BIOQUIMICA MOLECULAR, 4

Autor: ALDEA MANSILLA CARMEN.
Año: 2003.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: El diagnóstico de las bacteriemias asociadas a catéter (BAC) por Staphylococcus coagulasa negativa (SCN) se basa en el aislamiento del mismo microorganismo, especie y antibiograma. En los aislados de sangre y punta de catéter. Se pretende estudiar la realidad molecular de las BAC por SNC. Considerado como método de referencia. Además, dicho estudio se realizó con el aislamiento de todos los morfotipos posibles de los cultivos. En base a esto se definieron BAC o no BAC de 61 episodios. Comparándo los resultados con los obtenidos en los métodos de rutina, basados en la identificación fenotípica (especie, biotipo y antibiotipo) de un único morfotipo de los aislados de sangre y punta de catéter, por último, se compararon los resultados con un método de rutina optimizado, basado en la identificación fenotípica de todos los morfotipos aislados en los cultivos.

Autor: APOLINARIO FERNÁNDEZ DE SOUSA ROLDÁN ARANZAZU.
Año: 2003.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS .

Resumen: El virus de la hepatitis C (VHC) es actualmente la causa más importante de enfermedad hepática crónica y muerte relacionada con el hígado. De acuerdo con la Organización Mundial de la Salud, en el año 2002 un 3% de la población mundial estaba infectada por el VHC cuya prevalencia aumenta año a año, sobre todo en los países subdesarrollados y a pesar de los tratamientos antivíricos existentes. La heterogeneidad genética y antigénica del virus, junto con la aparente incapacidad para desarrollar una respuesta antivírica eficaz por parte del sistema inmunitario, hace que la infección crónica sea extraordinariamente frecuente en los sujetos expuestos al virus, convirtiéndose en un grave problema de salud pública y asistencia sanitaria por su elevada morbilidad. Así, un 50-80% de los sujetos expuestos al VHC desarrollan una enfermedad hepática crónica, un 20-30% de ellos evolucionan a cirrosis y un 1-5% presentarán un carcinoma hepatocelular. Todo proceso que participe en la respuesta inmunitaria es primordial para la persistencia del virus y la evolucion hacia la cronificación. Uno de estos procesos es la migración de las células inmunitarias desde el torrente sanguíneo al tejido hepático inflamado, en el cual las quimioquinas parecen jugar un papel esencial. En esta Tesis Doctoral se demuestra que en pacientes con hepatitis crónica C (HCC) existe una intensa expresión de las quimioquinas CC y CXC, RANTES (CCL5), MIP-1beta (CCL4), IP-10 (CXCL10) y MIG (CXCL9), tanto en el hígado como en el suero, que se correlaciona significativamente con la actividad histológica de la enfermedad hepática. Además, se demuestra que la mayoría de los linfocitos T intrahepáticos de estos pacientes expresan los receptores de quimioquinas CCR5 y CXCR3. Un dato muy interesante de este trabajo es que las concentraciones d eIP-10 (CXCL10) en el suero de pacientes con HCC presentan un gran valor como factor predictivo de no respuesta en pacientes infectados con genotipo. 1. Finalmente, se muestran datos experimentales que evidencian el importante papel que tanto las citoquinas IL-1beta, TNF-alfa e IFN-gamma, así como la proteína no estructural 5A y la estructural core del VHC tienen en la regulación de la expresión génica de las quimioquinas RANTES (CCL5), IP-10 (CXCL10) y MIG (CXCL9) por parte del hepatocito. En conclusión, los datos obtenidos en esta Tesis Doctoral demuestran que las quimioquinas juegan un importante papel patogénico en la hepatitis crónica C y que la determinación de la concentración sérica de IP-10 (CXCL10) en pacientes infectados con genotipo 1 identifica a un subgrupo de pacientes que podrían beneficiarse de pautas terapéuticas más ajustadas al perfil de estos pacientes difíciles de curar.

Autor: GARCÍA QUINTÁNS M. NIEVES.
Año: 2003.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: UNIVERSIDAD COMPLUTENSE MADRID.

Resumen: Este trabajo experimental se ha centrado en la caracterización de la regulación molecular del sistema de transporte de citrato de Lactococcus lactis subsp.lactis biovar diacetylactis. El trabajo de investigación ha incluido el estudio de: 1,- La regulación de la expresión del operón citQRP a nivel transcripcional y posttranscripcional. 2,- La influencia del transporte y metabolismo de citrato en la fisiología y metabolismo bacteriano. Los estudios del transcrito y de los fragmentos de ARN generados pro la acción de ribonucleasas fueron complementados con: 1,- Manipulación genética del operón citQRP para realizar estudios fisiológicos con bacterias portadoras de las construcciones obtenidas. 2,- Detección de metabolitos del citrato por la técnica de resonancia magnética nuclear en la estirpe natural L.diacetylactis CRL264 en distintas condiciones fisiológicas. 3,- Detección de las proteínas CitQ y CitR mediante síntesis de ARN (transcipcción) y de las proteínas codificadas (traducción) in vitro. Los resultados obtenidos nos han permitido demostrar que la expresión del sistema de transporte de citrato se induce a nivel trasnscripcional por estrés de pH. Esta inducción permite la supervivencia de L.diacetylactis a pH ácidos y conlleva una activación del sistema de transporte, que resulta en un eficiente cometabolismo de azucares y citrato y contribuye a la homeostasis del pH intracelular de lactococcus. Así mismo, el ARNm CitQRP es procesado en una compleja estructura secundaria (estructura I) tanto en L.diacetylactis como en E.coli. Este procesamiento afecta drásticamente al plegamiento de la especies de ARN-3' generadas, provocando un exposición del resto de estructuras del ARN a la actividad de exo y endoribonucleasas. En E.coli, el ARNm cit es procesado en la estructura I por la Rnasa E (procesamiento mayoritario) y por la Rnasa III (porocesamiento minoritario). En L.diacetylactis, se ha detectado la presencia de ribonucleasas homólogas a la Rnasa III y a la PNPasa de E.coli. En E.coli, el desacoplamiento de las traducciones de los genes citQ y citR conlleva a un incremento de los niveles de expresión de citP y no afecta al procesamiento en la estructura I. En Lactococcus la interrupción de citR provoca una reducción de la expresión de citP en cis, indicando una traducción acoplada de estos dos genes adyacentes. Nuestros resultados enmarcan la inducción de ls sistema de transporte de citrato dentro de la respuesta adaptativa de L.lactis al estrés por ácido. Además, hacen proponer un modelo de regulación posttranscripcional del operón citQRP. En este modelo la estructura I sería determinante de la regulación, ya que su procesamiento por ribonucleasas bacterianas afectaría a la traducción de citQ, citR y citP.

