BIOQUIMICA MOLECULAR, 37

Autor: GOMEZ CAMARGO DORIS ESTHER.
Año: 1999.
Universidad: ALCALA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: La importancia del trabajo radica en la utilizacion de la biologia molecular como una herramieta alternativa para la identificacion de un microorganismo oportunista en este caso Pseudomonas aeruginosa. La utilizacion de la tecnica de PCR ha sido de mucha ayuda en la identificacion de ciertos microorganismos tales como el virus de HIV Escherichia coli. Etc. La utilizacion de la tecnica de RAPD fue muy interesante, porque a pesar de usar cebadores inespecificos, permitio discriminar genotipicamente entre cepas fenotipicamente muy similares, cuya diferencia es inadvertida usando ensayos bioquimicos clasicos. Los resultados obtenidos con los cebadores 7,11,15 y 18 son de gran ayuda en la discrimnacion de Pseudomonas aeroginosa. Utilizando estos cebadores se ha podido determinar que un brote de infecciones causadas por Pseudomonas aeruginosa no procede de la misma cepa ya que en 17 casos analizados de la primera infeccion se encuentra 14 cepas diferentes. El estudio epidemiológico de estos casos ha permitido identificar una fuente nosocomial comun para algunos de ellos, y el origen de las cepas causantes delas reinfecciones consecutivas en varios pacientes. Sin duda, esto sera de relevancia en futuros estudios epidemiologicos a nivel molecular. Por otra parte los ensayos con el cebador 5 nos permiten diferenciar genero y especie de Pseudomonas aeruginosa de otras bacterias ya que reconoce ciertas secuencias especficas de Pseudomona aeruginosa, que se podrian utilizar para el desarrollo fuuro de nuevos cebadores dirigidos contra secuencias especificas de este genero y especie. Todo lo anterior se ajusta a los objetivos planteados al iniciar el proyecto.

Autor: LUCAS PARRAS LUISA.
Año: 1999.
Universidad: ALCALA.
Centro de lectura: FARMACIA .
Centro de realización: INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS.

Resumen: La fosfolipasa D es una molécula clave en el metabolismo lipidico y en la generación de segundos mensajeros que controlan el crecimiento celular. Trabajos recientes de nuestro grupo demuestran que la proteína Ras oncogénica participa en la regulación de la PLD por dos mecanismso alternativos: uno dependiente de factores de crecimiento que implica una atenuación en la respuesta a PLD en donde se ha visto está implicada la PI-PLCgamma. Otro dependiente de PKC dándose un sinergismo entre Tas oncogéncio y ésteres de forbol. En el presente estudio nos planteamos ver la regulación de la PLD en condiciones fisiológicas tratando de determinar qué efectores están implicados en esta regulación. De forma paralela quisimos determinar qué efectores de la proteína Ras estaban implicados en la regulación de la PLD en condicioens oncogénicas. Para finalizar, estudiamos los efectos que la hexadecilfosforilcolina, antitumoral perteneciente a la familia de alquilfosfolípidos, tenía sobre la PLD.

Autor: ROBREDO VALGAÓN BEATRIZ.
Año: 1999.
Universidad: LA RIOJA.
Centro de lectura: ENSEÑANZAS CIENTÍFICAS Y TÉCNICAS.
Centro de realización: CETNRO CIENTÍFICO TECNICO.

Resumen: Estudio de la influencia que ejerce el consumo de antibióticos (Avoparcina,tilosina y virginiamicina) como promotores del crecimiento en animales (pollos fundamentalmente), en la selección de resistencias a glicopéptidos y antibióticos macrolidos-lincosamidas-estreptograminas (MKLS) en cepas de Enterococcus de la flora intestinal de dichos animales y su posterior diseminación medioambiental.Se constata la colonización intestinal por Enterococcus vanA (resistentes al antibióitco y vancomicina) durante el periodo de utilización de la avoparcian como promotor del crecimiento, disminuyendo elporcentaje de cpeas resistentes una vez que se elimina el consumo de avoparcina como promotor del crecimiento. Se encuentra, asimismo, una gran diseminación de cepas de Enterococcus vanA en animales, alimentos y humanos. Se concluye que las mismas cepas de Enterococcus vanA pueden colonizar el intestino humano y animal, indicando con ello que la cadena alimentaria puede ser una importante vía de transmisión de cepas resistentes a los antibióticos; asimismo se detecta una escasa heterogeneidad del transposón Tn1546 entre las distintas cepas, indicando la posibilidad de transmisión horizontal de los determinantes génicos de resitencia.Se estudia la resistencia múltiple a distintos tipos de antibióticos (MLS, aminoglucósidos, glicopéptidos y B-lactámicos) de las cepas de Enterococcus vanA así como los determianntes géncios responsables de dichas resistencias. Finalmente, se valoran métodos moleculares de identificación de ciertas especies de Enterococcus, en especial E. Hirae y E. Durans, que presentan serios problemas de identificación mediante métodos bioquímcos,y se presenta una alternativa práctica mediante marcadores génicos que permiten la identificación rápida y precisa de dichas especies de Enterococcus.

Autor: GARMA LÓPEZ CARMEN.
Año: 1999.
Universidad: SAN PABLO CEU.
Centro de lectura: CIENCIAS EXPERIMENTALES Y TÉCNICAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS EXPERIMENTALES Y TÉCNICAS.

