BIOQUIMICA MOLECULAR, 38

Autor: GIMENEZ BONAFE PEPITA.
Año: 1999.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.

Resumen: El objetivo principal del trabajo realizado ha sido el de examinar algunos casos de protamines especialmente interesantes para poder así mejor entenderla quimica y los mecanismos mediante los cuales las proteinas nucleares espermaticas han evolucionado. El estudio de las espermiogenesis y la protamina de Eledone cirrhosa nos ha permitido entender algunos procesos celulares que intervienen en la nucleomorfogenesis, y la necesidad de la aparicion de una protamina rica en cisteínas. Tambien se han estudiado las protaminas de otro octópodo, Octopus vulgaris, y hemos puesto de manifiesto las principales caracteristicas de los cambios evolutivos en el modelo de protamines en los moluscos cefalopodos. Se han acabado las secuencias de las protaminas del cenagasterópodo Murex brandaris. La comparación de las protaminas de M. Brandaris con la protamina de un especie ancestral nos ha permitido observar de nuevo la aparición de cambios repentinos en la evolución de las protaminas asociados a cambios en la biologia de la reproduccion. Por otra parte, hemos obtenido y estudiado las estructuras primarias de los peces Gasterosteioformes. En este caso se muestra que los cambios evolutivos se dan sobretodo en el extremo C-terminal de la molecula. Estos resultados adquieren un gran interes cuando se analizan en el marco general de los cambios que han experimentado las protaminas a lo largo de la historia evolutiva. Por último, tambien se han empezado unos experimentos preliminares para estudiar el recambio de la composicion del nucleo espermetico en la especie Dicentrarchus labrax, mediante incubaciones que mimetizan parcialmente el proceso de fecundacion. Los resultados no se pueden generalizar, pero a medida que se estudien los procesos de recambio se podra entender mejor el fenomeno de la gran diversidad composicional y morfologica exhibida por los gametos masculinos, concretamente en su cromatina.

Autor: ESPAÑOL FABREGAT MARTA.
Año: 1999.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.

Resumen: La glicerol fosfato deshidrogenasa mitocondrial (mGDH) forma parte de la lanzadera del glicerol fosfato y se situa en la superficie, externa de la membrana mitocondrial interna. Debido a su importancia en el metabolismo de la glucosa, se ha propuesto que un defecto de este enzima podria participar en la patogenia de la diabetes mellitus tipo 2. Se ha observado una dsiminución de la actividad enzimática de la mGDH en islotes pancreáticos de algunos modelos animales (ratas nSTZ yGK) de DM2, asi como en donantes afectos de esta enfermedad. La primera parte de esta tesis describe que tal disminución es debida a una reducción proteica del enzima. No es causa de la hiperglicemia per se aunque se restableceen ratas nSTZ cuando su glicemia se normaliza. En la segunda parte de esta tesis se intenta investigar la importancia de este enzima de la patogenia de la diabtes tipol. Se han detectado anticuerpos dirigidos contra este enzima en el 27% de los sueros de pacientes con diabetes tipo. Mientras que no se observan anticuerpos en los pacientes con diabetes tipo 2 ni a sus respectivos controles.

Autor: BENET MONICO ARIADNA.
Año: 1999.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: BIOLOGIA .

Resumen: En este trabajo se analiza el efecto de las secuencias homopurina-homopirimidina d(GA.TC)22 sobre la velocidad de migración de la estructura de Holliday "in vitro". Se ha observado que a pH4 estas secuencias,que se estructuran como triplex intramolecular, son capaces de impedir la migración espontanea de la estructura de Holliday. Así mismo, la formación de triplex intermoleculares tambien impide la migración de esta estructura. En ensayos "in vivo" se ha analizado el efecto de las secuencias de (GA.TC)22 sobre la tasa de recombinación en el virus de SV40. Se ha visto que esta secuencia incrementa la tasa de recombinación "in vivo" en SV40 dependiendo de su localización genómica, efecto que no se observa en los controles que contienen la secuencia d(CA.GT)30 o bien ninguna secuencia repetitiva. Parece ser que el efecto descrito está asociado a la capacidad estructural de las secuencias homopurina. Hompirimidina i ademas se ha visto que afecta de forma especifica la tasa de recombinación homologa.

Autor: RUIZ RESINI EDUARDO.
Año: 1999.
Universidad: ZARAGOZA.
Centro de lectura: VETERINARIA .
Centro de realización: DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA, BIOLOGIA MOLECULAR Y CELULAR.