Autor: RUIZ ESPEJO FRANCISCO.
Año: 2003.
Universidad: MURCIA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE MURCIA.

Resumen: Se investiga la expresión de las colinesterasas en mama normal y tumoral, así como en ganglios axilares normales y afectados de metástasis a consecuencia del cáncer de mama. La mama humana contiene niveles importantes de actividades acetilcolinesterasa (AChE) y butirilcolinesterasa (BuChE). La medida de ambas actividades en muestras pareadas normales y tumorales, tomadas de una misma paciente, revela que tras la transformación neoplástica aumenta la actividad AChE y disminuye la BuChE.Al considerar todas las muestras normales y tumorales, la actividad AChE aumenta casi al doble en las últimas, mientras que la actividad BuChE disminuye un 65%. El contenido de proteínas en carcinomas de mama aumenta un 30% en comparación con el tejido control, lo que sugiere que la neoplasia intesifica la síntesis de proteínas en mama y/o facilita la entrada de plasma sanguíneo al epitelio mamario. No parece que los cambios en las actividades AChE y BuChE estén correlacionados con parámetros clinicopatológicos del tumor, tales como tamaño, grado histológico, cantidad de RE y RP, o nivel de necrosis. Cerca del 25% de la actividad AChE y 70% de la BuChE en mama normal o tumoral se extrajeron con tampón salino sin detergentes; un 55% de la AChE remanente se liberaron con tamón salino más detergente. Los Extractos de mama contiene formas G2A(87%) y GIA (13%) de AChE, y G4H(84%) y G1H (16%) de BuChE. Una fracción al menos de los dímeros de AChE llevan restos de GPI para fijarse a las membranas. La neoplasia no afecta a la composición de formas moleculares de AChE y BuChE en mama. La mayoría de las moléculas de AChE de mama se ligan a las letinas Con A,LCA,RCA,SNA y WGA. La diferencia en los porcentajes de asociación de WGA con la AChE en mama normal y tumoral revela que la neoplasia afecta al procesamiento de sus oligosacáridos. Todas las moléculas de AChE en mama normal y tumorl se fijaron al anticuerpo HR2, y sólo algunas al AE1.Las formas de BuChE se unieron en su totalidad al antisuero anti-BuChE. Las escasas diferencias en la interacción de los anticuerpos con la ChEs de mama normal y tumoral indican que su estructura no cambia por la neoplasia. Los ganglios linfáticos axilares poseen una cantidad considerable de actividad AChE y mucho menos de cambio, ni la actividad AChE disminuye cerca de seis veces en los ganglios afectados por metástasis. En cambio, ni la actividad de BuChE ni la cantidad de proteína se modifican de forma significativa por la metástasis. Una fracción importante de la BuChE en ganglios normales o con metástasis se extrae con medios salinos sin detergente. Por el contrario, es necesario emplear detergente para extraer la mayor parte de la actividad AChE. Los ganglios linfáticos normales contienen abundantes moléculas A4,G2A y G1A de AChE, y menos G4H y A8. En los ganglios afectados por metástasis sólo se identifican formas G2A y G1A. Los ganglios normales y los afectados por metástasis muestran la misma composición de formas de BuChE: numerosas moléculas G4H y menos G4A y G1H. Así pues, la metástasis no sólo disminuye la actividad AChE en los ganglios sino que también altera la composición de sus formas G2A y G1A. Los ganglios normales y los afectados por metástasis muestran la misma composición de formas de BuChE:numerosas moléculas G4H y menos G4A y G1H. Así pues, la metástasis no sólo disminuye la actividad AChE en los ganglios sino que también altera la composición de sus formas moleculares, un hecho que podría ser de utilidad para el diagnóstico. Las actividades AChE y BuChE de los ganglios linfáticos normales o con metástasis se ligan en gran medida a Con A,LCA,WGA y RCA. La mayor interacción de WGA con las moléculas G2A y G1A de AChE del ganglio (80%), respecto a las de mama neoplásica (53%), revela que los componentes del ganglio no vienen de la mama, a menos que la síntesis de sus oligosacáridos se modifique tras la entrada de las células neoplásicas en el ganglio. El marcaje con anticuerpos anti-AChE y anti-BuChE de las ChEs extraídas de mama y ganglios linfáticos revela en ambos tejidos subunidades de AChE de 72 kDa y BuChE de 82kDa. Los resultados excluyen que la transformación neoplásica de mama y del ganglio linfático origine cambios estructurales significativos en las subunidades de AChE y BuChE.

Autor: PEÑA VALVERDE ROCIO .
Año: 2003.
Universidad: ALCALA.
Centro de lectura: FACULTAD DE MEDICINA.
Centro de realización: UNIDAD DE ARTERIOSCLEROSIS. HOSPITAL CARLOS III.

