BIOQUIMICA MOLECULAR, 40

Autor: ARMADA PELAEZ BEATRIZ.
Año: 1998.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FARMACIA.

Resumen: En el campo de la hematología, gracias a la biología molecular se han identificado los defectos moleculares de enfermedades hereditarias y se han logrado importantes progresos en el conocimiento de las bases moleculares de los procesos oncohematológicos. Las talasemias son un grupo heterogéneo de anemias hereditarias caracterizadas por un defecto cuantitativo en la síntesis de las cadenas de globina. Las alfa talasemias, son debidas generalmente a delecciones de material genético. Actualmente, la aparición de la PCR, ha simplificado la detección de las formas más comunes de alfa talasemia. La leucemia aguda linfoblástica procede de la transformación y proliferación clonal de una célula progenitora linfoide que da origen a la producción de células neoplásicas escasamente diferenciadas. El estudio de los genes de las Ig y del RCT, permite detectar la existencia de expansiones clonales de células linfoides y pueden ser aplicados al diagnóstico y detección de enfermedad residual en la leucemia aguda linfoblástica. Pero por otra parte, existen otras alteraciones moleculares presentes en los pacientes con hemopatías malignas, y entre ellas las mejor caracterizadas son las traslocaciones cromosómicas algunas de las cuales son específicas de un determinado tipo de leucemia o linfoma como la t(14;18)(32;q21) que está presente con una elevada incidencia en los NH foliculares (85%). Así, el estudio de dicha traslocación por técnicas de Biología Molecular puede ser aplicado en el estudio al diagnostico y monitorización de los pacientes con I NH folicular.

Autor: LOPEZ COLLAZO EDUARDO MANUEL.
Año: 1998.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FARMACIA.

Resumen: El NFKappaB es un factor de transcripción implicado en la expresión de proteínas tales como la xido Nítrico Sintasa (NOSi). Su papel en la viabilidad celular ha sido estudiado intensamente. Tanto en células RAW como en macrófagos peritoneales murinos la incubación con microdosis de LPS previene la activación de NFKappaB durante una segunda estimulación con agentes inflamatorios comoel IFN-gamma y dosis altas de LPS, esto se traduce en una protección frente a la apoptosis que estos estímulos inducen en las células que no fueron pretratadas con la microdosis de LPS. El mecanismo por el cual esta protección ocurre involucra la elevaciónde las proteínas citosólicas IKappa -beta y -alfa (inhibidoras de la activaciónde NFKappaB). En experimentos "in vivo", la microdosis de LPS es capaz de proteger frente a la muerte que induce el tratamiento iv con LPS e IFN-gamma. Por otra parte, también se observa una protección frente a la apoptosis inducida por LPS e IFN-gamma cuando se coincuba con IFN-alfa/beta (tipo I). En este caso también se observa una dismunición de los niveles de NFKappaB en el núcleo de las células tratadas con LPS e IFN-gamma debida a la inhibición de la proteolisis de los IKappaB -alfa y -beta. Se concluye que la regulación negativa de la actividad NFKappaB en macrófagos y células de origen macrofágico juega un papel importante en la protección de estas células frente a la apoptosis dependiente de NO.

Autor: PUENTE NUÑEZ ANA M. DE LA.
Año: 1998.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FARMACIA.

Resumen: En esta Tesis se ha estudiado, por una parte, el efecto de la diabetes experimental inducida por estreptozotocina sobre el sistema IGF/IGFBPs en riñón de rata diabética durante la etapa neonatal. La mayor contribución de estos resultados ha sido la observación de que la hipertrofia renal inducida por la diabetes en etapa neonatal podría resultar de un incremento en los niveles renales de IGF-II, a diferencia de lo encontrado en ratas diabéticas adultas, donde el causante de dicha hipertrofia es el acúmulo de IGF-I. Por otra parte, se ha establecido un modelo experimental de cultivos primarios de hepatocitos de fetos de rata de 21 días de gestación con el fin de estudiar los mecanismos moleculares que regulan los IGFs en la etapa perinatal del desarrollo. La principal aportación de los resultados obtenidos con este modelo ha sido la confirmación del papel regulador de glucosa e insulina sobre los IGFs enestas etapas inmaduras, papel que ya había sido sugerido para estos factores en modelos experimentales con animales vivos.

Autor: VILLA GARCIA NATIVIDAD .
Año: 1998.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGIA.

