BIOQUIMICA MOLECULAR, 39

Autor: CAYUELA FUENTES M. LUISA.
Año: 1998.
Universidad: MURCIA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.

Resumen: Myxococcus xanthus, es una bacteria Gram positiva que en ausencia de nutrientes forma cuerpos fructíferos, donde las células se diferencian en mixosporas. Esta bacteria también responde a la iluminación sintetizando carotenoides. Se ha identificado un gen, carD, que se encuentra implicado en ambos procesos, de manera que una mutación en dicho gen impide a la bacteria fructificar y sintetizar carotenoides. La secuenciación del gen carD revela la presencia de una proteína cuya región carboxi-terminal muestra homología con el dominio de unión a DNA de las proteínas tipo HMGI(Y), siendo la primera vez que se encuentra dicho dominio en un organismo procariótico. La proteína CarD se une in vitro a una secuencia rica en pares A-T requerida para la expresión de un promotor dependiente de CarD. Utilizando nuevos programas de comparación de secuencia, el extremo amino de CarD muestra homología con el dominio de interacción con la polimerasa de RNA de las proteínas TRCF (proteínas que acoplan el proceso de transcripción al de reparación, aumentando la tasa de reparación en la cadena que se está transcribiendo). Por otro lado, carD es necesario para que se expresen correctamente los genes que sintetizan dos de las cinco señales intercelulares necesarias para la formación de cuerpos fructíferos, las señales A y C. Una búsqueda experimental de genes homólogos a carD ha dado resultados positivos sólo en el grupo de las mixobacterias, en concreto con el orden Cystobacterineae al que pertenece Myxococcus xanthus. Se ha clonado el gen homólogo a carD en una bacteria perteneciente a este grupo, Stigmatella aurantiaca. Este gen presenta una secuencia casi idéntica a carD.

Autor: MARTINEZ ESPARZA ALVARGONZALEZ M. CONCEPCION.
Año: 1998.
Universidad: MURCIA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.

Resumen: El trabajo presentado está enmarcado en el estudio de la melanogénesis de mamíferos, y estructurado en cuatro partes o capítulos. En el primer capítulo se estudia el efecto del factor de crecimiento TGF beta1 sobre la diferenciación y proliferación de los melanocitos B16 en cultivo. Los datos presentados sugieren un papel específico de control negativo sobre la diferenciación. Este factor podría desempeñar un papel en el control post-traduccional de las enzimas tirosinasa y TRP-1. Además el TGF beta1 podría participar en un bucle de regulación autocrino además de ejercer una regulación paracrina de la diferenciación del melanocito. En el segundo capítulo se estudia el efecto del factor de necrosis tumoral alfa (TNF) sobre la diferenciación y proliferación de las células B16. Este factor actúa a nivel transcripcional, reduciendo los niveles de ARNm de tirosinasa y TRP-1 y post-transcripcional sobre la estabilidad de estas proteínas, lo que reduce sus niveles intracelulares y por tanto las actividades que catalizan, tirosina hidroxilasa y dopa oxidasa. En el tercer capítulo se estudia el efecto de las dos citoquinas anteriores sobre los productos derivados del locus silver. Dicho locus cifra productos génicos con una función importante en el control de la melanogénesis, y pertenecen a una familia distinta a la de tirosinasa. Existen dos niveles de regulación para este locus, uno transcripcional y otro post-traduccional, y el patrón parece diferente al descrito para los genes de la familia de tirosinasa. Finalmente, en el capítulo cuarto, se presentan resultados que indican que ninguno de los dos factores estudiados, TGF beta 1 y TNF alfa, parecen interferir con la respuesta de los melanocitos a la hormona MSH.

Autor: GONZALEZ RUGELES CLARA ISABEL.
Año: 1998.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: CIENCIAS.