Resumen: Con este estudio hemos pretendido evaluar el efecto de diferentes factores ambientales y genéticos sobre la respuesta de los lípidos y lipoproteínas plasmáticas al tratamiento con 20mg diarios de un inhibidor de la hidroximetil glutaril CoA reductasa. Los factores analizados fueron el sexo, la edad, el índice de masa corporal, los niveles lipídicos pretratamiento, el consumo de tabaco, el genotipo de la apolipoproteína e, el polimorfismo de la zona promotora de la apolipoproteína a-i y el polimorfismo avaii del gen del receptor de las LDL. De los factores analizados los que mejores predijeron la respuesta de los lípidos y lipoproteínas plasmáticas al tratamiento hipolipemiante fueron sus propios niveles basales. El polimorfismo avaii del gen del receptor de las ldl moduló la repuesta del colesterol total y colesterol-ldl al tratamiento. El polimorfismo de la zona promotora de la apolipoproteína a-i influyó en la respuesta del colesterol-hdl. en cambio, factores como el genotipo de la apolipoproteína e, el sexo, el índice de masa corporal, la edad y el tabaco no influyeron en la variación de lípidos y lipoproteínas plasmáticas al tratamiento hipolipemiante en sujetos hipercolesterolémicos tratados de forma ambulatoria. Además, este estudio también nos ha permitido determinar la prevalencia de los diferentes polimorfismos analizados en una población de sujetos españoles con hipercolesterolemia primaria. De los resultados obtenidos se deduce que no existe un único parámetro que justifique una parte significativa de la variabilidad en la respuesta hipolipemiante al tratamiento con estatinas. Además, probablemente existan otros factores ambientales y genéticos, aún no identificados, que bien aisladamente o interaccionando con otros ya conocidos participen significativamente en la magnitud de las modificaciones lipídicas con el tratamiento.

Autor: SANCHO ANDRÉS PATRICIA.
Año: 2003.
Universidad: ALCALA.
Centro de lectura: FACULTAD DE BIOLOGÍA.
Centro de realización: CIENTÍFICAS..

Resumen: El cadmio es un metal pesado que constituye uno de los principales contaminantes ambientales y ocupacionales y, además de causar intoxicaciones agudas, está incluido en el grupo I de carcinógenos humanos. Este metal ejerce numerosos efectos dañinos en las células y, por ello, induce muerte celular en forma de apoptosis y de necrosis, siendo la apoptosis la forma predominante. La función principal de la apoptosis en un organismo pluricelular es la eliminación selectiva de una célula, evitando el daño a las células adyacentes. Es, por tanto, muy importante el conocimiento de los mecanismos que en último término deciden la adopción de uno u otro modo de muerte celular. En esta Tesis Doctoral, además de un estudio en profundidad de la vía de apoptosis inducida por cadmio, se analizan los factores responsables de la generación de necrosis en células tratadas con cadmio en condiciones de supresión de glutation. La aparición de necrosis se debe a una combinación de factores dependientes e independientes de la acumulación de especies reactivas del oxígeno derivada de la falta de glutation, principal defensa antioxidante celular. Los agentes antioxidantes constituyen una de las principales defensas del organismo frente a la oxidación producida en la cadena respiratoria mitocondrial y frente al estrés oxidativo. En esta Tesis Doctoral se muestra por primera vez el efecto de un antioxidante, la catalasa, como potenciador de la citotoxicidad de inductores típicos de estrés, como el cadmio y el choque térmico. Este fenómeno se produce por una inhibición de la respuesta de estrés inducida por estos agentes, lo que sugiere la importancia de la oxidación celular en la modulación de la respuesta de estrés.

Autor: LOPEZ VAZQUEZ JOSE CARLOS.
Año: 2003.
Universidad: ALCALA.
Centro de lectura: FACULTAD DE FARMACIA.
Centro de realización: CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGIA (CSIC)..

Resumen: En este trabajo se ha abordado la caracterización de un "cluster" de Streptomyces antibioticus el cual está implicado en la producción de un poliquétido aromático. Por comparación con la base de datos se han asignado una función a los productos génicos deducidos de las regiones codificantes encontradas en dicho "cluster". También se procedió a la caracterización de los genes reguladores de la biosíntesis del poliquétidos de S. antibioticus asociados a los genes biosintéticos. Dicha caracterización reveló la dependencia transcripcional del gen regulador específico de ruta, ORFI por el sistema de dos componentes, ORD1/ORFD2. Se ha demostrado que el mecanismo de acción consiste en la unión del gen regulador de respuesta a la zona promotora del gen regulador específico, favoreciendo su transcripción. Una vez ha ocurrido ésta, también se demostró que el producto génico de ORFI es capaz de interaccionar con la zona promotora de la poliquétido sintetasas de S. antibioticus.

Autor: MENOR SALVÁN CESAR.
Año: 2003.
Universidad: ALCALA.
Centro de lectura: FACULTAD DE MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA (UNIVERSIDAD DE ALCALÁ)..

Resumen: En la presente tesis se expone la Farmacogenética de la azatioprina particularizando en el enzima tiopurina metil transferasa (TPMT) y el estudio de esta en la población española. Asimismo se estudia el mecanismo de toxicidad de la azatioprina. En la primera parte de esta tesis se muestra un método para la determinación de la actividad TPMT y el estudio de la actividad del enzima en la población española. Este resultado es de una gran relevancia a la hora de mejorar la seguridad y eficacia del tratamiento clínico con azatioprina, pues se incluye una guía para la dosificación del fármaco en función de la actividad individual de esta enzima. En segundo lugar, se estudia el mecanismo de toxicidad de la azatioprina en un modelo de hepatocitos de rata en cultivo primario, encontrándose que el fármaco induce necrosis por un mecanismo mediado por la permeabilidad mitocondrial transitoria y activación JNK y p38 quinasa. Se encuentra que es la depleción de glutation la responsable de la toxicidad y que el cotratamiento azatioprina/N-acetilcisteína mejora la metabolización del fármaco y previene completamente la toxicidad de éste en nuestro modelo de hepatocitos en cultivo. Este último hallazgo puede tener importantes repercusiones clínicas, ya que la dosificación conjunta del fármaco con NAC podría evitar parte de los efectos adversos provocados por la azatioprina.

Autor: ESCRIBANO ILLANES OSCAR.
Año: 2003.
Universidad: ALCALA.
Centro de lectura: FACULTAD DE MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA (UNIVERSIDAD DE ALCALÁ).