Resumen: La sepsis continúa siendo el factor más importante que predispone al SDRA. Cuando el SDRA va asociado a sepsis, la mortalidad puede ser de un 80%. La inhibición de la síntesis de surfactante por citoquinas parece participar en la patogénesis del SDRA, sin embargo, los mecanismos por los que las citoquinas ejercen sus efectos no son del todo conocidos. Es aceptado que el aumento de los niveles de GMPc secundarios a la formación de NO participan en la mediación de los efectos de las citoquinas sobre neumocitos tipo II, sin embargo la inhibición de la NO sintasa sólo revierte en parte los efectos de las citoquinas. Dado que la GC también puede ser activada por CO, hemos encontrado como las citoquinas inducen la formación de CO por neumocitos tipo II humanos; este gas parece participar en la inhibición de la síntesis de surfactante inducida por citoquinas contribuyendo de esta forma al SDRA. Además, las 2 vías de producción de CO participan en la respuesta a las citoquinas, y la inhibición de estas vías con antagonistas específicos bloquean los efectos de las citoquinas.

Autor: MARTINEZ BAZAGA ADRIAN JESUS.
Año: 1998.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGIA .

Resumen: La memoria que presenta D. Adrián Martínez Bazaga tiene como objetivo principal la evaluación del efecto protector de extractos acuosos y etanólicos de frutas y vegetales frente a la citotoxicidad de N-nitrosaminas. Para ello, se han utilizado diversos métodos de citotoxicidad basados en la medida de la actividad metabólica celular (MTT) y de la síntesis de DNA (ensayo de incorporación de BrdU y método de determinación del contenido total de DNA). La evaluación se complementó con el estudio de las alteraciones de la estructura celular, mediante microscopía electrónica de transmisión (MET). Finalmente los extractos que presentaron un efecto protector y de estimulación de la proliferación celular frente a alguna o todas las N-nitrosaminas (brécol, cebolla, zanahoria y regaliz), fueron también evaluados para determinar su efecto antimutagénico, utilizando el método de detección de polimorfismos genómicos por amplificación del DNA al azar (RAPD).

Autor: SANTIBAÑEZ DOMINGUEZ JUAN FRANCISCO .
Año: 1998.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.

Resumen: El sistema del activador del plasminógeno tipo uroquinasa (u-PA) es un componente clave en la invasión y migración tumoral, pues proporciona a las células tumorales de una eficiente maquinaria proteolítica en la superficie celular. El factor de crecimiento transformante beta1 (TGF-beta1) ha sido postulado como un estimulador autocrino de la progresión tumoral y la metástasis en células transformadas. Trabajos recientes de nuestro laboratorio han mostrado que el factor induce una transdiferenciación epitelial-mesenquimática en queratinocitos transformados de piel de ratón (línea celular PDV), asociada a una transición de carcinomas escamosos bien diferenciados a carcinomas fusocelulares. El trabajo de esta Tesis se ha centrado en el estudio del efecto de TGF-beta1 sobre el sistema u-PA, y el papel de u-PA en el aumento de la malignidad tumoral inducida por el factor. La expresión/secreción de u-PA, así como el número de sitios de unión de u-PA en la superficie celular, correlacionan con la invasividad y tumorogenicidad de líneas celulares transformadas de epidermis de ratón. El tratamiento de células PDV con TGF-beta1 induce un aumento de la expresión/secreción de u-PA y de la fracción de u-PA unido a la membrana plasmática de las células. TGF-beta1 induce, asimismo, un aumento de la expresión/secreción del inhibidor de u-PA PAI-1, mientras que reduce los niveles de PAI-2. Uroquinasa es un mediador del fenotipo migratorio e invasivo inducido por TGF-beta1, ya que antagonistas de la unión de u-PA a la superficie celular inhiben la migración e invasividad estimulada por el factor. Queratinocitos inmortalizados no tumorogénicos (MCA3D) no responden a TGF-beta1 para estos cambios fenotípicos. Mediante el uso de agentes que modulan la actividad quinasa, se demuestra en este estudio el requerimiento de tirosina quinasas para la estimulación del fenotipo invasivo y de la producción de u-PA por TGF-beta1 en células PDV. La transfección en células PDV de un plásmido que codifica una proteína mutante dominante negativo de Ras, la utilización de un inhibidor específico de MEK1,2 (PD098059) y de oligonucleótidos antisentido dirigidos contra ERK1,2 sugieren la implicación de una vía de señalización Ras-MEK-ERK en la regulación de la respuesta de PDV a TGF-beta1.

Autor: ORTEGO ESCAMILLA MONICA.
Año: 1998.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.