Resumen: En este trabajo se pone de manifiesto la asociación entre la motilidad espermática, un fenotipo muy dependiente de la función respiratoria, y los haplogrupos mitocondriales. En concreto, el haplogrupo H y el T parecen ser genotipos de resistencia y susceptibilidad, respectivamente, a la astenozoospermia (déficil de motilidad espermática). El efecto del genotipo mitocondrial sobre esta función celular parece estar mediado por un déficit bioquímico en el sistema de fosforilación oxidativa, dado que las actividades de los complejos con subunidades codificadas por el mtDNA fueron sustancialmente menores en el haplogrupo T, frente a las mismas en el H. Los análisis por PCR y la secuenciación de diferentes regiones del genoma organular apuntan hacia un defecto en la expresión de las subunidades integrantes de los complejos respiratorios como la causa molecular subyacente. Así, se ha puesto a punto un modelo de laboratorio, híbridos trasnmitocondriales (cíbridos), para profundizar en el análisis molecular. Este modelo permite obtener una respuesta mitocondrial a las diferentes condiciones de cultivo. Sin embargo, no se han observado diferencias en la tasa de crecimiento o las actividades enzimáticas entre los dos haplogrupos de interés. Por otra parte, el haplogrupaje de una muestra control ha permitido caracterizar la población española en cuanto a su genotipo mitocondrial y su posterior comparación con el resto de poblaciones caucásicas. Los resultados obtenidos indican que la muestra peninsular se corresponde con una muestra caucásica típica.

Autor: DIEZ SÁNCHEZ CARMEN.
Año: 1999.
Universidad: ZARAGOZA.
Centro de lectura: VETERINARIA.
Centro de realización: DPTO. DE BIOQUÍMICA.

Resumen: Según un estudio realizado con 10.000 parejas por la O.M.S., el 13-14% de las parejas estables (unas 700.000 sólo en España) tiene problemas de fertilidad, siendo la causa de origen masculino en el 50% de los casos, aproximadamente. Partiendo de estos datos, se ha realizado un trabajo con 440 varones procedentes de clínicas de reproducción asistida y 7 controles voluntarios, obteniéndose como resultado que la cantidad relativa de DNA mitocondrial de una muestra, expresada como ratio mt/n (mitocondrial/nuclear) o como número de copias de DNA mitocondrial/célula, es un índice negativo de calidad seminal. Así mismo, se ha determinado que los espermatozoides pierden, progresivamente, parte del contenido en DNA mitocondrial a lo largo de su maduración, a la vez que aumenta la actividad de los enzimas de la cadena respiratoria. Por otro lado, no se ha observado síntesis de proteínas mitocondriales en los espermatozoides eyaculados, por lo que se ha concluido que las mitocondrias de estos gametos son inactivas biogenéticamente. Esta observación, a su vez, es coherente con la herencia de las mitocondrias por línea, exclusivamente, materna propuesta por diferentes autores.

Autor: PIÑEIRO PARDO MATILDE.
Año: 1999.
Universidad: ZARAGOZA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: Este trabajo se ha centrado en el estudio de una nueva proteína plasmática humana, denominada ITIH4, de 120K de Mr., extremádamente sensible a la proteolisis, que es homóloga de la proteína Pog-MAP, principal proteína de fase aguda en el cerdo. La ITIH4 se ha aislado a homogeneidad, y se han obtenido antisueros y anticuerpos específicos, con los que se ha desarrollado un método inmunoenzimático (ELISA), para la cuantificación de la proteína en el suero o plasma. El procedimiento, tipo sandwich, permite determinar la proteína en un rango de 0,1-4,5 ug/mL, con un coeficiente de variación interno del 5,1%. Mediante el procedimiento anterior la ITIH4 se ha determinado por primera vez en diversas poblaciones humanas (normales y con patologías). En individuos normales (donantes) la concentración media de la proteína es de (0,35 + - 0,06). Se ha observado una correlación positiva significativa (r=0,52, p

Autor: RECALDE FRISON DELIA.
Año: 1999.
Universidad: ZARAGOZA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: La hipoalfalipoproteinemia (HALP) es una dislipemia caracterizada por concentraciones de c-HDL inferiores al percentil 10 ó por debajo de 35 mg/dL. Se estima que aproximadamente el 36% de las HALP son de origen genético. El objetivo que nos planteamos fue conocer la prevalencia de mutaciones en los principales genes implicados en el metabolismo de las HDL en sujetos con HALP. Para ello analizamos la secuencia del gen de apo A-I, la región promotora, en 5' del gen, la región exaltadora de la expresión de apo A-I, en 5' del gen del gen de apo C-III, y el gen de LCAT en 66 sujetos no relacionados con HALP. Se emplearon las técnicas de detección de mutaciones de heterodúplex y polimorfismos de conformación de cadena sencilla (SSCP) y se identificaron las mutaciones por secuenciación. Asimismo, determinamos por análisis de restricción del genotipo de las variantes N370S y L444P del gen de glucocerebrosidasa ácida (GBA), y N291S, del gen de la lipoproteína lipasa (LPL), que, según se ha descrito, se asocian a niveles bajos de c-HDL. En el gen de apo A-I se detectaron 3 mutaciones diferentes en 3 sujetos heterocigotos (4,5% del total de suejtos), apo A-Izaragoza (L144R), apo A-Isuhima (W108R) y g.1833 C>T. El genotipo de los polimorfismos situados en 5' de apo C-III no presentó una asociación estadísticamente significativa con la concentración de c-HDL, ni se detectaron otras mutaciones en dicha región. En el gen de LCAT se detectaron asimismo 3 mutaciones diferentes en heterocigosidad (4,5% del total de sujetos), S108T, I178T y IVS3-23C>A. Otros 7 sujetos resultaron heterocigotos para una mutación silenciosa en el gen de LCAT (g.4886C>T), la cual, posteriormente se analizó en 92 sujetos con HALP y 100 muestras control, y se clasificó como un nuevo polimorfismo. Dos de los sujetos con HALP resultaron portadores de la mutación N370S en el gen de GBA (3% del total de sujetos) y otros 2 sujetos de la mutación N291S, en el gen de LPL. En conclusión, 10 de los sujetos con HALP analizados (15%) fueron portadores de mutaciones en los genes de apo A-I, LCAT, GBA o LPL. Por lo tanto, es muy probable que dichos genes tengan una contribución importante sobre el control genético de la concentración de c-HDL.