Resumen: En la presente tesis se analiza el papel de la insulina y de su sustrato IRS-4 en los procesos de proliferación y diferenciación hepática. En la primera parte de esta tesis se ha estudiado el efecto del tacrolimus (FK506), un inmunosupresor ampliamente utilizado en clínica, sobre la expresión del receptor de insulina hepático durante el proceso de regeneración que sigue a una hepatectomía parcial. Con los resultados obtenidos, se demuestra que el pretratamiento con el fármaco induce un incremento en la regeneración hepática, al menos en parte, debido a un aumento en la expresión del receptor de insulina, lo que de forma concomitante induce un incremento en la sensibilidad de los hepatocitos regenerantes a esta hormona. Este resultado es de una gran relevancia a la hora de analizar la trascendencia del pretratamiento con FK506 en la evolución de los transplantes de hígado segmentario. En segundo lugar, se caracteriza por primera vez, la expresión de IRS-4 (Insulin Receptor Substrate-4) en hígado de rata, así como la activación de esta proteína en respuesta a insulina e IGF-I (Insulin-like growth factor-I). Además, se demuestra la inducción de esta proteína durante el proceso de regeneración hepática, lo que sugiere un importante papel de esta proteína en este proceos. Por último, en la presente tesis se demuestra la expresión de IRS-4 en Hep G2, una línea celular procedente de un hepatoblastoma humano. En esta línea celular se demuestra que el silenciamiento del gen de IRS-4 mediante la técnica del ARN de interferencia, induce importantes cambios morfológicos, inhibe la proliferación celular e incrementa la sensibilidad de estas células a agentes proapoptóticos como TNF-a más actinomicina D. Este último hallazgo puede tener importantes repercusiones clínicas, ya que la sensibilización de células tumorales a TNF-a, por la depleción de IRS-4, puede constituir una nueva estrategia terapéutica en el tratamiento del hepatoblastoma.

Autor: TEJERA TORROJA M. LUISA.
Año: 2003.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGÍA .
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS.

Resumen: La presente tesis doctoral se encuentra encuadrada dentro del marco de la diagnosis y la profilaxis de una de las enfermedades con mayor incremento en los últimos años: los procesos alérgicos. El estudio de los agentes causantes de dicha alteración, los alergenos, es el paso previo para la comprensión del proceso alérgico cuyo último fin es el abordaje de su prevención y tratamiento. En este trabajo se han realizado estudios con dos alergenos del polen de olivo: Ole e 6 y Ole e 7. Se ha llevado a cabo el aislamiento de un nuevo alergeno, Ole e 7, que tiene una gran incidencia clínica -cerca del 50%- entre los pacientes alérgicos al polen de olivo. La proteína purificada, con una masa molecular de 10 kDa, se ha caracterizado estructural, espectroscópica e inmunológicamente. Se trata de una proteína básica, y muy estable frente a tratamientos térmicos y proteolíticos, lo que facilitaría su carácter alergénico. Por otro lado, para estudiar la estructura y función inmunológica de Ole e 6, se ha abordado su expresión en un organismo eucariótico, la levadura Pichia pastoris. La proteína obtenida en este sistema heterólogo ha sido aislada y caracterizada, y sus propiedades comparadas con la de la forma natural. Esta estrategia de producción provee Ole e 6 en gran cantidad y adecuadamente plegada, hecho que la hace idónea para su empleo en el análisis de la estructura tridimensional del alergeno. Finalmente, se ha encontrado una significativa correlación entre las sensibilidades de los pacientes a estas dos alergenos, sugiriendo una asociación molecular entre ellos en el momento de la inducción de la respuesta alérgica.

Autor: SÁNCHEZ GÓMEZ M. MICAELA .
Año: 2003.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: QUÍMICA.
Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA.

Resumen: La finalidad de este trabajo ha sido aislar microorganismos con capacidad para metabolizar Simazina y seleccionar las condiciones que permitirían sus aplicación en sistemas de descontaminación, utilizando bacterias inmovilizadas en soportes cerámicos o bien en alginato. Para ello una vez aislada una bacteria, clasificada taxonómicamente como Klebsiella planticola, capaz de degradar simazina y otros xenobióticos, se identificaron los intermediarios metabólicos así como los productos finales de la degradación de la simazina. Se estudiaron las condiciones óptimas para la inmovilización de la biomasa responsable de la biodegradación, considerando el tipo de soporte, la biodisponibilidad de sustrato y las condiciones del proceso. También se establecieron las condiciones que permiten aplicar la capacidad degradativa de las bacterias en sistemas biológicos de descontaminación y se modelizaron mediante simulaciones matemáticas los principales procesos implicados en el sistema biológico de descontaminación: adsorción-desorción del sustrato y de las células inmovilizadas.

Autor: OLIVARES SÁNCHEZ M. CONCEPCIÓN.
Año: 2003.
Universidad: MURCIA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: La melanogénesis es la ruta bioquímica responsable de la síntesis de melaninas que, en mamíferos, está restringida a unos orgánulos específicos de los melanocitos llamados melanosomas. Este proceso está calizado por al menos tres metaloenzimas que presentan una alta homología (tirosinasa y las Tyrps, Tyrp1 y Tyrp2), aunque sus capacidades catalíticas son diferentes, tanto entre ellas como entre distintas especies. El objetivo principal de esta Tesis ha sido el estudio de las relaciones estructura-función de las proteínas de la familia, especialmente de la tirosinasa, la enzima limitante de la velocidad de la ruta. En concreto, estudiamos: i)las diferencias entre las propiedades enzimáticas de las tirosinasas humana y de ratón; ii) residuos del centro activo de tirosinasa que participaran en la unión del cofactor metálico cobre y el reconocimiento de los sustratos; iii) papel de la glicosilación de la tirosinasa. Las conclusiones más importantes de este estudio han sido: 1- La tirosinasa es la enzima responsable en humanos de la actividad DHICA oxidasa de la ruta melanogénica, en oposición a la enzima de ratón, que es incapaz de catalizar esta reacción (con anterioridad se había demostrado que en ratón es Tyrp1). 2- Se ha identificado de forma, inequívoca el papel de dos importantes aminoácidos (His) del centro activo de la tirosinasa de ratón: His390 es el tercer ligando del cobre en la región de unión a metal B de la enzima, mientras qwue His389 es responsable de la interacción enantioespecífica de la enzima con los difenoles, pero no con los monofenoles. Esto ha propiciado la introducción de relevantes aportaciones al mecanismo del ciclo catalítico de tirosinasa, entre las que destaca al establecimiento de la inequivalencia de los dos cobres del centro activo: los monofenoles se unen al cobre A y los difenoles al B. 3- La unión del cobre es un evento posterior en la maduración post-traduccional de la enzima a la adquisición de la conformación tridimensional nativa, con el centro activo completamente constituido. 4- Se demuestra por vez primera que el sitio de unión a metal A de Tyrp1 (cuyo cofactor se desconoce) es capaz de unir cobre en en contexto de tirosinasa y presentar sus actividades catalíticas, lo que refuerza la idea de que Tyrp1 es una isoenzima de tirosinasa de baja actividad específica. 5- La tirosinasa tiene dos sitios de glicosilación dependiente de conformación: es necesario que se produzca una interacción específica entre las regiones peptídicas de unión de cobre A y B para que tenga lugar un cambio conformacional que permita la ocupación de estos dos sitios y la completa maduración de la enzima.

