hemoglobina para transportar oxigeno, etc.). Para estudiar las alteraciones estructurales se utilizo la tecnica de reparto en sistemas bifásicos acuosos de polietilenglicol y dextrano, que detecta ligeras modificaciones en las propiedades superficiales de membrana. En segundo lugar se estudio el comportamiento in vivo de los eritrocitos de raton dializados y separados según la edad celular mediante la tecnica de distribucion en contracorriente en sistemas bifasicos acuosos(en base a la carga superficial) y mediante a tecnica de fraccionamiento en gradientes de densidad con Percoll (en base a la densidad celular). De esta forma se obtienen de eritrocitos portadores de diferente edad para controlar la liberacion de las sustancias encapsuladas en funcion de la vida media de los eritrocitos en circulacion. Finalmente, se modificó la superficie de los eritrocitos dializados con el fin de dirigirlos a organos diana. Para ello, se une transferrina a la superficie de los eritrocitos dializados, utilizando glutaraldehido como reactivo bifuncional, y se estudia el destino de los eritrocitos-transferrina a diferentes organos. Los eritrocitos-transferrina, son reconocidos en una mayor proporcion por celulas de medula osea, con receptores especificos para trasferrina. En resumen, los estudio realizados nos permiten seleccionar distintas poblaciones de eritrocitos portadores, con diferente comportamiento in vivo y diferente destino, para su administracion en funcion de las propiedades terapeuticas de las sustancias a encapsular.

Autor: PALACIOS MORENO JUAN MANUEL.
Año: 1999.
Universidad: ALCALA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: ISMB, AARHUS UNIVERSITY, AARHUS, DENMARK.

Resumen: La iniciación de la síntesis de proteínas en Eschertichia coli está promovida y regualada por tres proteínas denomiadas factores de iniciación 1,2 y 3. El factor de iniciación 2 (IF2) es una proteían monomérica que, unida a GTP, promueve la unión específica del fMet-tRNAf al ribosoma durante la formación del complejo de iniciación. IF2 está expresado e nE. Coli en tres isoformas denomiadas IF2a, IF2b e IF2y, todas ellas producto de la traducción secuencial del mismo gen, infB, con aparente idéntica funcionalidad. Este hecho junto con los resultados derivados de experimentos in vivo e in vitro con diversas formas mutantes de IF2, han permitido concluir que los centros catalíticos de IF2 se encuentran localizados en los dos tercios C-terminales dejando por una parte el extremo N-terminal funcionalmente sin caracterizar y por otra, la función de las diferentes formas de IF2 inexplicada. Un modelo estructural en seis dominios para el IF2a de E. Coli, es presentado en esta Tesis basado en observaciones procedentes de estudios funcionales,p redicciones de estructura secundaria y un mapa de epitopos superficiales, creado mediante la caracterización de doce regiones en la superficie de la estructura de IF2 reconocidas por diferentes anticuerpos monoclonales. Con el fin de poder caracterizar funcionalmente los diferentes dominios de IF2, hemos construido varios mutantes de deleción C-terminal y N-terminal, así como dominios aislados que han sido incluidos en diversos ensayados con ribosomas in vitro. En esta Tesis se presenta un modelo estructural de interacción entre IF2 y el ribosoma en el que IF2 es inicialmente reconocido por interacciones entre el extremo amino terminal y la subunidad ribosomal 30S estando además IF1 directamente involucrado. La consiguiente interacción con la subunidad 50S sucede a través del extremo amino terminal de IF2 así como del dominio de unión nucleotídica.el modelo en su conjunto propone una ampliación de la hipótesis recientemente propuesta para los factores de elongación, por la cual IF2, junto con IF1, ocuparían el espacio ribosomal destinado al A-tRNA, imitando su estructura terciaria. If2 ha sido también estudiado al margen de E. Coli mediante la secuenciación del gen infB en cuatro especies cercanas de Enterobacteria: Salmonella typhimurium. Klebsiella oxytoca, Enterobacter coacae y Proteuns vulgaris. Los resultados han servido para construir un filogrma y además confirmar que el proceso inusual de traduccion secuencial de diferentes formas de IF2 a partir de un mismo gen ha sido conservado en todas las especies estudiadas siendo adicionalmeten corroborado por ensayos inmunológicos. El análisis de las diferentes secuencias del gen infB ha permitido la creación de una hipótesis explicativa para un fenómeno tan extraño en bacterias.