Resumen: Las enfermedades cardiovasculares son la principal causa de muerte en el mundo occidental. La gran mayoría de estas muertes se deben a la rotura de la placa aterosclerótica y su posterior trombosis dando lugar a las diferentes patologías. En la formación de la placa ateroxclerosa están implicadas quimioquinas que atraen hacia el espacio subendotelial los monocitos y a las células de músculo liso. El acúmulo de estas células en el interior de la placa constituye el peso inicial para la formación del núcleo lipídico. Una placa con gran núcleo lipídico es más propensa a la rotura que una placa con un núcleo lipídico pequeño y con una cápsula fibrosa gruesa. Entre los factores quimiotácticos implicados en el reclutamiento celular hemos estudiado MCP-1, que produce la atracción del monocito a las zonas de la lesión. También hemos estudiado uno de los factores nucleares que controlan la expresión de MCP-1 como NF-B. En los últimos años los inhibidores del enzima que regula la biosíntesis de colesterol llamadas estatinas, han demostrado ser eficaces en la reducción de la morbi-mortalidad coronaria. Sin embargo esta reducción no se correlaciona con una regresión de la placa aterosclerosa. En este trabajo intentamos explorar los mecanismos de acción de estos fármacos. En un modelo de aterosclerosis en conejos hemos detectado la expresión aumentada de MCP-1 y de NF-B en el tejido. Esta expresión es disminuida por el tratamiento de los animales con una estatina, atorvastatina. También hemos profundizado en los mecanismos de acción de estos fármacos sobre las células de músculo liso vasculares, y hemos encontrado modulación de las quimioquinas MCP-1 E IP-10, así como disminución de la actividad de unión del factor nuclear NF-B inducidos por factores aumentados en la placa aterosclerosa.

Autor: MAÑES BROTON SANTOS.
Año: 1998.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.

Resumen: La proliferación celular es un proceso coordinado que implica la comunicación celular a través de moléculas reguladoras conocidas como factores de crecimiento. Esta coordinación se consigue a través de loops autocrinos de factores mitogénicos no específicos de tejido como los IGFs. Las células neoplásicas se caracterizan por una relativa autonomía de crecimiento que podría ser la consecuencia de la expresión constitutiva de IGFs. Utilizando el adenocarcinoma humano DU145 como modelo, se ha demostrado la existencia de un loop autocrino de IGFs que regula la proliferación de estas células. Este loop esta regulado por la secreción autocrina de la proteína de unión de IGFs, IGFBP3, y la metaloproteasa de matriz MMP9. Los resultados indican que la proliferación autocrina de DU145 es el resultado de la proteolisis regulada de IGFBP3 por MMP9 a nivel de la membrana plasmática en estas células. Los IGFs también están implicados en invasividad tumoral. Usando células MCF7, un carcinoma de mama humano, se ha demostrado que IGFI coordina el aumento de actividad degradativa de matriz extracelular con la maquinaria responsable de motilidad celular. En este sentido la función de IGFI es doble: (i) aumenta la adhesión celular mediada por integrinas, y (ii) induce la defosforilación de FAK regulando el desensamblaje de las adhesiones focales. Esta última función la realiza activando la tirosina fosfatasa SHP2, como se demuestra por la utilización de un mutante dominante negativo para esta enzima. La expresión del mutante de SHP2 en DU145 también disminuye la invasividad inducida por IGFI en esta células. Ya que existe un loop autocrino operativo implicado en la proliferación de DU145, estos resultados sugieren que SHP2 puede ser un punto de integración de señales que controlan el crecimiento y la migración celular. Tomados los datos en conjunto, se propone un modelo en el que la activación del IGF1 receptor por los IGFs producidos de forma autocrina dispara (i) una respuesta de supervivencia a través de la activación de la dosfatidil inositol 3 kinasa; (ii) una respuesta mitogénica mediante la activación de MAPK; y (iii) una respuesta en motilidad celular que implica la activación y desactivación de integrinas junto con la focalización de la actividad metaloproteasa que, además de degradar matriz extracelular, puede regular la disponibilidad de IGFs.

Autor: JAMBRINA NAFRIA ENRIQUE.
Año: 1998.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.