Autor: LORENTE PÉREZ M. MAR.
Año: 2003.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: QUÍMICA.
Centro de realización: CENTRO DE INVESTIGACIONES BIOLÓGICAS (CSIC).

Resumen: El grupo Polycomb comprende un grupo heterogéneo de proteínas que se van a encargar del mantenimiento estable de estados transcripcionalmente inactivos durante el desarrollo. El mecanismo de memoria celular proporcionado por las proteínas Polycomb está ampliamente conservado a través de la escala evolutiva. Los genes diana más conocidos de las proteínas Polycomb son los genes Hox. Los genes Hox codifican para factores transcripcionales activos durante el desarrollo embrionario en distintos segmentos del individuo, de tal forma que, cada segemento tiene un código Hox único responsable de su identidad. La expresión diferencial de genes Hox a lo largo del ejer anterior-posterior del embrión tiene como resultado la especificación del eje axial. Cambios en los dominios de expresión de genes Hox originan lo que se conoce como transformación homeótica (un determinado segmento adquiere la identidad de otro situado en una posición distinta en el eje anterior-posterior a consecuencia de un código Hox modificado). Las proteínas Polycomb actúan como complejos multiproteicos. Variaciones en los niveles de proteínas Polycomb en ratón dan lugar a alteraciones en la expresión de genes Hox y a transformaciones homeóticas del esqueleto axial entre otros fenotipos. En nuestro laboratorio se identificaron dos genes Ring1A y Ring1B, cuyos productos eran capaces de interaccionar con la proteína Polycomb murina M33. A diferencia del resto de protéinas Polycomb de ratón, no se había definido una función Polycomb para el ortólogo de Ring1A y Ring1B en Drosophila melanogaster, el objetivo de esta tesis ha sido definir una función Polycomb para la proteína Ring1A. Una primera aproximación al problema ha consistido en la generación de ratones con ganancia y pérdida de función Rin1A. Tanto los ratones que sobreexpresan Ring1A como los ratones que carecen de la misma poseen transformaciones homeóticas del esqueleto axial, además de desregulación en el patrón de expresión de genes Hox, ambos, criterios genéticos habitualmente utilizados para asignar una función Polycomb. Para profundizar en la función de Ring1A se ha estudiado la interacción con otros miembros del grupo. El estudio de mutantes dobles para Ring1A y para M33 o Bmi-1, otras dos proteínas Polycomb murinas, ha revelado alteraciones fenotípicas distintas que para los mutantes sencillos indicando interacción entre estas proteínas. Mutantes dobles para M33 y Ring1A poseen alteraciones mucho más severas que los mutantes simples. Además, el cruce de ratones que sobreexpresan Ring1A con ratones que carecen bien de Bmi-1 o bien de M33 reveló un efecto antagónico del exceso de Ring1A. El aumento de la dosis de Ring1A en ausencia de M33 da lugar a un fenotipo mucho más severo que el que presentan los mutantes simples y sin embargo, un exceso de Ring1A en ausencia de Bmi-1 puede corregir parcialmente muchos de los defectos que presentan los mutantes simples. En conjunto, estos experimentos demuestran una función Polycomb para la proteína Ring1A de ratón puesto que hemos demostrado su implicación en regulación de la expresión de genes Hox, su importancia en la generación del esqueleto axial y su interacción genética con otros miembros del grupo.

Autor: GARCÍA RUIZ INMACULADA.
Año: 2003.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: En las enfermedades que cursan con aumento del depósito de hierro en los tejidos, el hígado es el principal órgano dañado, y en él es característica la fibrosis hepática en ausencia de inflamación. Los objetivos del presente trabajo han sido conocer los efectos de las sales de hierro sobre la expresión del gen del procolágeno alfa1(I) y los mecanismos por lo que los producen. Con este fin, utilizamos cultivos confluentes de células estrelladas del hígado tratados con sales de hierro. Este tratamiento provocó un aumento del grado de lipoperoxidación celular, y una disminución de los niveles de GSH intracelular. Además, estos cambios se asociaron con un aumento slectivo de la producción de colágeno respecto al total de proteínas sintetizadas. El pretratamiento de las células con antioxidantes inhibió los efectos de las sales de hierro sobre el gen de procolágeno alfa1(I), indicando la posible mediación del estrés oxidativo en su efecto. Estudios paralelos sobre los efectos de las sales de hierro y del MDA, producto derivado de la lipoperoxidación de membranas biológicas, indicaron que ambos factores estimulan el gen de colágeno a nivel transcripcional. Los efectos positivos sobre el ARNm del colágeno alfa1(I), fueron dependientes de la dosis y el tiempo y requerían la síntesis "de novo" de proteínas. La participación de los aldehídos reactivos fue demostrada por el hecho de que inhibidores de la formación de complejos aldehido-proteína (aductus), anulaban los efectos de las sales de hierro sobre el gen de procolágeno alfa1(I). El efecto sobre el promotro del gen se estudió transfectando las células con el plásmido COLCATl, que contienen el promotor del gen de procolágeno alfa1(I) murino unido al gen de la cloranfenicol acil transferasa. Tras realizar delecciones sucesivas del promotor, determinamos que el efecto de las sales de hierro y el MDA se ejercía a través de la región comprendida entre -220pb + 116pb de este gen. El estudio de los factores de transcripción que participan en el efecto de las sales de hierro y el MDA sobre el gen de procolágeno alfa1(I) se realizó mediante la prueba del retraso de la movilidad del ADN uitlizando cmo sondas cuatro regiones protegidas frente a la DNAasal descritas como FP1, FP2, FP3 y FP4 por Rippe et al (1989). Mediante ensayos de competición y supershift mostraron que Sp1, Sp3 y c-Krox están implicados en el efecto de ambos estímulos sobre el gen de procolágeno alfa1(I). Sp1 y Sp3, actúan sobre las regiones FP2 y FP3 y son factores activadores de la expresión genética. El tratamiento con las sales de hierro o con MDA aumenta la fijación de estos factores a esas regiones c-Krox se une únicamente a FP3 y tiene un efecto represor de la transcripción genética. El tratamiento con hierro o MDA disminuyen la unión de este represor al FP3. Además, las sales de hierro y el MDA provocaron un aumento de los niveles intracelulares de los factores Sp1 y Sp3 que iba precedido de un aumento del ARNm de Sp1. Las mutaciones provocadas en las secuencias GC de las regiones FP2 y FP3 anularon los efectos del hierro y del MDA sobre la activación del gen COL1A1, indicando que es sobre esas dos regiones sobre las que actúan estos agonistas de la expresión genética del colágeno alfa1(I).