Resumen: En este trabajo se lleva a cabo un estudio de la vitelina y sus genes en varias especies de Acridoidea. En la primera parte de este trabajo se ha realizado un estudio de la vitelina en veintitrés especies de saltamontes, pertenecientes a distintas subfamilias, mediante electroforesis en geles de poliacrilamina. Se ha detectado variabilidad intraespecífica en Eyprepocnemis plorans y Chorthippus parallelus. El patrón típico de cada una de las especies se ve poco alterado y la restringida localización de las poblaciones polimórficas sugiere un origen reciente para esta variabilidad. no obstante la divergencia observada hace que la comparación de los patrones electroforéticos no sirva para establecer relaciones filogenéticas aunque sí para marcar diferencias entre especies muy próximas. En la segunda parte del estudio se aborda la secuencia de segmentos concretos de los loci vilelina, con el objetivo de conocer sus carcterísticas evolutivas. Los resultados obtenidos revelan la existencia tanto de características constantes, como de profundas reordenaciones.

Autor: GARCIA TRAMONTIN KERELY ELENA.
Año: 1999.
Universidad: BURGOS.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: La presencia de sustancias pecticas en las frutas origina importantes problemas en su procesado industrial para la obtencion de zumo, debido a que retienen parte del zumo durante el prensado de la fruta, aumentando considerablemente su viscosidad y disminuyendo asi el rendimiento de la extraccion. El desarrollo de la tecnologia enzimatica ha permitido la preparacion de enzimas pectinoliticas inmovilizadas que pueden utilizarse repetidamente en operaciones simultaneas o de manera continuada, capaces de degradar estas sustancias pecticas. Con estas perspectvas, el objetivo principal en este trabajo fue la preparacion de enzimas pectinoliticas estables,mediante tecnicas de inmovilizacion por adsorcion en geles de alginato de calcio, estudiando las caracteristicas de los biocatalizadores inmovilizados en comparacion con sus contrapartidas solubles, con objeto de mejorar y facilitar el uso de estas enzimas en los procesos de clarificacion de zumos de platano y de kiwi, estudiando ademas la posibilidad de reutilizacion de las enzimas. En relacion a los principales resultados obtenidos al determinar las actividades enzimaticas de poliglacturonasa (PG), pectina liasa(PL) y endopectinasa (endoP), obtenidas de preparados comerciales (Rapidase C80, Biopectinase CCM, Pectinex 3XL y Grindamyl 3PA,se puede concluir que: (i) cuando se inmovilizaban las pectinasas sobre geles de alginato, la PL y endoP de Rapidase C80 presentaban los niveles mas elevados de actividad en los inmovilizados (7,2% y 12,5% de inmovilizacion, respectivamente), mientras que el mayor nivel de inmovilizacion de PG(25%) se obtuvo con Pectinex 3XL. (ii)La aplicación de las enzimas a un biorreactor, que contenia una solucion de pectina, confiraba su idoneidad para reducir la viscosidad de la solucion. Como tendencia general la eficacia de las enzimas inmovilizadas seguia el siguiente orden descendente: Rapidase>Biopectinase >Grindamyl>Pectinex. (iii) La regeneracion de las perlas de alginato con Cl2Ca ysu reactivacion con una nueva solucion de enzima, permitia reciclar el mismo inmovilizado cinco veces consecutivas. Al aumentar la concentracion enzimatica, se reducian los tiempos de tratamiento y, con ellos, la inestibilidad de las enzimas inmovilizadas, lo que aumentaba la operatividad del reciclado hasta ocho reutilizaciones. (iv) La posibilidad de reutilizacion de las enzimas inmovilizadas en los zumos de platano y kiwi se veia limitada a tres, como consecuencia directa de la desestabilizacion del soporte de inmovilizacion por efecto de los componentes del zumo, lo cual podia reducirse o anularse modificando el soporte de inmovilizacion aplicado. (v) Por ultimo, con vistas a la aplicación biotecnologica de ese estudio, podria concluirse que la inmovilizacion de enzimas pectinoliticas sobre geles de alginato de calcio optimiza la estabilidad operacional de las enzimas y permite su reutilizacion. Reduciendo los costes finales del proceso sin perdida apreciable de la calidad y cualidades organolepticas de los zumos tratados.

Autor: ROVIRA DE MIGUEL JOSÉ CARLOS.
Año: 1999.
Universidad: MIGUEL HERNANDEZ.
Centro de lectura: MEDICINA .
Centro de realización: INSTITUTO DE NEUROCIENCAS.

Resumen: El presente trabajo aborda el estudio de la función del apartato 268 en los mecanismos de compuerta de los receptores nicotínicos neuronales alfa 3 y beta 4. Para ello se utilizan técnicas de biología molecular para la expresión de eceptroes quiméricos en ovocitos de xenoais larvi 5, los cuales se comparan con los receptores nativos expresados en el mismo sistema heterólogo. Los receptores expresados se analizan con técnicas electrofisiológicas (fijación de voltaje de doble electrodo y canal aislado) y los resultados obtendios se razonan proponiendo modelos cinéticos secuenciales y alostéricos, determinando la función del aspartato 268 en los mecanismos de compuerta.

Autor: BARRACHINA CASTILLO MARTA.
Año: 1999.
Universidad: BARCELONA .
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGIA .

Resumen: El complejo principal de histocompatibilidad de clase II (MHC II) juega un papel importante en la respuesta inmunitoria. Estas moléculas presentan los peptidos procedentes de antígenos externos, que han sido previamente procesados, a los linfocitos T. Se ha descrito que la intensidad de la respuesta inmunitaria se correlaciona cuantitativamente con la presentación de antígeno. Por ello, las moleculas del MHC de clase II juegan un papel importante en el sistema inmunitario. Los genes de clase II en el raton se encuentran englobados en las regiones I-A e I-E. En este trabajo, como modelo de estudio de la expresión de los genes de clase II hemos utilizado los genes I-A. Las moléculas I-A son unos glucoproteínas formadas por las cadenas a y B. La expresión de ambas cadenas han sido estudiadas en este trabajo en los linfocitos B y en los macrófagos tras la estimulación con interferón gamma (IFNy) y lipopoliacarido o LPS. Los macrofagos se caracterizan por no expresar I-A en la superficie celular en condiciones basales, mientras que los linfocitos B expresan I-A constitutivamente. En esta tesis hemos visto que en los linfocitos b, el IFNy incrementa la expresion de I-A en la superficie celular incrementando la traduccion de I-Aa sin incrementar la transcripción y la traducción de las cadenas I-Aa e I-AB. Esta es la primera vez que se describe que esta citocina, secretada por los linfocitos T, actua a nivel de la traducción de los genes de clase II. El LPS es un componente de la pared bacteriana de las bacterias Gram negativas. Hemos detectado que incrementa la expresión en la superficie celular de los linfocitos B incrementado la transcripcion de las cadenas I-Aa e I-AB y la traducción de la cadena a. Dado que estos resultados nos mostraban que la regulación transcripcional era un punto importante en la regulacion de la expresión de los genes de clase II, estudiamos este punto utilizando como modelo el promotor del gen I-AB. En concreto, estudiamos el papel de la región distal, la cual ha sido muy poco estudiada. Presenta los elementos W´, X´ e Y´ que son homólogos en secuencia a los de la región proximal del inicio de transcripcion pero su posición y orientación son inversas. Mediante una serie de transfecciones transitorias del promotor así como una serie de delecciones del mismo, clonadas sobre el gen de la luciferasa como gen indicador de la actividad promotora, hemos observado que la región distal ejerce un control represor sobre la transcripción de clase II inducida por el IFNy, la constitutiva y la incrementada por el LPS. Postulamos que la región distal ejerce un control represor sobre la transcripcion de clase II inducida por el IFNy, la constitutiva y la incrementada por el LPS. Postulamos que la región distal ejerce un control regresor sobre la región proximal mediante la formación de una estructura de horquilla, de tal manera que en condiciones basales no hay trascripcion. En presencia del IFNy, se induciría el CIITA (transactivador de clase II, es necesario para la expresión de clase II) el cual abriría una estructura permitiendo la transcripción. Este modelo seria el presente de los linfocitos B, dado que expresen CIITA constitutivamente. Tambien hemos detectado que el LPS nos incrementa la expresión de clase II en los linfocitos B incrementando la expresion de CIITA y como posible elemento de respuesta al LPS parece jugar un papel la secuencia AP-1 situada a 5´de la región distal.

Autor: MARTIN SAUTE MIREIA.
Año: 1999.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: BIOLOGIA .
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGIA.

Resumen: La metástasis es un proceso histopatológico especialmente complejo para ser estudiado. Esta complejidad se deriva tanto de la implicación de todos los niveles de organización del organismo afectado (molecular, celular, tisular, orgánico y sistématico) como de la alta diversidad inherentea cada uno de ellos. Una herramienta esencial de trabajo es la disposición de modelos celulares que permitan tanto el estudio especifico y puntual de algunos aspectos del desarrollo de la patologia como su integración en el conjunto del proceso. Para el desarrollo de este estudio hemos dispuesto de dos líneas celulares de adenocarcinoma de pulmón humano derivados de una misma población parental (Infusa el al, 1991). Estas lineas, caracterizadas por una alta (HAL-8) y nula (HAL-24) capacidad metastásica, proporcionan un modelo muy sólido para la validación de resultados diferenciales. Como objetivo general nos planteamos la caracterización de expresiones diferenciales que, de manera constitutiva o regulada, presentaran los dos tipos celulares. Hemos demostrado el papel clave del oligosacárido sialil-Lewis x en la adhesión de las celulas metastaticas HAL-8 al endotelio así como la relación entre la expresión de los genes de las Fucosiltranferasas del tipo alfa(1,3) y la capacidad metastática de esta células. Asimismo se ha analizado el papel de las metaloproteasas de matriz en la migración transendotelial de las células metastaticas, demostrando la implicación de diferentes componentes de la matriz extracelular y de sus receptores, las integrinas, en la regulación de esta actividad proteolítica. Como último objetivo de este trabajo, se ha analizado la expresión génica diferencial de las células HAL-8 y HAL-24 mediante la tecnica del differenctial display, reforzando con nuestros resultados, la hipótesis del carácter multigénico del desarrollo de las metástasis.

Autor: BRUN LOZANO SONIA.
Año: 1999.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: BIOLOGIA .
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGIA.