Resumen: El L1Tc es un elemento móvil y pertenece al grupo de los retrotransposones no-LTR. Su tamaño es de 5 kb y su secuencia mostró la presencia de tres marcos de lectura (ORF) diferentes, el primero presenta homología con secuencias ya descritas como enzimas reparadoras de la familia AP (Demple, B. y col.; Proc. Natl.Acad.Sci.USA.88, 1991), el ORF2 presenta homología con los dominios transcriptasa inversa y el ORF3 presenta homología con proteínas con dominios de unión a ácidos nucleicos. Se asume que para que un retrotransposón pueda transponer de forma autónoma debe codificar para tres tipos de actividad: capacidad de unión a ARN, actividad transcriptasa inversa y reconocimiento de sitio de integración. Según la descripción, el elemento L1Tc llena los tres requerimientos, donde el ORF2 podría estar codificando para la actividad transcriptasa inversa, el ORF3 presenta dos sitios que pueden tener capacidad de unión a ARN y el sitio de reconocimiento para la integración puede darse por la actividad endonucleasa de la proteína de la familia AP codificada en el ORF1. Además, varios autores han sugerido la presencia de actividad transcriptasa inversa en tripanosomátidos, aunque sea a niveles muy bajos para explicar la existencia de criptogenes editados sustituyendo a los criptogenes originales en los maxicirculos (Simpson, L. y col., Science. 1994). Sin embargo, en tripanosomátidos hasta el momento sólo se ha detectado actividad transcriptasa inversa en Crithidia fasciculata asociada al retrotransposón CRE1 (Gabriel, A. y col.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991). Dado que el L1Tc presenta un ORF que contiene los dominios conservados en todas las transcriptasas inversas, en este trabajo de tesis doctoral se demostró no sólo que la proteína codificada en este marco de lectura presenta una actividad transcriptasa inversa dependiente de cationes divalentes, tiene capacidad para utilizar diferentes combinaciones molde/iniciador, incluyendo tanto homopolímeros de ribonucleótidos, deoxinucleótidos como ARN heterólogo sino que esta actividad está presente en homogeneizados del parásito T. cruzi, mayoritariamente a nivel nuclear con requerimientos similares y siendo sensible a la presencia de inhibidores específicos de las transcriptasas inversas retrovirales. La zona carboxiloterminal de la proteína recombinante localizada corriente abajo de los dominios consenso transcriptasa inversa no es imprescindible para dicha actividad, aunque presenta una ligera disminución en su actividad enzimática. La mutación del segundo ácido aspártico del dominio catalítico consenso de las transcriptasas inversas, conduce a la abolición de la actividad. La proteína recombinante codificada por el ORF2 del elemento L1Tc presenta una actividad RNasa H asociada, los requerimientos iónicos son similares a los descritos para RNasas H de retrovirus y contrarios a los referidos para la enzima de E. coli. Esta actividad RNasa H está localizada en la región carboxiloterminal y conserva los aminoácidos presentes en el sitio catalítico de enzimas de este tipo asociadas a las transcriptasas inversas de retrovirus, así como a RNasas H descritas en bacterias, parásitos y levaduras, estos aminoácidos se mantienen conservados en la mayoría de los retroelementos no-LTR descritos. En este trabajo de tesis doctoral también se demostró la capacidad de la zona 5' no traducida del elemento L1Tc de dirigir la expresión de un gen foráneo clonado corriente abajo de dicha región, por lo tanto ésta podría estar actuando como promotor interno del elemento L1Tc de la misma forma que se ha descrito la presencia de promotores internos para otros retrotransposones del tipo no-LTR. Todos estos datos demuestran que el retrotransposón L1Tc es un elemento activo y autónomo ya que codifica las proteínas necesarias para su propia transposición.

Autor: ROBELLO PORTO CARLOS.
Año: 1998.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: CIENCIAS.

Resumen: Se realizó la caracterización de dos genes de Trypanosoma cruzi, tcp17 y pteridina reductasa 1, contiguos al gen tcpgp2. El gen tcp17 presenta un marco de lectura de 480 pb, y codifica para una proteína de 16,5 KDa. El análisis de homologías muestra que pertenece a una familia altamente conservada en la escala evolutiva, denominada YER057c. tcp17 es un gen de copia única que se localiza en dos cromosomas de 0,9 y 1,2 Mb, y se transcribe en los tres estadíos del parásito. Sin embargo la proteína se expresa diferencialmente siendo mayoritaria su expresión en el estadío epimastigota. Los estudios de localización por inmunofluorescencia y microscopía electrónica muestran que TCP17 es una proteína con una amplia distribución por toda la célula, pero su mayor concentración se observó en membrana plasmática, aparato de Golgi y estructuras vacuolares. El gen ptr1 (pteridina reductasa 1) es también un gen de copia única, presentando sus mayores homologías con los genes ptr1 de Leishmania y T. brucei. Las proteínas para las que codifican estos genes pertenecen a la familia de las deshidrogenasas/reductasas de cadena corta, ampliamente distribuídas en la escala evolutiva, y en ptr1 están presentes todos los motivos aminoacídicos conservados descritos para esta familia. Los estudios de expresión de PTR1 muestran que esta proteína también se expresa diferencialmente, siendo mayoritaria su expresión en el estadío epimastigota. Los estudios de transfección de este gen en T. cruzi muestran que su sobreexpresión confiere resistencia a los antifolatos aminopterina, trimetoprim y metotrexato, y no a pirimetamina. Para los ensayos enzimáticos la proteína se expresó en E. coli y se purificó por cromatografía de afinidad. PTR1 presentó actividad reductora dependiente de NADPH para los sustratos biopterina, dihidrobiopterina, folato y dihidrofolato, mientras que no se detectó ninguna actividad frente a los sustratos neopterina y sepiapterina.