Autor: SAYAS CASANOVA CARMEN LAURA.
Año: 1999.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO BIOLOGÍA MOLECULAR SEVERO OCHOA (CSIC-UAM).

Resumen: El ácido lisofosfatídico (LPA) es un lípido bioactivo con diversas acciones biológicas, según el tipo celular: mitosis, apoptosis, adhesión, etc. El LPA induce colasp del cono de crecimiento y retracción de neuritas en células neuronales. La retracción de neuritas es un proceso fundamental no sólo durante el desarrollo del sistema nervioso (neurogénesis y neuritrogénesis), sino tmabién durante ciertas situaciones patológicas como la neurodegeneración. Por ello decidimos estudiar en esta tesis cómo se modifica el citoesqueleto de las células neuronales durante la retracción de neuritas, centrándonos en conreto en el estudio de la reorganización de los microtúbulos (MTs). En esta tesis se demuestra que los microtúbulos se modifican a varios niveles tras la acción del LPA sobre células de neuroblastoma humano (SH-SY5Y). En estas células, aumentan los niveles alfa-tubulina tirosinada, un marcador de MTs dinámico y disminuyen los de alfa-tubulina deterisonada, un marcador de MTs estables. Además, durante la retracción de neuritas inducida por LPA en células SH-SY5Y, se produce una hiperfosforilación de proteínas asociadas a los MTs (MAPs), en concreto MAO1B y Tau. La hiperfoforilación de las MAPs promueve la separación de éstas de los MTs, con la consiguiente desestabilización de los mismos, contribuyendo así posiblemente al proceso de acortamiento de las neuritas. También se demuestra aquí que la glicógeno sintasa quinasa-3 (GSK-3) es la quinasa implicada en la hiperfosforilación de Tau. La activación de GSK-3 por LPA parece estar en la ruta de RhoA. Además, en esta tesis se demostró que el LPA también activa GSK-3 en neuronas granulares de cerebelo de rata. Esto indica que la activación de la quinasa por LPA durante la retracción de neuritas no es una particularidad de la línea celular utilizada, sino que es un proceso más general y fisiologico.

Autor: PLAYAN ARISO ANA.
Año: 1999.
Universidad: ZARAGOZA.
Centro de lectura: VETERINARIA.

Resumen: Esta Tesis Doctoral consiste en el análisis genético molecular del DNA mitocontrial de familias españolas afectadas con síndromes encuadrados como enfermedades mitocondriales. En particular, se han analizado pacientes con los síndromes de Leber, MELAS, etc .. Y pacientes, fundamentalmente niños, con disfunciones neurológicas degenerativas de causa desconocida pero con sospecha de deficiencias en la producción de ATP por sus tejidos. Los métodos de estudio utilizados en la búsqueda de defectos genéticos mitocondriales han sido: la amplificación de un fragmento de DNA con la reacción en cadena de la polimerasa y digestión con la enzima de restricción adecuada, la hibridación Southern para el estudio de deleciones en el DNA mitocondrial y la secuenciación para saber exactamente los genes que se habían perdido. Se han estudiado 283 pacientes: 26 diagnosticados de Neuropatía Optica Hereditaria de Leber y 257 con diversas miopatías mitocondriales: síndrome de Leigh (25 casos), síndrome de MELAS (18 casos), síndrome de MERRF (6 casos), Amaurosis Congénita de Leber (3 casos), Necrosis Bilateral del Estriado (7 casos), lipomatosis múltiple simétrica (1 caso), síndrome de Kearns-Sayre (10 casos), síndrome de Pearson (4 casos), CPEO (8 casos), síndrome heredo-atáxico con neuropatía sensorial severa (2 casos), leucodistrofia (3 casos), déficit de glutation (1 caso) y el resto con características clínicas no agrupables dentro de un síndrome concreto. Se ha encontrado algún defecto genético en el DNA mitocondrial en 45 pacientes: 21 presentaron mutaciones puntuales en el DNA mitocondrial (9 de los casos diagnosticados de LHON, 3 de los que vinieron diagnosticados de síndrome de Leigh, 3 de los diagnosticados de MELAS, 1 caso con MERRF, 2 casos con Amaurosis Congénita de Leber, 2 casos con Necrosis Bilateral del Estriado y 1 familia con lipomatosis múltiple simétrica familiar). Se describe por primera vez la asociación de la mutación A8344G con lipomatosis múltiple simétrica familiar. 24 pacientes presentaron delecciones en el DNA mitocondrial (6 de los diagnósticados de síndrome de Kearns-Sayre, 2 de los diagnosticados de síndrome de Pearson, un caso con CPEO, 2 de los diagnosticados de heredo-ataxia con neuropatía sensorial severa, 1 con leucodistrofia, 1 caso con déficit de glutation y 11 casos con sintomas no agrupables dentro de un síndrome concreto).