Resumen: Esta tesis se divide en dos bloques: 1.Estudio de la expresión génica de los receptores de retinoides en tejido adiposo marrón durante el desarrollo: El patrón de expresión de los receptores de retinoides en tejido adiposo marrón es opuesto al de tejido adiposo blanco, y se mantiene entre especies de mamiferos distantes filogeneticamente. Durante la diferenciación a adipocitos marrones se detecta una disminución de los subtipos de receptores RARa,B y Y un aumento de RXRa, B y Y. En el adipocito diferenciado RARB y RXRy se inducen por all-trans retinoico sugiriendo que podrian adquirir un papel de amplificacion de la respuesta del gen UCP-1 al acido retinoico. En el periodo fetal, anteriormente a la inducción del gen UCP-1, ya se detecta expresión de los receptores RARa, RARB y RXRa, considerados los más eficientes en la respuesta del promotor del gen UCP-1 por ácido retinoico. Asi, se sugiere que el acido retinoico podria participar en la diferenciación fetal adipocitaria. 2. Estudio de los cambios de expresión génica durante el desarrollo: Mientras que en el músculo esquelético y en tejido adiposo marrón UCP-2 ya se detecta en el periodo fetal, UCP-3 se induce despues del nacimiento. En musculo, la inducción postnatal de UCP-3 depende del inicio de la lactancia, concretamente de la ingesta de lipidos. La expresión de UCP-3 viene modulada en función de la disponibilidad de acidos grasos libres circulantes, sea cual sea su origen: absorción intestinal (diferentes dietas) o lipolisis en tejido adiposo blanco (ayuno), y esta regulada por activadores de PPARa.

Autor: CAMPALANS ISCLA ANNA.
Año: 1999.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGIA (UB).

Resumen: España es el segundo productor mundial de almendra y la producción está principalmente limitada por factores ambientales adversos como son las bajas temperaturas durante el periodo de floración y la falta de agua durante el ciclo vegetativo del arbol. Es por tanto de gran interés estudiar la respuesta del almendro a la falta de agua, asi pues el objetivo de esta tesis doctoral ha sido la identificación de genes que se inducen durante una situación de sequia en el almendro. Como modelo de estudio se ha utilizado principalmente el desarrollo embrionario ya que el embrión maduro es un tejido muy bien adaptado a la desecación y muchos de los genes que se inducen durante las últimas etapas de la embriogenesis son tambien inducibles en tejido vegetativo durante la deshidratación. Mediante análisis por electroforesis bidimensional de las proteinas acumuladas en el embrion maduro respeto a embriones en estadios más prematuros del desarrollo se han identificado unos diez polipéptidos que se acumulan específicamente en el embrión maduro y que por tato pueden participar en el proceso de tolerancia del embrión a la desecación. Un grupo de proteinas que se acumula de forma muy abundante en las etapas tardías del desarrollo embrionario son las proteinas LEA (Late Embrygonesis Abundant), en este trabajo se han identificado y caracterizado dos genes que codifican para proteinas LEA, que han sido llamados Parab21(Grupo 2) y Parab27(Grupo 5) por Prunus amygdalus responsive to ABA, 21 y 27 corresponden al peso molecular teórico deducido a partir de la sequencia de aminoácidos. El uso de anticuerpos obtenidos contra las proteinas homólogas de maiz Rab17 y Rab28 han permitido caracterizar el patrón de acumulación de estas proteinas en almendro. Mediante la aplicación de la tecnica de expresión diferencal cDNA-AFLP, se han aislado y caracterizado genes que se inducen durante el proceso de deshidratación en almendro (ya sea en el embrión maduro, como en plántulas de almendro cultivadas in vitro y sometidas a diferentes tratamientos de estrés). En concreto podemos destacar los genes que codifican para: una proteasa de cisteina, un transportador de aminoácidos, una enzima implicada en la sintesis de triacigliceridos una proteina inducible por choque térmico de bajo peso molecular, y una proteina rica en prolina. Todos los genes identificados en este estudio han sido localizados en el mapa genetido del genero Prunus con el objetivo para poder ser utilizados como marcadores moleculares en la obtención de futuras variedades de almendro más resistentes a la sequía. Por último se ha comparado el patrón de expresión de estos genes en distintas variedades de almendro con diferentes grados de tolerancia a la sequia.

Autor: ESTEVEZ POVEDANA RAUL.
Año: 1999.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGIA.

Resumen: -LA MUTACION M467T Y M467K DEL GEN Rbat PRESENTE EN PACIENTES CISTINURICOS NO ES FUNCIONAL DEBIDO A UN PROBLEMA EN EL TRAFICO HACIA LA MEMBRANA PLASMATICA. -EL TRANSPORTADOR b o,+ FUNCIONA COMO UN INTERCAMBIADOR DE AMINOACIDOS CON ESTEQUIOMETRIA 1º1. EL TRANSPORTADOR y+L ES UN INTERCAMBIADOR DE AMINOACIDOS ASIMETRICO, SOLO PERMITIENDO LA SALIDA DE AMINOACIDOS BASICOS. ASI SE EXPLICA LA REABSORCION RENAL DE ESTOS AMINOACIDOS Y LA CISTINA. -LOS TRANSPORTADORES b o,+ y Y+L FORMAN PARTE DE UNA FAMILIA DE TRANSPORTADORES HETEROMULTIMERICOS FORMADOS POR UNA SUBUNIDAD PESADA (4f2hc, BAT,) Y UNA LIGERA (y+LAT-1,LAT-1,,,) QUE INTERACCIONAN A TRAVES DE UN PUENTE DISULFURO. -LA MUTACION L334R ENCONTRADA EN UN PACIENTE ESPAÑOL CON LPI Y LA MUTACION VI70M ENCONTRADA EN UN PACIENTE JUDIO CON CISTINURIA DE TIPO NO-I PROVOCAN UN DEFECTO EN LA FUNCION DE LAS PROTEINAS y+LAT-1 Y Bo,+AT, RESPECTIVAMENTE . -SE HA IDENTIFICADO UNA NUEVA FAMILIA DE TRANSPORTADORES LISOSOMALES FORMADA POR LYCAT, LYMAT Y MTP. EN ESTA TESIS SE HA IMPLICADO AL TRANSPORTADOR LYCAT EN LA SINTESIS DE OXIDO NITRICO EN LOS MACROFAGOS.