Autor: QUEIPO ORTUÑO M. ISABEL.
Año: 1998.
Universidad: MALAGA.
Centro de lectura: MEDICINA .

Resumen: Dado que el cuadro clínico de la brucelosis humana es sumamente inespecífico, para su diagnóstico es necesario recurrir a diferentes pruebas bacteriológicas y serológicas. No obstante esta metodología convencionalmente empleada presenta serias limitaciones. Por lo que, en la presente Memoria Doctoral se ha investigado el uso potencial de un ensayo basado en un único paso de PCR como test rápido para el diagnóstico de la enfermedad. Dicho estudio constó de dos etapas netamente diferentes, una primera etapa en la cual se desarrolló y optimizó la prueba de PCR sometida a ensayo y una segunda etapa en la que se valoró su eficacia diagnóstica. Con la aplicación de dicha prueba de PCR a pacientes con brucelosis se ha conseguido: - Incrementar el porcentaje de diagnósticos directos, que en la actualidad no superan el 50-70% de los casos. - Reducir el tiempo necesario para alcanzar un diagnóstico de certeza, que en la actualidad requiere varios días en el mejor de los casos, con la consiguiente reducción de la demora en la aplicación del tratamiento adecuado, lo que supondrá un claro beneficio para el paciente. - Eliminar el alto riesgo que supone para el microbiólogo y el personal de laboratorio la manipulación de Brucellas vivas. Por lo tanto, la puesta en práctica de una PCR sensible, específica y capaz de ser aplicada sin dificultades técnicas especiales supone un paso importante en el diagnóstico de la brucelosis humana.

Autor: TELLEZ SANTANA TERESA.
Año: 1998.
Universidad: MALAGA.
Centro de lectura: MEDICINA.

Resumen: En la presente tesis se ha tratado de comprobar si existe asociación entre los alelos HLA-DQB1, -DQA1 y DRB en pacientes con diabetes mellitus tipo 1 de la provincia de Málaga. En este estudio se ha comprobado que existe una relación de esta enfermedad con los haplotipos: DRB1*03-DQB1*0201-DQA1*0501 y DRB1*04-DQB1*0302-DQA1*03011, que son los aparecidos en otros estudios. Además, se ha relacionado el haplotipo DRB1*03-DQB1*0201 -DQA1*0501 con la retinopatía diabética.

Autor: RODRIGUEZ HERVA JOSE JUAN.
Año: 1998.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: CIENCIAS.

Resumen: Las bacterias del género Pseudomonas poseen un alto interés biotecnológico por sus numerosas aplicaciones en el ámbito medioambiental, entre las que destacan su uso como biopesticidas, como agentes potenciadores del crecimiento vegetal, en el tratamiento in situ de zonas contaminadas, etc. El éxito de estos tratamientos, que suelen requerir la introducción de los microorganismos en el suelo o la rizosfera, depende en gran medida de la eficiencia con la que las bacterias colonicen dichos ecosistemas. De ahí la importancia de estudiar qué componentes de la envuelta celular están implicados en estos procesos de supervivencia y colonización. En este trabajo se ha determinado la función celular del gen oprL de Pseudomonas putida y su papel en el proceso de colonización del suelo y adhesión a semillas. Además, también se ha estudiado el papel que juega el antígeno O del lipopolisacárido en estos procesos. El gen oprL codifica la lipoproteína asociada al peptidoglicano, perteneciente a la familia de proteínas PAL de bacterias gram negativas. Este gen estaba localizado, en el cromosoma de P. putida, dentro del grupo de genes tol, que codifican el denominado sistema Tol-OprL de Pseudomonas putida, un complejo proteico localizado en la envuelta celular e implicado en el mantenimiento de la integridad de la membrana externa. Las cepas portadoras de la mutación oprL son más sensibles que su cepa parental a diversos compuestos (como detergentes, EDTA o algunos antibióticos), liberan enzimas periplásmicas al medio extracelular y además muestran defectos en los últimos estadíos de la división celular. Sin embargo, oprL no es, como se postuló en un principio, un gen esencial para la supervivencia de Pseudomonas putida. En este trabajo, también se construyó un mutante de P. putida afectado en la expresión de la cadena lateral O del lipopolisacárido y se estudió su capacidad para colonizar suelos no estériles y para adherirse a semillas de maíz. El mutante oprL de P. putida también se analizó a este nivel, y además se determinó que efecto producía la combinación de ambas mutaciones de la envuelta celular, sobre dichas capacidades. Tanto la pérdida de la proteína OprL como la del antígeno O del lipopolisacárido provocaron una disminución en la viabilidad de las células de P. putida en suelo, que se acentuó significativamente cuando ambas mutaciones se combinaron. Sin embargo, dichas mutaciones, ni combinadas ni de forma independiente influyeron en las propiedades de adhesión de P. putida a semillas de maíz.