Autor: ANDRADE LOBATO RAQUEL.
Año: 2003.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FARMACIA .
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: Dada la importancia clínica de la especie bacteriana Acinetobacter baumannii, principalmente cómo patógeno nosocomial causante de neumonía relacionada a ventilación mecánica y bacterianas, en servicios de UCI, se estudiaron aislados clínicos resistentes a carbapenemas. Se llevo a cabo la detección de genes de resistencia y beta-lactamasas, análisis de los perfiles de clonalidad y valoración de las características clínico-epidemiológicas de los procesos infecciosos que producen. Se incluyeron en el estudio sesenta asilamientos de A.baumannii, resistentes a imipenema y meropenema, obtenidos en ocho hospitales españoles distribuidos por toda la geografía española. Todas las muestras mostraron un elevado grado de resistencia a los antibióticos valorados. Para el estudio de sensibilidad se determinó la concentración míniam inhibitoria (CMI) por el método de dilución en agar siguiendo las normas de la NCCLS. Entre los dieciocho antibióticos valorados la colistina es el único antimicrobiano que presenta una excelente actividad in vitro frente a las este tipo de cepas, limitándose de forma alarmente la terapia antibiótica en las infecciones causadas por A.baumannii multirresistente. Respecto a las características epidemiológicas de los procesos infecciosos producidos por A.baumannii multirresistente el análisis univariado destacó cómo factores de riesgo: una prolongada estancia previa, presencia de mayor 3 factores predisponentes a la infección, antibioterapia previa, enfermedad de base grave (MacCabe 1/2), situación clínica crítica o grave (Winston 1/2), tranqueostomía, vía vascular central y nutrición central. Cuando se ajustó un modelo de regresión logístico condicional solo se comportaron como factores de riesgo independientes la terapia antibiótica previa y la situación crítica o grave el paciente. La RAPD-PCR fue la técnica utilizada para el tipado de los aislados, aportando resultados con un gran poder de discriminación y reproducibilidad. Se distinguieron cinco cepas diferentes distribuidas por los hospitales de estudio, destacándose la facilidad de diseminación inter.- e intrahospitalaria de las cepas de A.baumannii resistentes a carbapenemas. Mediante PCR se detectó la presencia del gen blaIMP por primera vez en aislados clínicos españoles de A.baumannii. Este hallazgo y la recuperación de la actividad de la inmipenema mediada por EDTA a través de ensayos microbiológicos, revela la implicación de una metaloenzima de la familia IMP en la resistencia a las carbapenemas. Es la primera ocasión en la que se describe la presencia de este tipo de carbapenemasa en España. La diseminación de este grupo de enzimas entre diversas especies bacterianas, la inactividad de los inhibidores de beta-lactamasas sobre ellas y la actuación conjunta con otros mecanismos de resistencia de carbapenemas están convirtiendo a las metalo beta-lactamasas de la familia IMP en la diana de nuevos fármacos. El isoelectroenfoque tan sólo desveló la presencia de una beta-lactamasa de pI 6.3, cuya caracterización y actividad serán objeto de posteriores estudios, dejando abiertas nuevas líneas de investigación sobre los mecanismos moleculares de resistencia de A.baumannii a carbapenemas.

Autor: ÁLVAREZ GARCÍA M. MAR.
Año: 2003.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: BIOLOGÍA.

Resumen: La hormona tiroidea ejerce importantes efectos sobre la mayoría de los tejidos de los vertebrados, tanto sobre su crecimiento y desarrollo, como sobre su actividad metabólica. Uno de los principales órganos diana de la T3 es el cerebro, donde la ausencia de esta hormona durante el desarrollo provoca daños irreversibles, ya que procesos como sinaptogénesis, mielinización y migración son procesos dependientes de T3. Las proteínas G heterotriméricas, son capaces de interaccionar con un gran número de receptores de neuromoduladores, neurotransmisores y hormonas, y transmitir la información al interior celular, gracias a que regulan la actividad de diversos efectores específicos. Se sabe que la hormona tiroidea lleva a cabo su acción, al menos parcialmente, modulando algún componente de la ruta de las proteínas G. Nosotros hemos observado que en ratas durante el desarrollo, el hipotiroidismo regula la expresión del gen Galpahail en cerebelo, mesencéfalo y corazón. En cerebelo, la ausencia de T3 reduce los niveles de ARNm y de proteína Galphail. Los tipos celulares afectados son las neuronas granulares y en mayor extensión las células de Purkinje. Estos efectos observados en cerebelo, son probablemente consecuencia de una regulación indirecta de la hormona tiroidea sobre el promotor del gen Galphail, en la que podría estar implicada la proteína C/EBPbeta. En mesencéfalo, el hipotiroidismo aumenta los niveles de ARNm Galphail, pero no tiene ningún efecto a nivel proteico, resultados que sugieren una compleja acción de T3. En corazón el hipotiroidismo aumenta los niveles de ARNm y de proteína de Galphail. Estos efectos observados en corazón, los podemos explicar por una represión directa de la hormona tiroidea sobre el promotor del gen Galphail, habiendo dos secuencias responsables de este efecto, una localizda en la zona -145 a -134, y otra en las 25 primeras bases del exón.