Autor: VALERO GILS REBECA.
Año: 1999.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGIA.

Resumen: Los objetivos de esta tesis doctoral hacen referencia por un lado a la correlacion genotipo/fenotipo dentro del sindrome de Down y por el otro a la busqueda de genes de cromosoma 21. Correlacion genotipo/fenotipo: El análisis de dosis alélica de marcadores polimórficos ha permitido caracterizar, de forma precisa, las regiones cromosómicas implicadas en 5 trisomías y 3 monosomias parciales del cromosoma 21. Los resultados obtenidos ponen de manifiesto la variabilidad fenotípica de este sindrome. Individuos con regiones trisomicas pequeñas presentan mas rasgos fenotipicos de individuos con regiones trisomicas mas extensas. Los resultados obtenidos han permitido relocalizar las regiones cromosomicas implicadas en los rasgos fenotipicos: fisuras palpebrales dirigidas hacia arriba y paladar arqueado. El primero entre D21S19947 y GATA148F04 y el segundo, mas cerca de APP que de SOD1. Busqueda de genes en la región 21q11.2 USP25 es un nuevo gen de la region 21q11.2. Está formado por 25 exones que se extienden a lo largo de 150 kb y que codifican para una proteina de 1087 aminoácidos. USP25 presenta niveles bajos y ubicuos de expresion. La identificación y caracterizacion del homologo murino (mUSP25) ha permitido realizar experimentos de hibridación in situ que demuestran que el gen se expresa en las regiones proliferativas del cerebro fetal de ratón y en los espermatocitos primarios y secundarios del testículo de ratón. Existen, al menos, tres isoformas distintas de USP25 generadas por procesos de splicing alternativo. Una de estas isoformas es especifica de musculo y de corazon. USP25 es una proteina citoplasmatica de la familia de las UBPs(proteasas especificas de ubiquitina) que podria estar implicada en la patogenesis del sindrome de Down. La posterior identificacion y caracterizacion de USP28 sugiere que ambos genes, USP25 y USP28, formarian una nueva subfamilia de UBPs generada, probablemente, por duplicacion genica de un ancestro comun.

Autor: GORT MAS LAURA.
Año: 1999.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: INSTITUT DE BIOQUIMICA CLINICA.

Resumen: La mucopoliacaridosis I(MPS I), la mucopolisacaridosis II(MPS II)) y la leucodistrofia metacromatica (LDM) son tres enfermedades lisosomales hereditarias debidas a la deficiencia de un enzima lisosomal. Se han estudiado los genes que codifican para los enzima implicados en estas enfermedades en pacientes españoles. La MPS I es una enfermedad autosómica recesiva. Se han estudiado 27 pacientes españoles. Se ha identificado la mutación W402X en el 59.3% de los alelos MPS I, la mutacion P533R en el 9.3% y la mutación Q70X en el 7.4% de los alelos MPS I, la mutación P533R en el 9.3% y la mutación Q70X en el 7.4% de los alelos y un 63% de los genotipos. Los resultados en pacientes españoles refuerzan la correlación anteriormente observada entre tres mutaciones y la forma severa de la enfermedad. La MPS II es una enfermedad ligada al cromosoma X. Se han estudiado 36 pacientes españoles. El 11.1% de ellos presentan una gran delección o reordenamiento del gen. Este tipo de defecto está relacionado con la forma severa de la enfermedad. Cada uno del resto de los pacientes presenta una mutación puntual distinta, lo que indica una gran heterogeneidad genética en esta enfermedad. Esto dificulta mucho el análisis molecular, pero es la unica herramienta para el diagnostico de portadoras. La LDM es una enfermedad autosómica recesiva. Se han estudiado 20 pacientes españoles. Lamutación IVS2+1G--->A se ha identificado en un 25% de los alelos. Esta mutación esta asociada a la forma severa de la enfermedad. La mutación D255H se ha identificado en un 17.5% de los alelos y es la primera vez que se establece una asociación clara con la forma severa de la LDM. La mutación nueva T3271 esta en un 10 de los alelos. Por estudio de haplotipos se ha visto que estas tres mutaciones tienen un origen unico. Con estas tres mutaciones se cubre el 52.5% de los alelos mutados en la enfermedad.

Autor: GRANES SEGRET FRANCESC.
Año: 1999.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE BARCELONA.

Resumen: Se ha descrito que los proteoglicanos de heparán sulfato se asocian al citoesqueleto de actina. Sindecano-2 es un miembro de esta familia, expresado en fibroblastos, cuya interacción con el citoesqueleto no ha sido estudiada. Con el objetivo de estdiar las moleculas que pudieran mediar esta interación y la función de esta asociación se desarrolló un anticuerpo policlonal especifico contra sindecano-2 llamado B4. Con este anticuerpo se estudió la distribución subcelular de sindecano-2 endogeno y sobreexpresado en fibroblastos. Se observó que sindecano-2 codistibuye con los filamentos de actina en estructuras corticales de tipo microespina y en fibras de stress. La sobreexpresion de la molecula indució la elongacion de dichas microespinas a filopodios. Por truncación de los diferentes dominios de sindecano-2 se determinó que las cadenas que heparán sulfato y el dominio citoplasmático de sindecano-2 son imprescindibles para este efecto. La coexpresión de un dominante negativo de Cdc42(N17) bloqueó el efecto del sindecano-2. En el analisis de las proteinas coimmunoprecitadas con B4 se encontraron principalmente dos proteinas de 81 y 53 KDa. Utilizando anticuerpos contra los miembros de la familia ERM se determinó que ezrina y moesina se asocian a sindecano-2. La asociación es directa y implica la interacción de sindecano-2 con el citoesqueleto de actina. RhoA induce la interaccion de ezrina con sindecano-2 y de sindecano-2 con el citoesqueleto de actina. En conjunto los resultados sugieren que ezrina une sindecano-2 al citoesqueleto de actina con la regulacion de RhoA y que sindecano-2 induce cambios en el citoesqueleto de actina que conducen a la creación de estructuras caracteristicas de procesos de migracion celular.