Autor: MENENDEZ MARTINEZ AMAIA.
Año: 1998.
Universidad: PAIS VASCO.
Centro de lectura: QUIMICA.

Resumen: El crecimiento celular se basa en la fusión localizada de vesículas de transporte con la membrana que delimita la célula, proceso que se traduce en una mezcla de continentes y contenidos. Como organismo modelo para reproducir esta etapa artificialmente y poder proceder a su estudio pormenorizado se empleó la levadura Saccharomyces cerevisiae. Así, se purificaron los componentes implicados en el proceso. Se obtuvieron vesículas de membrana plasmática invertidas y totalmente funcionales, vesículas de secreción con sus propiedades celulares intactas. Una vez desarrollado un método para detectar la mezcla de contenidos entre estos dos compartimentos, se pusieron en contacto con citosol para reproducir el medio intracelular, y en las condiciones adecuadas, se pudo comprobar la transferencia de un marcador desde las vesículas de secreción a las de membrana plasmática. Este proceso es dependiente de la temperatura.

Autor: PEREZ GARCIA M. JOSE.
Año: 1998.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: MEDICINA .

Resumen: La cirrosis hepática constituye una de las causas más frecuentes de mortalidad en nuestro país y en la mayoría de los países desarrollados y está apareciendo en edades cada vez más jóvenes. No se dispone todavía de un tratamiento terapéutico eficaz, pero es importante la ayuda que puede proporcionar una alimentación adecuada, ya que la cirrosis se acompaña de malnutrición, circunstancia que agrava la enfermedad. Los nucleótidos son compuestos que pueden ser proporcionados por la dieta y parecen potencialmente útiles en el tratamiento nutricional de la cirrosis hepática. De hecho, muchos medicamentos utilizados tradicionalmente como protectores hepáticos contienen principios activos que pertenecen a este grupo de sustancias. Aunque el organismo tiene la capacidad de sintetizar nucleótidos a partir de los aminoácidos de la dieta (síntesis de novo), una serie de trabajos recientes sugiere que los nucleótidos deben considerarse nutrientes semiesenciales. Es decir, que su aporte dietético resulta fundamental en situaciones críticas, como la cirrosis hepática, en las que dicha síntesis de novo puede estar comprometida. Trabajos previos realizados por nuestro grupo han demostrado que la adición de nucleótidos a la dieta mejora los datos histológicos y bioquímicos que caracterizan a la degeneración hepática producida en ratas por la administración de tioacetamida (TAA), una situación patológica que tiene grandes analogías con la cirrosis humana. Es interesante resaltar que la cantidad de nucleótidos era la que caracteriza a la dieta habitual, comparándose los resultados obtenidos en los animales que consumían esta dieta con los que recibían una que carecía de dichos nutrientes. Hablamos, por tanto, de "nucleótidos de la dieta" y no de dosis farmacológicas. Sin embargo, como las lesiones producidas por la TAA son reversibles, los efectos positivos de la adición de nucleótidos a la dieta no fueron demasiado diferentes de los producidos por el simple cese del tratamiento patológico. Por ello, el objetivo de este trabajo ha sido evaluar el efecto de la adición de nucleótidos a la dieta de forma simultánea a la administración de TAA, para que el efecto de los nucleótidos resultara totalmente nítido y no pudiera ser atribuído a ninguna otra situación o circunstancia. Con este fin se han determinado en los lotes de ratas correspondientes: marcadores de daño hepático, marcadores de funcionalidad hepática y marcadores de fibrogénesis. Los resultados obtenidos confirman los datos iniciales obtenidos con anterioridad e indican claramente que los nucleótidos de la dieta tienen un carácter protector frente a las lesiones hepáticas producidas por la TAA. Por otra parte, este carácter protector no parece estar basado únicamente en las funciones metabólicas clásicas de los nucleótidos sino que apunta a un papel modulador de la expresión génica que llevaría a la disminución de la fibrogénesis. Todo ello parece suficientemente importante como para aconsejar la ampliación de este estudio a la clínica humana.

Autor: GARCIA GUERRA RAFAEL.
Año: 1998.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: QUIMICA.