Autor: GOMEZ VARELA DAVID.
Año: 2003.
Universidad: OVIEDO.
Centro de lectura: BIOLOGÍA .
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: El canal de potasio dependiente de voltaje h-erg (del inglés, human ether-a-go-go-related gene) pertenece a la familia de canales ether-a-go-go o eag (Warmke y Ganetzky, 1994; Turdeau et al., 1995; Coetzee et al., 1999). La función de este tipo de proteínas es regular el flujo de K hacia el interior y el exterior celular y de esta forma su funcionamiento es esencial en numerosos procesos fisiológicos. El cnal h.erg ha sido implicado en el control de la actividad eléctrica y de la secreción neurotransmisores y hormonas (Barros et al., 1994, 1997; Chiesa et al., 1997), así como en la repolarización del potencial de acción cardíaco (Smith,Bukrowitz y Yellen, 1996; Zhou et al., 1998). De hecho, mutaciones en el gen que codifica el canal h-erg dan lugar al denominado síndrome hereditario QT largo tipo II, que a nivel patológico puede desembocar en arritmias cardíacas, fibrilación y muerte súbita (Currante et al., 1995; Sanguinetti et al., 1995; Spector et al., 1996). Una característica fundamental del canal h-erg que determina su función en todos estos procesos, es su limitada capacidad de conducción iónica al despolarizar la membrana y la subsiguiente elevación de dicha conducción durante la repolarización, dando lugar a un comportamiento conocido como de rectificador anómalo, a pesar de que h-erg presenta una secuencia aminoacidica propia de un rectificador normal ( Warmke y Ganetzky, 1994). Este tipo de comportamiento se debe a las peculiares características cinéticas que presente h-erg. Así, h-erg presenta una apertura lenta y una inactivación muy rápida, lo que limita la corriente durante la despolarización. Sin embargo, una rápida recuperación y un cierre lento, dan lugar a niveles de corriente mayores durante la repolarización (Sanguinetti et al., 1995; Trudeau et al., 1995). A pesar de la importancia que estas peculiaridades cinéticas tienen en las distintas funciones que desempeña h-erg, poco se conocía respecto a los determinantes moleculares de las lentas velocidades de apertura y cierre. Nótese además que cualquier modificación de las características cinéticas de h-erg repercutirá en las funciones fisiológicas de este canal. Por ello, el conocimiento de los procesos por los cuales distintos neurotransmisores y hormonas regulan la actividad de h-erg de enorme interés. El objetivo general de esta Tesis se dividió en dos vertientes relacionadas en ambos casos con el canal h-erg: 1) el estudio de las relaciones entre la estructura del canal y sus peculiares características cinéticas, y 2) el estudio de la regulación de los canales tipo erg por receptores acoplados a proteínas G, como el de TRH. En lo que se refiere al primero de los objetivos, hemos demostrado que, además de los tres estados de cerrado propuestos por otros autores para explicar la lenta tasa de paso entre el estado cerrado (C) y abierto (O) (Wang et al., 1997), el esquema cinético de h-erg incluye también no sólo uno, sino tres estados de abierto que siguen el último de los citados tres estados de cerrado. Además, hemos comprobado que en el extremo amino terminal de h-erg existen dos dominios bien diferenciados funcionalmente que juegan un papel crucial en las características cinéticas de este canal. Por una parte, un dominio eag, cuya interacción con el cuerpo central del canal se produce cuando el canal ha llegado al último estado de abierto, determinando de esta forma la lenta cinética de cierre. Por otro lado, un dominio proximal exclusivo de h-erg situado tras el dominio eag, que ralentiza todas las transiciones del proceso de apertura y que además actúa como un freno molecular en la interacción del dominio eag con la maquinaria de apertura/cierre del canal. Respecto al segundo de los objetivos, hemos demostrado que: i) la activación del receptor de TRH provoca alteraciones en algunos de los parámetros cinéticos de h-erg, cuando las dos entidades de coexpresan funcionalmente en oocitos de Xenopus laevis. Así, se produce una aceleración de la velocidad de cierre, una ralentización de la velocidad de apertura y un desplazamiento en la dependencia de voltaje de apertura de aproximadamente 20 mV hacia voltajes más positivos. Sin embargo ni la cinética de inactivación ni la recuperación de la inactivación se ven alteradas por la TRH, ii) este proceso regulador se realiza a través de una vía de señalización en la que participa la protein quinasa C, ya que los efectos reguladores sobre los distintos parámetros cinéticos son mimetizados con el activador de esta quinasa PMA, y son abolidos con el inhibidor de dicha quinasa GF109203X, iii) la eliminación selectiva del dominio proximal de h-erg anula los efectos hormonales sobre el canal, iv) tras deleciones seriadas del dominio proximal, la presencia de la secuencia aminoacidica situada entre los residuos 326 y 332 es necesaria para que se produzcan los efectos reguladores tanto de la TRH como del PMA sobre la apertura del canal. Además, hemos comprobado que existen diferentes secuencias en el dominio proximal que contribuyen a la regulación de la apertura y del cierre de h-erg por TRH y PMA, v) la deleción del dominio proximal provoca la pérdida de los efectos reguladores de la TRH también en células de mamíferos HEK293, que expresan permanentemente tanto el receptor de TRH como la variante delecionada del canal, vi) la mutación puntual a Alanina de 5 de los 7 los residuos (R326, Y327, R328, T329 Y S331) de la secuencia diana citada en el apartado iv, no provoca ningún cambio en la regulación de h-erg por TRH. Sin embargo la mutación triple YTS/A reduce en un 50% los efectos reguladores del PMA sobre el canal, vii) a pesar de que los antecedentes demuestran la participación de un mecanismo de fosforilación en el efecto inhibidor de r-erg por TRH en células GH3, en dicha inhibición no participan Tirosin quinasas, Ca/Calmodulina quinasas MAP quinasa, quinasa dependiente de Rho, ni protein quinasas A, B ó C, y viii) en el proceso de revisión de la inhibición de r-erg por TRH en las células GH, está implicada la Fosfolipasa C y una isoforma clásica de la protein quinasa C, además de la protein fosfatasa 2A previamente identificada en nuestro laboratorio (Barros et al., 1993).