Autor: BORRÁS RAMÍREZ EVA.
Año: 1999.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: QUÍMICA.
Centro de realización: FACULTAD QUÍMICA, UNIVERSIDAD DE BARCELONA.

Resumen: En esta tesis se ha abordado la reconstrucción de un sitio antigénico discontinuo, problema que se enmarca dentro de la química del reconocimiento molecular. En concreto, se ha llevado a cabo la mimetización funcional del sitio antigénico D del virus de la fiebre aftosa VFA a partir de la información inmunoquímica y estructural que lo definen. Dicha mimetización se ha planteado desde dos aproximaciones conceptuales diferentes. Mediante el diseño racional de construcciones peptídicas basadas en cálculos de dinámica molecular se han obtenido estructuras inmunogéncias. Es decir, dichas estructuras, en animales de laboratorio, han inducido una respuesta inmune que se dirige al VFA y específicamente al sitio antigénico D. Además los sueros anto-péptido son capaces de neutralizar la infectividad del virus. Por otro lado, a partir de una aproximación combinatoria, y más concretamente de la utilización de librerías peptídicas se han hallado estructuras antigénicas, esto es, capaces de interaccionar con los anticuerpos monoclonales antisitio D. Así pues, siguiendo dos aproximaciones distintas se ha consegudio emular hasta cierto grado tanto la actividad inmunogénica como la antigénica del sitio antigénico D de VFA.

Autor: MASGRAU JUANOLA ROSER.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y DE FORMACION CONTINUADA.

Resumen: La activación de la fosfolipasa C(PLC) es uno de los principales sistemas de señalización celular, pero debido a su complejidad e interrelación con otras vias de transducción de señales, como el Ca2+, aun se desconocen muchos aspectos de su regulación. En esta tesis se ha caracterizado, en primer lugar, la estimulación de la PLC por receptores acoplados a proteinas G, en un modelo neuronal: los cultivos primarios de neuronas granulares de cerebelo (CGC). Los resultados muestran que las respuestan inducidas por receptores acoplados a proteinas G presentan similitudes entre ellas pero tambien se diferecian en determinados aspectos. Asi mismo tambien sugieren la existencia de mecanismos complejos de regulacion de la activacion PLC por receptores muscarínicos de la acetilcolina y metabotropicos del glutamato (mGluR), el estudio de los cuales ha sido el principal objetivo de esta tesis doctoral. Los estudio sobre la regulación de la activación de la PLC por los receptores muscarinicos mostraron que esta respuesta depende del estado de llenado de los reservorios intracelulares de Ca2+ pero no de la concentracion de Ca2+ citoplasmatico. Estos resultados constituyen la primera evidencia experimental sobre la influencia de los reservoris intracelulares de Ca2+ en la activacion de la PLC. Desconocemos el mecanismo de esta modulación pero en este trabajo se demuestra que la estimulacion de los receptores muscarinicos induce una translocacióno del isoenzima PLCB1, y por tanto este isoenzima de la PLC podria participar en dicho mecanismo, siendo activado por los receptores muscarinicos y teniendo capacidad para detectar el contenido de Ca2+ de los reservorios intracelulares. Los resultados sobre los mecanismos de regulación de la PLC activada por la mGluR5 se expresan en CGC pero solamente el mGluR1 es responsable de la activación de la PLC y los señales de Ca2+ en cultivos de CGC maduros. La activación de la PLC por mGluR1, sin embargo, es regulada de distinta manera que las respuestas inducidas por los receptores muscarínicos. Así, se requiere la presencia de Ca2+ extracelular durante la estimulacion y cambos moderados en la concentración de Ca2+ citoplasmatico regulan esta respuesta. Una posibilidad para explicar la distinta modulacion de respuestas inducidas por receptores de la misma familia, seria que los receptores muscarinicos y mGluR, activaran distintas isoenzimas de la PLC, que a su vez podrian presentar distinta sensibilidad al Ca2+. En esta direccion apuntan los ultimos estudios de esta tesis doctoral que muestran que las CGC expresan las isoenzimas PLC-B1-4, PLC-y1, 2 y PLC- 1,2

Autor: RODRIGUEZ OSORIO CARLOS.
Año: 1999.
Universidad: SANTIAGO DE COMPOSTELA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.