Resumen: Aunque es bien conocido que las modificaciones in vivo de la composición lipídica del plasma sanguíneo alteran la composición de la plaqueta circulante, no está bien definido la extensión ni las consecuencias estructurales, dinámico moleculares y funcionales de estas alteraciones en la membrana plasmática de la plaqueta humana (MPPH) y, por tanto, su contribución a la patogénesis de la ateroesclerosis, de la trombosis arterial aguda y de la hiperplasia neointimal. A este respecto, cabe esperar que la estructura, la dinámica molecular y la función de los receptores de MPPH este modulada por la composición de la bicapa lipídica. En la presente tesis se estudió la correlación existente entre alteraciones in vivo de la composición lipídica del plasma y las modificaciones de la composición lipídica, orden estructural de la bicapa y la función de MPPH de sujetos con hiperlipidemias. Además se inició la caracterización del entorno lipídico de alfa beta3 o GPIIb/IIIa, ya que su condición de proteína integral mayoritaria de MPPH le hacen unos de los mejores objetivos individualizados para seguir las modificaciones causadas por la alteración de la composición lipídica. Tras determinarse la composición lipídica y el orden estructural de MPPH en un grupo de individuos sanos, se estableció que el contenido de GPIIb/IIIa es una referencia fiable para expresar el contenido de lípidos de MPPH. Así se pudo observar un aumento del contenido absoluto de colesterol (CL) y de fosfolípidos (PL) en MPPH de sujetos con hiperlipidemia, siendo este aumento diferente según el tipo de hiperlipidemia. Así, se observó que con respecto al grupo control, la relación molar CL/PL aumenta en las hipercolesterolemias (0.70), disminuye en las hipertrigliceridemias (0.62) y no se modifica en las hipercolesterolemias combinadas con hipertrigliceridemia (0.65). También se observó que el contenido de CL y de PL en MPPH esta correlacionado fundamentalmente con la concentración de CL-LDL y triglecéridos plasmáticos, respectivamente. Para determinar el orden estructural de MPPH se determinó la anisotropía de fluorescencia del DPH (< >DPH) incorporado a las membrana. Se observó que en las hipertrigliceridemias y en las hipercolesterolemias combinadas con hipertrigliceridemias se produce un descenso del orden estructural de MPPH, que estaba correlacionado principalmente con el aumento del contenido de acido oléico y linoléico, en MPPH, que se da en estas hiperlipidemias. No se observó correlación significativa entre la concentración plasmática de CL o el contenido de CL en MPPH y DPH. Por otro lado, los estudios de agregación plaquetaria mostraron la existencia de una cierta correlación entre la extensión de la agregación plaquetaria inducida por colágeno y la relación molar CL/PL en MPHH. Finalmente, los estudios de solubilización diferencial de MPPH con triton X-100 y de composición lipídica de la fracción soluble donde se encuentra GPIIb/IIIa y de los lípidos que permanecen ligados a él durante la primera etapa de su aislamiento, permiten suponer que este receptor se encuentra inmerso en dominios lipídicos en fase liquida desordenada y que la fracción de lipídos que más fuertemente interaccionan con él esta enriquecida en CL y esfingomielina con respecto a la composición de la membrana total.

Autor: IDRISSI AZAMI FATIMA ZOHRA.
Año: 1998.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.

Resumen: Rap1p es una proteína reguladora de la transcripción en S. cerevisiae que se une al ADN de secuencia 5'- ACACCCAYACAYYY-3'. Estas secuencias sirven como activadores transcripcionales en la mayoría de los promotores de genes que codifican para enzimas glicolíticos, para proteínas ribosomales, i para algunos componentes de la maquinaria transcripcional. Rap 1 p se une también de manera específica a secuencias en la región 5' de los loci HMR y HML y la secuencia telomérica. En estos dos últimos casos Rap 1 p actúa como silenciador. La unión de Rap 1 p a los telómeros es esencial para la estabilidad estructural de los cromosomas. En esta Tesis se ha estudiado el potencial activador de dos tipos de secuencia. La secuencia telomérica o TEL (ACACCCACACACCC) y la secuencia RPG (ACACCCATACATTT) que se encuentra en los promotores de los genes que codifican para los enzimas glicolíticos. Con este objetivo se han construido una serie de plbasmidos de ensayo que contienen las secuencias RPG y TEL clonadas en la región 5' de un promotor mínimo CYC1 fusionado al gen de ensayo lacZ. Una copia única de cualquiera de estas secuencias es capoz de activar la transcripción entre 10 y 15 veces respecto a los niveles basales sin que haya diferencias significativas entre las secuencias TEL y RPG. Sin embargo, mientras que dos secuencias RPG en tándem actúan de manera sinérgica aumentando la respuesta de 20 a 30 veces respecto a una secuencia única, dos secuencias TEL igualmente en tándem sinergizan de manera mucho más modesta. Los ensayos de retardo electroforético y de footprinting in vivo demuestran por un lado que la diferencia entre las secuencias RPG y TEL en cuanto a capacidad de producir un efecto sinérgico sobre la transcripción no se debe a una diferencia de afinidad de las dos secuencias por Rap 1 p; y por el otro lado que el efecto sinérgico producido por dos sitios de unión de Rap 1 p en tándem no se explica ni por la cooperatividad de unión al ADN ni por la mayor ocupación de estos sitios con respecto a un sitio único de Rap 1 p in vivo. Los ensayos de permutación circular y defootprinting in vitro, utilizando radical hidróxilo o permanganato potásico, indican que Rap 1 p es capaz de formar complejos estructuralmente diferentes con secuencias de ADN dentro de un mismo consenso. El uso de variantes de las secuencias TEL y RPG indica que la composición de la mitad 3' de la secuencia consenso de unión de Rap 1 p influye tanto en la estructura del ADN en el complejo Rap 1 p-ADN como en el efecto sinérgico sobre la transcripción in vivo. Los análisis del potencial activador de diferentes sitios de unión de Rap 1 p en cepas deficientes en nucleosomas indica que parte del efecto sinérgico es debido a una contrarepresión del efecto inhibidor de la cromatina mediado por dos sitios de unión de Rap 1 p. El uso de mutantes que afectan la función de Rap 1 p han mostrado que los factores Gal11p y Sir4p no son responsables del diferente potencial activador de las secuencias TEL y RPG.