Autor: GALÁN GARCÍA M. ALBA.
Año: 1999.
Universidad: ALCALA.
Centro de lectura: CIENCIAS .
Centro de realización: BIOLOGÍA CELULAR Y GENÉTICA. FACULTAD DE CIENCIAS UNIVERSIDAD DE ALCALÁ.

Resumen: En este trabajo se han analizado algunos de los factores posiblemente implicados en la regulación de la muerte celular en células leucémicas mieloides, como el factor de transcripción AP-1, la oxidación intracelular y distintas MAPKs. Como modelo celular se ha empleado la línea leucémica promonocítica humana U-937, y como inductores de murrte se han utilizado inductores de la respuesta de estrés como el cadmio, el calor y los rayos X,y ocasionalmente agentes antineplásicos como la camptotecina y el estopósido. Se ha demostrado que la activación Jun/AP-1 no es requerida para la generación de apoptosis por inductores de estrés y agentes antineoplásicos. Además, la actividaed Jun/AP-1 y la apoptosis no son fenómenos necesariamente acoplados. También se ha analizado que la oxidación intracelular no es un mediador universal de la generación de apoptosis por inductores de estrés y que la disminución de los niveles intracelulares de glutationpotencia selectivamente la toxidad del cloruro de cambio provocando un cambio en el tipo de muerte celular de apoptosis a necrosis. En relación con las MAPKs se ha demostrado que la regulación por p38 de la apoptosis inducida por cadmio es un evento altamente específico y temprano que posiblemente regula el disparo de la oxidación celular. Finalmente hemos probado que la inducción de la respuesta de estrés es compatible con la apoptosis pero no con la necrosis en célular tratadas con cadmio. La anulación de la respuesta de estrés durante la necrosis parece ser debida a la inhibición selectiva del procesamiento del factor de transcripción HSF1. Además, en este modelo celular la ocurrencia de diversos fenómenos durante la necrosis sugiere que este tipo de muerte puede ser un proceso activo que comparte alguno de los pasos reguladores de la muerte apoptótica.

Autor: LÓPEZ CASAS PEDRO PABLO.
Año: 1999.
Universidad: ALCALA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: DEPTO. BIOLOGÍA CELULAR Y GENÉTICA U. DE ALCALÁ.

Resumen: Las glándulas accesorias del macho de Dorsophila melanogaster, o Paragonias, son los órganos que producen el fluido seminal, el cual actúa a nivel del almacenamiento de los espermatozoides y el posterior uso que la hembra hace de ellos. Este trabajo aporta datos sobre un locus ligado al cromosoma X, que hemos llamado male-female-sterile in región 6E (mfs (1) 6E), cuya funcion se requiere para la producción de un fluidoseminal normal.Los machos mutantes para este locus producen espermatozoides móviles que son transferidos a la hembra durante le apareamiento pero estos no se almacenan. El análisis funcional del fluido seminal de los machos mutantes mfs(1)6E es difícil porque, como regla general, no se tranfiere a las hembras. Este problema se solucionó llevando a cabo un elevado número de cruces para generar suficientes hembras que almacenaran los espermatozoides de los machos mutantes. Esta hembras necesariamente habrían recibido fluidoseminal puesto que el almacenamiento de los espermatozoides lo requiere. El fluido seminal del macho mutante parece ser defectivo para llevar a cabo los cambios en el comportamiento (disminución de la receptividad a posteriores apareamientos) y fisiológicos (incremento en la puesta de huevos) que se observan en la hembra durante el primer día después del apareamiento. Las glándulas accesorias del macho mutante muestran claras anormalidades, principalmente en lo que concierne a la secrecion glandular, además de presentar diferencias cualitativas y cuantitativas en cuanto al contenido proteico. Demostramos que la movilidad de los espermatozoides en los órganos de almacenamiento de la hembra no es suficiente para el mantenimiento de los cambios fisiológicos y del comportamiento observados en las hembras apareadas, lo cual sugiere que se requiere algún otro componente del fluido seminal.