Resumen: La pasteurelosis o pseudotuberculosis, es una enfermedad que causa importantes pérdidas económicas en la acuicultura marina mundial. La bacteria causante de esta enfermedad se denominó Pasteurella piscicida hasta 1995, momento en que se encontró que la secuencia del gen del rRNA 16S de esta bacteria era idéntica a la secuencia del mismo gen en la bacteria también marina Photobacterium dameselae (anteriormente denominada Vibrio damesela). A partir de entonces, estos dos microorganismos se consideraron miembros de la misma especie, y se reclasificaron como Ph. dameselae susp. piscida y Ph. danselae susp. damselae respectivamente. Sin embargo, estas dos bacterias muestran diferencias fenotípicas muy importantes, suficientes como para considerar a ambos microorganismos como dos entidades biológicos diferentes. Nuestros resultados han demostrado claramente que Photobacterium damselae subsp. pisicida y Ph, damselae subsp. damselae son, en efecto, miembros de la misma especie. Las respectivas secuencias de los tres genes ribosonales (16S, 23S y 5S) mostraron niveles de similaridad superiores al 99% entre las dos subespecies. Las regiones espaciadoras intergénicas ITS-1 (entre los genes 16S y 23S) e ITS-2 (entre los genes 23S y 5S), que supuestamente tienen una tasa de cambio nucleotídico más elevada que los genes ribosomales, mostraron asimismo pordentajes de similaridad del 98-99,5% entra las dos subespecies de Ph. damselae. Sin embargo, estas regiones genómicos mostraron una peculiar organización en estructura de mosaico, y parece que está teniendo lugar la génesis de heterogeneidad inter-subespecie en base a diferentes combinaciones de estas piezas de mosaico, generando versiones de estas regiones espaciadoras, diferentes entre una subespecie y la otra. El análisis del gen gyrB (que codifica para la subunidad B de la enzima DNA Girasa), en calidad de cronómetro molecular alternativo a los genes del rRNA, ha corroborado los resultados deducidos del análisis de la secuencia del operón ribosomal. Dos de las diferencias fenotípicas existentes entre las dos subespecies de Ph. dameselae han sido estudiadas a nivel del DNA. En primer lugar, hemos demostrado que las cepas de la subespecie damselae contiene el gen ureC, incluído en el operón ure que otorga la capacidad de hidrolizar la urea. En cambio, las cepas de la suespecie piscidia caracen de este gen, lo cual concuerda con su fenotipo ureasa. En segundo lugar, hemos demostrado que el fenotipo hemolítico de las cepas de las subespecie damselae no depende de la presencia del gen dly, que codifica para la damselina. Por lo tanto, se deduce que en algunas cepas hemolíticas de la subsp, damselae debe existir un gen codificante para una hemolisina por el momento desconocida. La secuencia nucleotídica de cuatro genes reguladores diferentes, toxR, rpoN, luxS y un activador sigma-54 dependiente, demuestra que las dos subespecies de Ph, damselae son dos entidades genéticas muy estrechamente relacionadas. Esta parte del estudio ha servido, además, para encontrar que el gen toxR puede llegar a convertirse en una herramienta taxonómica alternativa para la familia Vibrionaceae, así como para el diseño de cebadores para PCR, con especificidad de especie. Dos regiones variables en la secuencia del gen 16S se utilizaron como base para el diseño de cebadores para PCR específicos de Ph. damselae. Estos cebadores se aplicaron a la detección del agente causal de la pasteurelosis en cultivos bacterianos mixtos, así como en tejidos de pez, obteniéndose en éste último caso una sensibilidad de 10 elevado a 2 células por tubo de reacción de PCR. Además, se diseñó una reacción de Multiplex PCR basada en el uso de cebadores para los genes 16S y ureC, para eliminar la posibilidad de que un resultado positivo de PCR con los cebadores para el gen 16 S, se deba a la presencia de células de la subespecie danselae en la muestra, y no de la subespecie piscicida.

Autor: VIDAL SOTO RUBEN RODRIGO.
Año: 1999.
Universidad: SANTIAGO DE COMPOSTELA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.

Resumen: El género Merluccius es un grupo complejo de teleosteos que comprende 12 especies y al menos 2 subespecies con una distribución en los océanos Pacífico y Atlántico, incluyendo el mar Mediterráneo. Los estudios sobre la biogeografía y relaciones sistemáticas del género, se han basado principalmente en aproximaciones clásicas (osteológicas, merísticas y de polimorfismo enzimático), aisladas en el tiempo y utilizando en la gran mayoría de ellos sólo un reducido número del total de especies actualmente reconocidas. Asimismo los estudios sobre la estructura de población de algunas de las especies del género se han centrado principalmente en análisis ecológicos, pesqueros, y en un menor grado, polimorfismos aloenzimáticos. Los avances recientes en técnicas moleculares, tales como PCR y secuenciación automática, han permitido el desarrollo de nuevas aproximaciones de filogenia molecular y el nacimiento de nuevas disciplinas como la filogeografía, la cual sirve como puente entre estudios micro y macroevolutivos. Este tipo de aproximaciones, no sólo han probado ser de una gran utilidad para estudiar aspectos evolutivos, sino también para analizar estructuras poblaiconales. Análisis macroevolutivos de las relaciones fitogenéticas del género Merluccius, basados en las secuencias de la primera mitad de los genes mitocondriales de la región control (D-loop) y del citocromo b, resolvieron árboles congruentes con dos grupos evolutivos. Un grupo americano comprendiendo a las especies de merluzas con una distribución en el continente americano y otro euro-africano, comprendiendo a las especies con una distribución en el Atlántico este. Sin embargo las relaciones entre algunas especies del grupo americano no fueron estables, lo que puede ser consitente con una hipótesis de un rápido origen y radiación para estas especies. Los análisis microevolutivos de las especies de M. gayi y M. merluccius indicaron que no existe una clara estructura genética de las poblaciones analizadas, aunque sí un reducifo flujo génico entre las poblaciones sur y norte de M. gayi y Atlántico y Mediterráneo de M. merluccius. Asimismo la categoría de subespecies propuestas para estas especies no representaría una división evolutiva. Se discuten estos resultados en relación con anteriores investigaciones utilizando diferentes metodologías y estrategias disponibles para análisis de secuencias de ADN. Finalmente, se desarrolló una metodología para la identificación de especies de merluzas en tejidos frescos y procesados.