Autor: HONRUBIA MARCOS M. PILAR.
Año: 1998.
Universidad: LEON.
Centro de lectura: BIOLOGIA.

Resumen: En este trabajo se ha realizado la localización en el genoma de B. lactofermentum de un fragmento continuo de 6.727 pb que contiene los genes murC, ftsQ y ftsZ, pertenecientes a la agrupación génica dcw, así como tres marcos de lectura abiertos de función desconocida, que hemos denominado como Yfih, orf5 y orf6. Se ha profundizado en el estudio de los genes ftsQ y ftsZ, pudiendose determinar por los estudios de interrupción génica realizados, que la presencia del producto codificado por estos genes es esencial para el crecimiento y la viabilidad celular en B. lactofermentum. La expresión heteróloga del gen fstZ de B. lactofermentum en E. coli conduce a la filamentación y la presencia de este gen en B. lactofermentum provoca alteraciones que afectan a la morfología celular. Este mismo hecho puede ser observado cuando el gen ftsQ de B. lactofermentum se encuentra en plásmidos de alto número de copias, tanto en este microoorganismo como en E. coli. La transcripción de los genes clonados en este trabajo es compleja y con la excepción de la ORF5 todos ellos presentan mensajeros monocistrónicos y bi-o policistrónicos con los genes situados corriente arriba o corriente abajo de ellos. EL gen fstZ presenta al menos cuatro inicios de transcripción , determinados por extensión a partir de un cebador, y se han caracterizado distintas zonas promotoras para este gen que incluyen los distintos inicios de transcripción detectados, presentando todas ellas actividad promotora.

Autor: OVALLE FERNANDEZ SERGIO.
Año: 1998.
Universidad: LEON.
Centro de lectura: BIOLOGIA .

Resumen: Mediante la técnica de PCR se han amplificado, clonado y secuenciado fragmentos de DNA que codifican los extremos N-terminales de los transportadores de dopamina, noradrenalina y serotonina de ratón. Se ha estudiado la distribución de los mismos en diferentes áreas cerebrales y tejidos extracerebrales de ratón, encontrándose que se hallan ampliamente distribuidos en las zonas estudiadas, aunque presentan niveles de expresión muy bajos. Se han obtenido anticuerpos policlonales específicos para cada uno de estos transportador, usando proteínas hridas y péptidos sintéticos como antígenos. Con estos anticuerpos se han detectado, en preparaciones de proteínas de mambrana de cerebro de ratón, el transportador de dopamina como una proteína de 82 kDa, el de noradrenalina como una proteína de 70 kDa y el de serotonina como una proteína de 71 kDa. Los anticuerpos obtenidos para el transportador de serotonina nos han permitido inmunodetectar éste en secciones histológicas de encéfalo, detectando la presencia de esta proteína tanto en los cuerpos celulares de neuronas, como en fibras nerviosas pertenecientes a los núcleos del rafe.

Autor: POZUELO RUBIO MERCEDES .
Año: 1998.
Universidad: CORDOBA.
Centro de lectura: CIENCIAS.