Autor: LAPEÑA ROYO ANA CRISTINA.
Año: 1998.
Universidad: ZARAGOZA.
Centro de lectura: VETERINARIA.

Resumen: Basándonos en los estudios realizados hasta la fecha sobre mtDNA y motilidad espermática, realizamos en primer lugar un análisis para estudiar la potencial asociación entre pérdida de motilidad espermática e inhibición de la cadena respiratoria mitocondrial. De esta forma quedó demostrada la dependencia entre funcionalidad del sistema OXPHOS y capacidad motil de los espermatozoides. Una vez puesta de manifiesto esta relación se estudió la incidencia de diversas mutaciones patológicas del mtDNA que afectan a la cadena respiratoria en diversos pacientes y se vio que este tipo de mutaciones que causan enfermedades severas o moderadas no representaban una causa relevante de infertilidad masculina. Pero antes de descartar al mtDNA como responsable de la pérdida de la motilidad espermática observada, decidimos estudiar otro tipo de mutaciones que fueran más frecuentes y que han sido consideradas en principio como polimorfismos que se utilizan para definir haplogrupos mitocondriales en estudios filogenéticos. Así se realizó un extenso análisis de la distribución de los haplogrupos mitocondriales caucásicos descritos en los 425 individuos disponibles. La distribución obtenida, dado el alto grupo de muestras analizadas, era representativa de la población española en general, coincidiendo las frecuencias obtenidas con las europeas publicadas. Posteriormente se realizó un estudio estadístico para ver si existía asociación entre los haplogrupos mitocondriales y fenotipo astenozoospérmico. Se puso de manifiesto que existía una fuerte asociación entre el haplogrupo H y la buena movilidad espermática y el haplogrupo T y el fenotipo astenozoospérmico moderado. Finalmente hicimos analizar si el que haplogrupos establecidos en la población, como el T, puedan favorecer la astenozoospermia sin provocar manifestaciones aparentes en otros tejidos se debía a la especial interacción nucleo-mitocondria en el contexto del espermatozoide, o por el contrario era el propio mtDNA el responsable y solo lo apreciábamos en la motilidad espermática por ser una de las funciones más dependientes de ATP. Para averiguarlos se llevó a cabo la caracterización funcional de estos dos haplogrupos mediante diversos estudios realizados en cibridos transmitocondriales de ambos haplogrupos que previamente se habían logrado generar fusionando plaquetas de donantes T o H con células rho 0. Se vio que la adaptación del haplogrupo T al estres que suponía vivir en la lactosa era peor que la del H. Desde el punto de vista de la fertilidad masculina, se observó que el fondo genético del mtDNA es un factor relevante que contribuye al menos en el 10% de los casos de astenozoospermia. Y por lo tanto, la identificación de estos fondos genéticos asociados a la astenozoospermia puede contribuir a comprender las causas de la infertilidad, a definir mejores estrategias terapéuticas y a encontrar dentro de la población infertil aquellos que respondan mejor a los fármacos.

Autor: SOBRIDO GOMEZ M. JESUS.
Año: 1998.
Universidad: SANTIAGO DE COMPOSTELA.
Centro de lectura: MEDICINA.