Autor: CARBAJO DE LA FUENTE M. JOSE.
Año: 2003.
Universidad: OVIEDO.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: Una de las pruebas más comunes y útiles en la clínica es el hemograma, que en la actualidad se realiza de forma automatizada. El aumento progresivo de la demanda, ha hecho que nos pareciera de interés averiguar si la utilización de la prueba es la adecuada. Para ello hemos a analizado los datos de 3077 individuos no hospitalizados procedentes del área sanitaria de Gijón, en Asturias, evaluando el número de anomalías parecidas y el rendimiento de la prueba. El porcentaje de anomalías encontradas es similar en los hemogramas solicitados, tanto desde las consultas de Medicina General como desde las de Medicina Especializada. La anomalía más frecuente es la anemia, encontrándose en proporción superior a la que aparecen en poblaciones similares.

Autor: ROCHA ROSO ANA ISABEL.
Año: 2003.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: INSTITUTO NACIONAL DE INVESTIGACIONES AGRARIAS.

Resumen: El modelo elegido en este trabajo para estudiar la fusión de los rabdovirus ha sido el VSHV, porque origina una de las enfermedades causante de mayores mortalidades en la producción piscícola mundial y su biología molecular es una de las mejor conocidas. Este estudio se centra en la fusión de membranas virus-hospedador que origina la entrada del genoma viral en la célula. Tal y como se ha demostrado para otros virus, el estudio de la fusión puede ayudar tanto al diseño de agentes terapéuticos para frenar la infección como a la generación de vacunas ADN o atenuadas. Se ha demostrado en VSHV la existencia de un dominio de ligamiento de fosfolípidos aniónicos entre los aa 82-109 (p2) (Estepa y Coll, 1996a; Estepa y Coll, 1996b). Por otra parte, aunque aún no existe un consenso generalizado, la posición del pèptido de fusión de la pG de VSHV se ha propuesto entre los aa 142-159, por comparación con VSV (Walker y Kongsuwan, 1999). La existencia en VS HV de un puente disulfuro entre la C110(contenida en el p2) (Estepa y Coll, 1996a) y la C152 (contenida en el péptido de fusión) (Einer-Jensen et al., 1998) y de mutantes con alteraciones en el pH de fusión localizados alrededor de la C110 (Gaudin, DeKinkelin y Benmansour, 1999), sugirió que la región implicada en fusión podría localizarse simultáneamente en el p2 y en el péptido de fusión de VSHV (Gaudin, DeKinkelin, y Benmansour, 1999). Por todo ello, se decidió enfocar el estudio a la región situada entre los aa 56-159 que comprende ambos dominios. El trabajo se ha desarrollado en 2 líneas paralelas. Por un lado, se han estudiado las secuencias de la región seleccionada comparativamente entre distintos géneros de rabdovirus y aislados de VSHV y funcionalmente utilizando péptidos sintéticos derivados de segmentos de la región. Todo ello ha facilitado el diseño de los mutantes estudiados en este trabajo. Por otro lado, se ha optimizado un ensayo de fusión utilizando células de pez transfectadas con el gen de la pG para poder estudiar la capacidad de fusión de los mutantes diseñados. Las dos líneas de investigación concluyeron en los ensayos de fusión en células de pez de los mutantes diseñados en la región seleccionada.

Autor: ADROVER BLANCH MARC.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y DE FORMACIÓN CONTINUADA.

Resumen: Con la finalidad de identificar genes involucrados en la metástasis , hemos utilizado un modelo de cáncer de mama murino. Se han aislado una serie de clones con diferentes características celulares, capacidad metastásica y dependencia hormonal, pero genéticamente relacionados al tener origen común en la línea celular parental M xt S. Para demostrar el fondo genómico común y la clonalidad de las variantes del modelo MXT hemos utilizado el estudio por citometría, citogenética y DNA fingerprinting. Para investigar los genes diferencialmente expresados por los clones derivados de MXT, hemos utilizado la técnica del RNA arbitraly primed (RAP-PCR). Se obtuvieron RNA fingerprints de cada uno de los clones, los cuales se compararon y se encontraron diferencias en bandas específicas. Tras la selección y clonaje de estas bandas, se aislaron cDNA que se utilizaron como sondas para verificar las diferencias entre los niveles de expresión entre los distintos clones mediante Northern blot. El análisis de la secuencia de una de las seleccionada se identificó coom SPARC (Secreted Protein Acidic and Rich in Cystein), una glicopoteína que ha sido relacionada con las interacciones entre células y matriz extracelular durante la remodelación, morfogénesis, migración y proliferación. Este gen se encontró sobrexpresado en las líneas celulares más metastásicas Mxt C1.1 y Mxt B2 en relación a la línea parenteal M xt S, la cual muestra elevada capacidad tumorogénica, pero baja capacidad metastásica. Con el objetivo de modificar la expresión génica de los genes Sparc y de la metaloproteinasa 2 (Mmp2) de las células del modelo MXT, y concretamente las líneas Mxt B2 y Mxt E2, hemos utilizado vectores de expresión. Se ha modificado la expresión de lso genes Sparc y Mmp2 de células de la línea Mxt B2. Los clones obtenidos presentaban la expresión del gen Sparc reducida, la expresión alta de Mmp2 y otros clones expresaban niveles bajos de Sparc y altos de mmp2. A partir de estos clones hemos estudiado su comportamiento en cultivo respecto a la proliferación celular, adhesión a diferentes sustratos e invasión a través del colágeno tipo IV. Los clones obtenido se han utilizado en experimentos de tumorogénesis, capacidad metastásica espontánea y experimental, tanto en ratones B6D2F1, como en ratones knockout para el gen Sparc.