Resumen: En Chamydomonas reinhardtii la ruta de asimilación de nitrato está regulada de forma muy precisa por condiciones nutricionales y ambientales. El objetivo de este trabajo ha sido determinar los mecanismos a través de los cuales se lleva a cabo esta regulación, y la implicación de los mecanismos de fosforilación/desfosforilación y unión a proteínas 14-3-3 en estos procesos de regulación. Los resultados muestran que la presencia de calcio intracelular, que media la activación de proteínas quinasas dependientes de calciocalmodulina, da lugar a la regulación transcipciona negativa de los Sistemas I y II de transporte de nitrato/nitrito. La presencia de elevados niveles de AMPc, inducidos por isobutil metil xantina, genera una señal negativa para la regulación postraduccional de los Sistemas I, II y III de transporte de nitrato/nitrito. Al mismo tiempo, llevamos a cabo la fosforilación de un oligopéptido de la secuencia de la proteína NAR2, integrante de los Sistemas I y II. Determinamos, asimismo, que la NR de C. reinhardtii no regula su actividad, de la misma forma que en plantas, por un mecanismo de fosforilación y unión a proteínas 14-3-3, pero la isoenzima GS1 de la glutamina sintetasa se fosforila por una PK dependiente de calciocalmodulina y se une a proteínas 14-3-3. Analizamos que el NO3 es una señal nutricional que regula no sólo su propio proceso de asimilación a través de productos derivados de su reducción, sino también, por sí mismo, es una señal reguladores para otros procesos celulares, como la gametogénesis, en C. reinhardtii.

Autor: REXACH BENAVIDES JESUS.
Año: 1998.
Universidad: CORDOBA.
Centro de lectura: CIENCIAS.

Resumen: Los transportadores de nitrato/nitrito juegan un papel primordial en la ruta de asimilación de nitrato. Estudios previos han demostrado la existencia de dos Sistemas de transporte de alta afinidad, en C. reinhardtii, para el nitrato (HANT) o nitroto (HANiT). El Sistema I, (HANT/NANiT), codificado por los genes Nrt2;1 y NaR2; Y EL Sistema II, (HANT), codificado por los genes Nrt2;2 y Nar2 (Quesada et al.,1994). En el presente trabajo se han identificado y caracterizado tres HANiT. 1) El Sistema III requiere una señal de nitrato para su expresión, se bloquea por amonio y se inhibe por bajo C/2, pero no se afecta por cloruro o inhibidores de canales de cloruro. Posiblemente está codificado por el gen Nrt2;3. 2) El Sistema IV no requiere una señal de nitrato para su expresión, se induce en condiciones de bajo CO2, su actividad se bloquea por CO2, se inhibe por cloruro e inhibidores de canales de cloruro, pero no se afecta por amonio. Posiblemente está codificado por Nrt2;4. 3) NAR1 que corresponde a una proteína integral de membrana de masa molecular de 30 kDa que se localiza en la envuelta del cloroplasto, muestra una alta conservación con transportadores bacterianos del tipo FOCA-y NIRC, y regula la asimilación de nitrato según la disponibilidad de carbono. Se pone de manifiesto que la entrada de nitrito al cloroplasto es un proceso mediado y regulado, y que además de NAR1, deben existir otros transportadores de nitrito que regulen su entrada al cloroplasto. Además, en C. reinhardtii el transporte de potasio es esencial para el crecimiento en nitrato en medios alcalinos. Se sugiere que existen varios transportadores de potasio, y que el transporte de potasio regula el gradiente de protones necesario para el eficiente transporte y asimilación de nitrato.

Autor: MATE PEREZ M. JESUS.
Año: 1998.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: GEOLOGIA.

Resumen: El trabajo que se presenta en esta tesis tiene como objetivo ampliar la información estructural sobre las catalasas y revisar algunos aspectos de su mecanismo enzimático. Para ello se ha resuelto la estructura tridimensional de la catalasa A de Sacharomyces cerevisiae y de varios mutantes de ésta y de HPII. La técnica empleada es la difracción de rayos X. El análisis de estas estructuras aporta inforamción sobre los canales moleculares y sobre la formación de las modificaciones covalentes. En cuanto a los canales, se han identificado dos: uno en forma de embudo que sería el de entrada de los substratos y un segundo, bifurcado, a través del cual se eliminarían los productos del centro activo. Se propone un modelo que explica como se organizan las moléculas de substrato en los canales y el mecanismo enzimático. En lo que respecta a las modificaciones covalentes se han identificado variso residuos implicados en la formación de las mismas.

Autor: MANZANO CUESTA ANNA.
Año: 1998.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: ODONTOLOGIA.