Resumen: La inestabilidad de microsatélites debida a mutaciones en los genes reparadores de mismatch se ha implicado en la carcinogénesis de diversas neoplasias. El análisis de pérdidas de heterocigosidad permite identificar regiones cromosómicas implicadas en la carcinogénesis. Los estudios sobre este fenómeno en los tumores del sistema nervioso son pocos y los resultados heterogéneos, en gran parte por la ausencia de criterios unificados para definir estas alteraciones. OBJETIVOS: Evaluar la aplicación de un secuenciador automático basado en tecnología fluorescente para el análisis de microsatélites en cáncer y aplicar esta metodología al estudio de tumores primarios del sistema nervioso. MATERIAL Y METODOS: Los tumores estudiados fueron 56 gliomas, 32 meningiomas y 11 neurinomas, correspondientes a pacientes intervenidos en el Complejo Hospitalario Universitario de Santiago. Se trata de muestras preservadas e incluidas en parafina, de las que se seleccionó una zona adecuada de tumor para la extracción del ADN. EL ADN constitucional de cada paciente se extrajo a partir de sangre periférica. Hemos amplificado ocho loci microsatélites (D12S391, D21S11, Fibra/FGA, D19S394, D1S1656, D9S153, D9S1867, D6S1583), que posteriormente fueron analizados utilizando un secuenciador automático ALFExpress. El fenotipo de error de replicación (RER+) se definió por la presencia de inestabilidad en al menos 2 de los 8 loci. RESULTADOS: La identificación de inestabilidad de microsatélites y pérdidas de heterocigosidad está dificultada por diversos artefactos comunes a todos los STRs (bandas tartamudas, pull-ups, amplificación preferencial y artefactos de la electroforesis) y por artefactos característicos de cada microsatélite (picos aislados o patrones de múltiples picos). El sistema Fibra/FGA tuvo la mayor proporción de artefactos inespeciíficos. D19D394 tuvo la mayor proporción de falsas pérdidas de heterocigosidad debidas al fenómeno de la amplificación preferencial. Presentaron fenotipo RER+ 1/56 (1,8%)gliomas, 2/32 (6,3%) meningiomas y 1/11 (9,1%) neurinomas. Los loci D1S1656 y D19S394 presentaron deleción en el 18,2 y 17,8% de los gliomas, respectivamente. En los meningiomas hubo deleciones de los loci D21S11 (14,3%), D12S391 (13,6%) y D1S1656 (13%). CONCLUSIONES: Las muestras de tumores cerebrales preservadas en parafina son adecuadas para el análisis de microsatélites, pero hay que tener en cuenta los posibles artefactos originados por el estado de degradación parcial del ADN como posibles fuentes de falsos positivos. La inestabilidad de microsatélites es infrecuente en tumores primarios del sistema nervioso, lo que hace improbabel la implicación de alteraciones de los sistemas reparadores de mismatch en la carcinogénesis de estas neoplasias.

Autor: BOAN FERNANDEZ FRANCISCO.
Año: 1998.
Universidad: SANTIAGO DE COMPOSTELA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.

Resumen: En el presente trabajo hemos estudiado la estructura y posible función biológica de la secuencia minisatélite MsH42. El análisis por PCR de la región minisatélite muestra un bajo nivel de polimorfismo con dos formas alélicas diferenciadas por un fragmento de 105 pb que se encuentra duplicado en uno de los alelos. Además, el minisatélite sufre deslizamientos durante la replicación en las reacciones de amplificación, indicando la capacidad que tiene para la generación de lazos de cadena sencilla. En experimentos de band-shifting, empleando extractos nucleares de testículo de ratón y células humanas NC-37, se observa la existencia de proteínas nucleares que se unen especificamente a la región de MsH42. Estas características, unidas a la presencia de distintos motivos recombinatorios, nos ha llevado a investigar su posible capacidad recombinogénica. Para comprobar esta hipótesis en términos de recombinación homóloga intramolecular, construimos dos plásmidos, uno conteniendo 2 copias de la región minisatélite y el otro conteniendo 2 copias de una secuencia localizada en el extremo 5' de MsH42. En los ensayos de recombinación encontramos que: i) la región MsH42 estimula fuertemente la recombinación homóloga intramolecular in vitro (22 veces más que la secuencia control) solamente cuando la fuente biológica del extracto proteico fueron testículos de ratón; esto sugiere que MsH42 podría ser un "hotspot" de recombinación meiótica. ii) existe una relación directa entre la frecuencia de entrecruzamientos iguales y la potenciación de la recombinación. Esto provee una explicación para el bajo polimorfismo observado en la población. iii) la tercera unidad repetitiva (TGGGAGAGGC) es un punto importante en el desarrollo de los entrecruzamientos desiguales que llevan al acortamiento del minisatélite.

Autor: RODRIGUEZ MATARREDONA ESPERANZA.
Año: 1998.
Universidad: SEVILLA.
Centro de lectura: FARMACIA.

Resumen: La enfermedad de Parkinson es una enfermedad neurodegenerativa caracterizada por la pérdida progresiva de las neuronas dopaminérgicas de la via negro-estriada. Existen diversos modelos animales que reproducen las anomalias características de dicha enfermedad, siendo uno de ellos el que recurre a la administración intracerebral del ión MPP+. Existen evidencias que sugieren que las reacciones de formación de radicales libres en las que interviene el hierro, así como la excitotoxicidad mediada por el glutamato, desempeñan un papel importante en la toxicidad desencadenada por este compuesto. En esta Memoria, se ha estudiado el papel del glutamato, del ascorbato, del hierro y de la dopamina sobre la acción tóxica del MPP+. El aumento de los niveles extracelulares de glutamato a traves de la inhibición del transportador no aumentó la toxicidad del ión. Por el contrario, dicha inhibición produjo una marcada protección frente a la acción toxíca de éste. La protección encontrada puede explicarse por la disminución en los niveles extracelulares de ascorbato que se produce por la inhibición del transportador de glutamato. A su vez, se ha demostrado que la propia dopamina liberada tras la acción del MPP+ sobre las células dopaminerérgicas contribuye a la toxicidad del ión, y que, en presencia de hierro, la toxicidad de ésta se incrementa notablemente. Se ha estudiado también el efecto que presenta un quelante de hierro sobre la toxicidad del MPP+ en la sustancia negra y en el cuerpo estriado, encontrandose que, en ambos casos, la retirada del hierro libre mediante su quelación, disminuye considerablemente la toxicidad del MPP+.