Autor: JIMÉNEZ CHILLARÓN JOSÉ CARLOS.
Año: 1999.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAD DE QUÍMICA Y FÍSICA UB.

Resumen: La transferencia génica de la glucoquinasa hepática (GK) mediante adenovirus recombinantes al músculo esquelético de ratas de la raza Wistar o de la raza ZDF in vivo provocó un aumento de la capacidad fosforiladora de la glucosa en los músculos transducidos. El aumento de la fosforilación supuso, a su vez, un incremento tanto de la captación de la glucosa como de su metabolización a través de la glucolisis. En las ratas Wistar, el aumento de la disponibilidad muscular de la glucosa mejoró la tolerancia en todo el organismo en condiciones de hiperglucemia e hiperinsulinemia sugiriendo que, bajo estas condiciones, la fosforilación de la glucosa deviene limitante para la captación de la glucosa. En las ratas ZDF se mejoró la sensibilidad muscular a la insulina durante un test de tolerancia a la insulina. En este segundo caso, de todas formas, la mejora no repercutió en la prevención de la aparición de la diabetes, características de los machos obesos. Tanto en ratones transgénicos para la amilina (hIAPP) como en ratones control (NT), el tratamiento con una dieta grasa durante 14 meses indujo resistencia a la insulina tanto en los machos como en las hembras. En cambio, la superposición de este tipo de dieta con la expresión de la amilina provocó intolerancia a la glucosa solamente en las hembras. La intolerancia en las hembras hIAPP parece estar relacionada con la falta de compensación de la disponibilidad muscular de la glucosa. Este hecho es independiente del desarrollo de depósitos pancreáticos de amiloide, que se produjeron mayoritariamente en los machos hIAPP. La transferencia del cDNA antisentido de la amilina de rata, mediante adenovirus, a islotes pancreáticos aislados en rata, provocó una reducción específica de los niveles de mRNA de la amilina, del contenido del péptido en el islote, y de su secreción basal. En cambio, la secreción de amilina estimulada por glucosa no se vio modificada. Tampoco se modificaron el contenido y la secreción de insulina. En conclusión, la reducción específica de la expresión y secrección de la amilina podría tener una aplicación potencial en el tratamiento de la diabetes de tipo 2.

Autor: CASERA SURRIBAS ANNA.
Año: 1999.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA, UNIVERSIDAD DE BARCELONA.

Resumen: Los peces carnívoros se muestran intolerantes a la glucosa, metabolizan los carbohidratos de forma más lenta y menos eficiente que los mamiferos y presentan un metabolismo encaminado a aprovechar las proteínas, abundantes en su dieta natural. La ausencia de glucoquinasa en hígado de peces carnívoros ha sido considerada una de las posibles causas de la intolerancia a la glucosa observada en estos organismos. En esta tesis, se describe la caracterización molecular de la glucoquinasa de hígado de gilthead sea bream(Sparus aurata), una especie de pez carnívoro conocido como dorada. El cDNA clonado incluye 2056 pares de bases y da lugar in vitro a la sintesis de una proteina de 54 kDa, con actividad glucoquinasa. La afinidad de la enzima presente en extractos crudos de higado de dorada en relación a la glucosa es 3 veces menor a la observada en la glucoquinasa hepática de rata. La actividad glucoquinasa detectada en hígado de dorada es inferior a la descrita en ratas alimentadas. La expresión génica de esta enzima en higado de dorada disminuye después de un ayuno prolongado e incrementa en condiciones de realimentación. Las dietas ricas en carbohidratos, así en carbohidratos, así como el aporte de cantidades crecientes de dieta incrementan también la expresión de la glucoquinasa, que muestra valores máximos de mensajeros y actividad 4-8 horas después de la ingesta de alimento. Adicionlamente, en este trabajo se describe la caracterización molecular de otras dos enzimas implicadas también en el metabolismo del os carbohidratos, la 6-fosfofructo-2-quinasa/fructosa-2,6-bisfosfatasa y la subunidad catalítica de la glucosa-6-fosfatasa de hígado de drada. El cDNA de la 6-fosfofructo-2-quinasa/fructosa-2,6-bisfosfatasa,enzima que intetiza y degrada fru-2,6P2, incluye 2527 pares de bases y da lugar in vitro a la síntesis de una proteina de 54 kDa, con actividad 6-PF-2K. El cDNA correspondiente a la glucosa-6-fosfatasa presenta 1748 pares de bases. En esta memoria, se recoge la regulación de la expresión génica de la glucosa-6-fosfatasa en condiciones de ayuno y realimentación y se observa que dicha expresión se muestra poco influenciada por la composición de la dieta. Los resultados obtenidos demuestran que, contrariamente a lo descrito previamente en la bibliografia, la glucoquinasa se expresa en hígado de dorada. Esta enzima presenta, sin embargo, unas caracteristicas en cuanto a su cinetica y a la regulación de su expresón que, junto con las particularidades en la modulación de la expresión de la glucosa-6-fosfatasa, podrian incidir en la intoleracia a la glucosa observada en los peces. Las secuencias descritas permiten profundizar en el conocimiento de las bases molecualres implicadas en el metabolismo hepático de los carbohidratos en dorada y podrían contribuir, en un futuro, al establecimiento de un nuevo modelo para el estudio de la diabetes no dependiente de insulina.