Resumen: La fosfofructo-2-quinasa/fructosa-2,6-bisfosfatasa (PFK-2FBPasa-2) es un enzima bifuncional encargado de la síntesis y degradación de la Fructosa-2,6-P2, un metabolito clave en la regulación de glucólisis, ya que es el principal activador alostérico de la fosfofructoquinasa-1 e inhibidor de la Fructosa-1,6-bisfosfatasa. Se han descrito varios genes que codifican para las diferentes isoformas de la PFK-2/FBPasa-2 que se diferencian en su regulación y distribución tisular. En este trabajo de Tesis doctoral se han descrito dos nuevos genes (PFKFB3 i PFKFB4) que codifican para las isoformas de PFK-2/FBPasa-2 ubicua i de testículo humano. La isoforma ubicua se aisló a partir de una genoteca de cerebro humano fetal, este enzima bifuncional se expresa en todos los tejidos, así como en las diferentes líneas celulares analizadas. El cDNA completo se subclonó en un vector de expresión y la proteína funcional de 58 kDa fue sobreexpresada en células eucariotas. En la zona 3' UTR de la secuencia descrita se observó la presencia de motivos AUUUA que tienen relación con oncogenes y confieren inestabilidad al RNAm. Las características cinéticas de la PFK-2/FBPasa-2 ubicua junto con los altos niveles de expresión observados en células tumorales sugieren la importancia dse este isoenzima en la regulación del metabolismo de sistemas proliferativos. El cDNA completo del isoenzima del testículo humano se obtuvo por técnicas de RT-PCR. Este cDNA codifica poara una proteina funcional de 55 kDa y se expresa de forma específica en este tejido. Los experimentos de hibridación "in situ" sobre cortes de testículo mostraron una localización siguiendo el patrón típico de la maduración de las células germinales que era coherente con el patrón de expresión de esta isoforma durante el desarrollo. Por otra parte también el DNA correspondiente a la zona 5' del gen ha sido clonado y secuenciado y se han caracterizado posibles elementos reguladores tanto en la zona promotora como en el primer intrón. Los genes codificantes para ambos isoenzimas de la PFK-2/FBPPasa-2 se localizaron mediante la técnica de FISH sobre cromosomas metafásicos humanos. EL gen PFKFB3 codificando para la isoforma ubicua en el cromosoma 10p14-p15 y el gen PFKFB4 codificando par la PFK-2/FBPasa-2 de testículo en el cromosoma 3 p21-p22.

Autor: GUARNE CABELLO ALBA.
Año: 1998.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: QUIMICA.

Resumen: Se ha determinado la estructura tridimensional de la forma Lb de la proteasa leader del virus de la fiebre aftosa mediante cristalografía de rayos X. La proteasa leader es la proteína codificada en el extremo aminoterminal de la poliproteína viral y tiene una función doble, por un lado se autolibera de la poliproteína y posteriormente, inhibe la síntesis proteica de la célula huésped mediante el corte en el elF4G. Inicialmente, se determinó por reemplazo isomorfo múltiple (MIR) la estructura del mutante de delección carboxiloterminal Lbshort-C51A. Posteriormente, se determinó por reemplazo molecular la estructura del mutante inactivo de longitud normal Lb-C51A. La proteasa leader contiene una región globular con la topología de las cisteinproteasas de la familia de la papaína y una extensión carboxiloterminal flexible. La estructura del mutante Lb-C51A revela que el autoprocesamiento de la proteasa puede producirse en trans, aunque ciertos motivos estructurales indican que el procesamiento en cis también puede darse y además información sobre los mecanismos moleculares que permiten que la proteasa leader pueda reconocer dos secuencias de corte distintas.

Autor: MORON CONCEPCION JOSE ANTONIO.
Año: 1998.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: MEDICINA.

Autor: CARRETERO SANCHEZ M. VICTORIA.
Año: 1998.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGIA.

Resumen: La síntesis de S-adenosilmetionina a partir de metionina está catalizada, en el hígado de los mamíferos, por dos isoformas de la metionina adenosiltransferasa (MAT), que presentan características distintas de las de la enzima extrahepática. La limitación del O2 ambiental reduce, in vivo, la actividad y la expresión de las isoformas hepáticas, por lo que se ha propuesto que la hipoxia local provocada por el consumo crónico de etanol (Fukui y cols., 1990; Arteel y cols., 1997) podría estar implicada en las alteraciones del metabolismo de la metionina observadas en la cirrosis alcohólica (Chawla y Jones, 1994; Chawla y cols., 1996). En este estudio se muestra que la hipoxia provoca la inactivación de la MAT hepática en cultivos primarios de hepatocitos de rata, una inactivación en la que participan la inducción de óxido nítrico sintasa y el descenso de la concentración intracelular de glutation. Asimismo, la hipoxia reduce la expresión de la MATactuando tanto a nivel transcripcional como postranscripcional, gracias a un mecanismo de detección de las variaciones de la concentración de O2 basado en una hemoproteína independiente de la cadena de transporte electrónico mitocondrial y de las concentraciones intracelulares de ATP y de H2O2. Por último, el 3-metilcolantreno, un hidrocarburo capaz de interferir en el mecanismo de regulación de la expresión génica activado por la hipoxia (Schmidt y Bardfield, 1996; Gradin y cols, 1996; Reisdorph y Lindahl, 1998), inhibe la expresión de la Mat tanto in vivocomo in vitro y este efecto es independiente de la activación del receptor de arilhidrocarburos y de la acción inductora de los glucocorticoides.