Autor: MONFORT ROIG AURELIA.
Año: 1998.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: FARMACIA .

Resumen: El empleo de preparados comerciales enzimáticos en el sector de panadería presenta determinados inconvenientes. La alternativa planteada en este trabajo hace uso de las técnicas de biología molecular para construir cepas de levadura de panadería capaces de producir enzimas requeridas en el proceso. Concretamente, se han expresado en levadura los CDNAS correspondientes a las endoxilanasas X22, X24 y X34 de Aspergillus nidulans 4 la alfa-L-arabinofuranosidasa B de A. niger. Entre las lipasas, se han expresado en levadura los genes Lip1 y Lip2 de Geotrichum sp. También se han evaluado los efectos sinérgicos derivados de la coexpresión de los cDNAS de la alfa-amilasa de A.oryzae y la xilanasa X24. Las cepas industriales de levadura de panadería construídas producen efectos tecnológicos en la calidad del pan, similares a los obtenidos por la adición exógena de preparados enzimáticos.

Autor: RUIZ GARCIA ANA BELEN.
Año: 1998.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.

Resumen: En la cromatina de eucariotas el DNA se organiza alrededor de octámeros de histonas, dando lugar a la estructura nucleosomal. Las histonas sufren una serie de modificaciones postraduccionales entre las que se encuentran la acetilación de residuos de lisina, situados en los extremos N-terminales de estas proteínas. Esta modificación reversible, catalizada in vivo por las histona acetiltransferasas (HAT) y las histona desacetilasas (HD), ha sido implicada durante muchos años en la regulación de diversos procesos celulares de gran importancia. Recientemente, el papel de la acetilación de histonas en la regulación de la transcripción ha cobrado gran importancia con el descubrimiento de que proteínas con actividad HAT y HD son reguladores de la transcripción. En la levadura Saccharomyces cerevisiae se han identificado los genes que codifican para cuatro proteínas con actividad HAT, GCN5, HAT1, ESA1 y TAF130. Mediante métodos bioquímicos se había detectado previamente la existencia en este organismo de al menos cuatro actividades histona acetiltransferasa diferentes, los enzimas HAT A1, HAT A2, HAT A3 y HAT B. El análisis bioquímico de cepas de levadura mutantes en estos genes, y en otros genes que codifican proteínas relacionadas funcionalmente con estas HATs, realizado en este trabajo, ha permitido caracterizar estos enzimas previamente descritos en cuanto a su composición en proteínas, su localización subcelular y su especificidad de sustrato. Además el estudio bioquímico de cepas de levadura mutantes ha llevado a la identificación de una nueva actividad histona acetiltransferasa no descrita hasta el momento, el enzima denominado HAT A4.

Autor: AMBROS PALAGUERRI SILVIA.
Año: 1998.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.

Resumen: El sistema formado por el PLMVd y el melocotonero de semilla GF-305 se ha utilizado como modelo para el estudio de las interacciones entre un viroide que contiene ribozimas de cabeza de martillo y su huésped natural. La caracterización molecular de un conjunto de 29 variantes de secuencia procedentes de tres aislados del PLMVd que difieren en su patogenicidad, un aislado agresivo, el D168 y dos aislados latentes, el Esc76906 y el LS35, mostró un gran polimorfismo de secuencia en la molécula viroidal. El patrón de variabilidad observado indica que la heterogeneidad de secuencia en el PLMVd se encuentra limitada al menos por tres tipos de restricciones estructura-función: la formación de unas ribozimas de cabeza de martillo estables, la conservación de una conformación global ramificada de la molécula y el mantenimiento de una interacción potencial de tipo pseudonudo entre dos bucles de la estructura secundaria propuesta para este viroide. Los análisis filogenéticos llevados a cabo con las 29 nuevas variantes del PLMVd han permitido establecer tres grandes grupos de secuencia, cada uno de los cuales se caracteriza por un patrón de variabilidad distinto. Los resultados de los bioensayos sobre GF-305 de variantes individuales del PLMVd pertenecientes a los tres aislados seleccionados han mostrado que las propiedades biológicas de los mismos deben ser consecuencia de la complejidad de sus poblaciones y de la presencia en ellas de determinadas variantes moleculares. Se ha caracterizado biológica y molecularmente una variante del PLMVd que contiene una sustitución U4 C en el bolsillo catalítico de la ribozima de cabeza de martillo de polaridad positiva. El RNA viroidal mutante, pero no aquellos con las otras dos sustituciones posibles en el bolsillo catalítico, U A y U G, mostró un autocorte significativo durante la transcripción in vitro. Además, el cDNA de longitud completa correspondiente a esta variante de secuencia resultó infeccioso, y la mutación se retuvo en una fracción de las moléculas de su progenie. Estos resultados indican que la flexibilidad de secuencia de la ribozima de cabeza de martillo es mayor de lo anticipado. Se ha estudiado la evolución molecular de secuencias individuales del PLMVd por medio de la inoculación en GF-305 de cuatro cDNAs representativos que difieren en su patogenicidad. El análisis de las progenies derivadas de estas secuencias parentales ha revelado la rápida evolución del PLMVd en su huésped natural, indicando que la naturaleza extremadamente heterogénea de los aislados de este viroide es muy probablemente resultado de la acumulación gradual de mutaciones puntuales. El estudio de la estructura de las cuasiespecies PLMVd generadas de novo ha mostrado que el polimorfismo de secuencia de éstas se encuentra limitado por las mismas restricciones estructural-funcionales previamente descritas para los aislados naturales del mismo. La rápida evolución del PLMVd es considerablemente mayor que la observada con anterioridad en el viroide del tubérculo fusiforme de la patata (PSTVd). Aunque en el sistema del PLMVd es difícil establecer una correlación genotipo-fenotipo, los resultados obtenidos en este estudio sugieren que la evolución de variantes indiciduales de este viroide sigue rutas definidas en el espacio de secuencias.

Autor: COSTOYA PUENTE JOSE ANTONIO.
Año: 1998.
Universidad: SANTIAGO DE COMPOSTELA.
Centro de lectura: MEDICINA.

Resumen: El crecimiento es un complejo proceso que refleja principalmente el incremento en el número de células de un organismo y que depende del balance entre proliferación y muerte celular. Uno de los principales factores implicado en el control del crecimiento es la hormona de crecimiento (GH), producida principalmente por las células somatotropas de la adenohipófisis, aunque se ha descrito también la existencia de síntesis de GH fuera de la hipófisis. En el presente estudio, analizamos el papel de esta GH extrahipofisaria, en el control del crecimiento celular en células HL-60 (leucemia mieloblástica aguda con diferenciación). Nuestros resultados muestran que las células HL-60 expresan y liberan GH, presentando a su vez receptores activos en su membrana celular. La expresión de GH se encuentra incrementada en células proliferantes en comparación a aquellas que han cesado su proliferación, lo que sugiere que la hormona participa en el control del crecimiento. De acuerdo con esta hipótesis, el bloqueo de la GH producida localmente con anticuerpos anti-GH redujo el crecimiento de las células HL-60. Estudios de la fragmentación de ADN demostraron que este efecto es secundario a un incremento en la apoptosis celular, lo que indica que la GH actúa como un factor de supervivencia autocrino/paracrino. Las vías intracelulares que dirigen este mecanismo fueron investigadas tanto en células HL-60 como en clones de células CHO transfectados con el receptor de GH o con una forma truncada del mismo ( 454GHR) caracterizada ésta por una activación sostenida de Jak-2, la tirosina quinasa asociada al receptor. En todos los casos la activación de GHR produjo un incremento en la fosforilación de Akt, una serina-treonina quinasa que juega un importante papel en las vías de supervivencia celular.

Autor: PERNAS ESCARIO MARIA.
Año: 1998.
Universidad: SANTIAGO DE COMPOSTELA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.

Resumen: Marteilia refringens es un parásito protozoo perteneciente al Filum Paramyxea. Recientemente, ha sido incluido por la Unión Europea dentro de la lista de parásitos de declaración obligatoria. Hasta el momento, se desconoce si la especie de Marteilia que afecta al mejillón, Mytilus galloprovincialis cultivado en Galicia se trata o no de M. refringens, sin haberse detectado en este parásito mortalidades masivas como las ocurridas en la ostra plana Ostrea edulis, cultivada en Europa. Dada la importancia que tiene el cultivo del mejillón en Galicia cualquier agente que pueda afectar a esta producción debe ser objeto de estudio, por ello el objetivo de esta tesis se ha centrado en el estudio del parásito Marteilia detectado en el mejillón M. galloprovincialis. Para ello se ha analizado bajo tres puntos de vista: - En primer lugar se diseñaron dos experimentos de cohabitación entre diferentes especies de moluscos para analizar el papel del mejillón gallego en la transmisión de la Marteiliasis. Dichos experimentos resultaron negativos, concluyendo al igual que otros autores, en la existencia de un huésped intermediario. - Para intentar esclarecer cuál es la especie que afecta al mejillón gallego se emplearon técnicas de biología molecular. Tras la amplificación mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) del ADN del parásito con primers universales derivados de la región de ARN ribosómico 18S no se obtuvieron resultados positivos. Por el contrario, el uso de primers específicos para el parásito resultaron amplificar de forma sensible y especifica el ADN de Marteilia. El ADN de Marteilia refringens, aislada de Ostrea edulis y ADN de Marteilia aislado de M. galloprovincialis se amplificaron con estos primers específicos y su secuencia de nucleótidos se comparó. Dichas secuencias mostraron diferencias en 7 nucleótidos lo cual apoya la hipótesis de que se tratan de dos especies distintas. - Un buen sistema de diagnóstico es una herramienta muy útil en el control de una enfermedad. Se han diseñado nuevos sistemas para la detección de este parásito mediante técnicas de inmunología (inmunofluorescencia, inmunoperoxidasa, inmunodor y ELISA), y de biología molecular (PCR, hibridación con una sonda no radioactiva aplicada a dot blot e hibridación in situ). Tras la puesta a punto de estas técnicas en la detección de células de Marteilia purificada, se hizo una comparación de las técnicas clásicas, aposiciones y cortes histológicos, técnicas inmunológicas y de biología molecular en la detección del parásito en muestras de mejillón, resultando la técnica de PCR la más sensible.

Autor: SALGADO CASTRO FRANCISCO JAVIER.
Año: 1998.
Universidad: SANTIAGO DE COMPOSTELA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.

Resumen: La proteasa Dipeptidil peptidasa IV (DPPIV, EC 3.4.14.5), asignada al cluster CD26, es una glicoproteína de membrana localizada en la membrana plasmática de linfocitos T humanos en reposo y activados policlonalmente. La presente Tesis Doctoral aporta datos que señalan a CD26 como un marcador del fenotipo Th1, ya que tanto IL-12 como IL-2 aumentan su expresión y actividad DPPIV en linfocitos activados policlonalmente. El efecto de IL-12 es directo e implica procesos de transcripción y traducción del ARNm de CD26, así como de translocación del enzima hacia la membrana plasmática. Un factor inflamatorio, TNFalfa, contraregula este efecto de IL-12 e IL-2 sobre la expresión de CD26. Estas dos últimas citocinas, de manera opuesta a IL-4 y TNFalfa, incrementan también los niveles de ADA (Adenosina deaminasa, EC 3.5.4.4), una molécula que interacciona con CD26 en la superficie de linfocitos activados policlonalmente. El fenómeno implica mecanismos en los que procesos de translocación mediante un sistema de transporte al margen de CD26 son preponderantes. Esto se traduce en diferencias regulativas entre ADA y CD26, así como en una ausencia de coexpresión/colocalización completa de ambas moléculas. IL-12, finalmente, provoca un aumento de los niveles de CD45RO, así como de su interacción con CD26, lo que puede suponer una nueva vía de señalización que complemente a las generadas vía TCR/CD3.

Autor: SALGUEIRO VARELA M. TERESA.
Año: 1998.
Universidad: SANTIAGO DE COMPOSTELA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.

Resumen: La Protimosina alfa (ProTalfa) es un polipéptido muy acídico de peso molecular 12,5 Kda, de presencia preferente en mamíferos en una gran variedad de tejidos y órganos, implicada en un proceso intracelular básico y, relacionada con la actividad proliferativa de las células. Con la intención de esclarecer su función y dado que los mecanismos de proliferación celular son esenciales y especialmente activos durante las primeras fases del desarrollo embrionario, analizamos la distribución espacial de la expresión de ProTalfa en este período. Encontramos que la expresión del mRNA de ProTalfa durante las primeras fases de postimplantación del desarrollo embrionario del ratón es muy baja a 6,5 dpc, se incrementa durante los estadíos de 6,5 dpc-8,5 dpc y permanece constante entre 8,5 dpc-12,5 dpc. Además, el gen de ProTalfa se expresa casi exclusivamente en ectodermo, así como en estructuras derivadas del mesodermo y no en células que darán lugar al endodermo definitivo. Por otro lado, el hecho de que la ProTalfa se fosforile en la región N-terminal de su secuencia, durante el proceso de fosforilación celular, nos ha llevado a investigar los aminoácidos que en dicha región, resultan fosforilados por la Proteína quinasa de ProTalfa (ProTK) que ha sido aislada en nuestro laboratorio. Para ello, produjimos por mutagénesis dirigida una serie de cDNAs mutantes de ProTalfa que contienen alterados los locus de fosforilación: Thr 7, 12 y 13, y, Ser 8 y 9. Expresamos estos cDNAs como proteínas de fusión que purificamos por cromatografía de afinidad en Glutation sepharosa y, con ellos, realizamos los ensayos de fosforilación con la ProTK. Estos análisis demostraron que todos los residuos de treonina se implican en la fosforilación de ProTalfa, mientras los de serina no son fosforilados. El hecho de que la supresión de la Thr 7 conlleva un descenso de la mitad de la actividad fosforilante, mientras la supresión de los residuos 12 y 13 de treonina, sólo afectan, en cada uno, a un descenso de la cuarta parte de la capacidad de fosforilación de la ProTalfa salvaje, parece indicar que la Thr 7 contribuye en un 50% a la capacidad de fosforilarse de la ProTalfa, mientras que los residuos Thr 12 y 13 contribuyen conjuntamente en otro 50%.