Resumen: Los virus de la gripe (VG) pertenecen a la familia "Orthomyxoviridae". Los miembros de esta familia se caracterizan por ser virus con envuelta y cuyo genoma está constituido por segmentos de RNA de banda simple y polaridad negativa. Los VG se clasifican en tres tipos: A, B, y C. Los VG tipo A y B son clínicamente relevantes en humanos, a pesar de lo cual la mayor parte de los estudios sobre la expresión del genoma de los VG se han centrado solamente en los VG tipo A. Con el fin de avanzar en el conocimiento de los procesos de expresión del genoma de los VG tipo B se han clonado y secuenciado los genes que codifican las proteínas PB1, PB2, PA y NP a partir del RNA Viral del VG B/Panamá/45/90. Estas proteínas constituyen las polimerasa viral en el caso de los VG tipo A. A partir de estos genes y empleando un sistema basado en un virus vacunal recombinante que expresa la RNA polimerasa del fago T7, se han expresado de forma transitoria en células de mamífera las proteínas PB1, PB2, PA y NP. Estas proteínas expresados en este sistema son funcionales, ya que pueden llevar a cabo la expresión de una RNA CAT modelo que contiene las secuencias promotoras para la RNA polimerasa viral. Utilizando este sistema se ha demostrado que las proteínas PB1, PB2, PA y NP constituyen el conjunto mínimo de proteínas virales necesarias para la expresión de un RNA modelo tipo B. Utilizando los plásmidos recombinantes que codifican los componentes de las polimerasas de los VG A/Victoria/3/75 y B/45/90, se ha podido demostrar que ambas polimerasas reconstituidas "in vivo", son capaces de expresar aunque con reducida eficiencia, RNAs modelos del otro tipo viral. Por otro lado, y utilizando estos plásmidos, no ha sido posible reconstituir RNPs funcionales formadas por proteínas de ambos tipos de VG. Las secuencias de aminoácidos correspondientes a los genes clonados a partir del VG B/Panamá/45/90 están altamente conservadas (con una identidad mayor del 95%) cuando se comparan con los genes homólogos de otros VG tipo B aislados desde 1940. El análisis filogenético de las secuencias de nucleótidos disponibles para el gen de NP relaciona a la cepa viral utilizada en esta tesis B/Panamá/45/90 con la cepa B/Yamagata/1/88 y muestra que se ha producido la recombinación del gen de NP o de HA entre aislados virales recientes. Por último, se han obtenido antisueros frente a las proteínas PB1 y PB2, que reconocen los polipéptidos mencionados en ensayos de inmunoelectrotransferencia e inmunofluorescencia.

Autor: FERNANDEZ VILLARREAL ELENA M..
Año: 1998.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.

Resumen: La integrina VLA-4(alfa4beta1 elevada 2) está involucrada en procesos fisiológicos de importancia y en patologías tan relevantes como en los procesos inflamatorios crónicos, asma, aterosclerosis, esclerosis múltiple y artritis reumatoide, así como en la propagación de determinados tumores. Un interés añadido para el estudio de VLA-4 es que es la única integrina conocida capaz de mediar los dos tipos de interacciones, célula-célula, a través de VCAM-1, y célula-matriz extracelular a través de fibronectina. Durante estos cuatro años de duración de este proyecto, hemos intentado conocer y comprender las señales que la integrina VLA-4 es capaz de producir en el interior de la célula en respuesta a la interacción con sus ligandos fibronectina y VCAM-1. En este sentido, uno de los primeros experimentos que llevarnos a cabo fue tratar de estudiar la fosforilación de proteínas intracelulares en respuesta a la adhesión mediada por VLA-4. Observamos así el incremento en la fosforilación de una proteína de 100 kDa capaz de co-precitipar con FAk. ésta podría ser su sustrato. El conjunto de todos nuestros experimentos nos demostró que FAK era capaz de activarse en la adhesión mediada por VLA-4, y que su máxima activación ocurre a tiempos largos (60-90 minutos), tanto para Fn 40 como para VCAM-1. La activación de FAK podría ser debida a la asociación constitutiva entre FAK y VLA-4 que hemos observado. Al mismo tiempo la interacción de FAK y P13-K en respuesta a la adhesión celular a través de la integrina VLA-4 tanto por experimentos de microscopía de fluorescencia como por inmunoprecipitación va asociada a un incremento específico en la actividad de P13-K tras la adhesión celular a Fn 40 y VCAM-1, coincidiendo con los tiempos de máxima actividad de la quinasa FAK, los tiempos de máxima adhesión celular y aquellos tiempos en los que se produce el spreading celular. Asimismo, hemos estudiado las posibles alteraciones en los niveles de los fosfatidilinositoles polifosfato en células marcadas con 32Pi. En estos experimentos encontramos una acumulación de Ptdlns3 P y de Ptdlns 3,4P sub 2 en respuesta a la adhesión mediada por VLA-4 y a la estimulación con anticuerpos frente a ella, además observamos un incremento en la generación de las formas Ptdlns 3,5P sub 2 y Ptdlns 3,4,5P sub 3 tras la adhesión a VCAM-1 pero no tras la adhesión a Fn 40. Esta divergencia en la respuesta de la producción de los distintos fosfoinositoles en respuesta a uno u otro ligando la consideramos muy interesante y objeto de estudio para futuras investigaciones. También estuvimos interesados en la posible implicación de la quinasa MAPK en la transducción de señales mediada por la integrina VLA-4. Así, realizamos experimentos de inmunoprecipitación con anticuerpos anti-MAPK y llevamos a cabo un ensayo de actividad MAPK quinasa utilizando como sustrato la proteína básica de mielina (MBP) en presencia de 32P-ATP. Este experimento nos mostró un aumento en la fosforilación del sustrato fosforilado en respuesta a la señalización mediada por VLA-4 y, además, un incremento en la fosforilación de las bandas de pesro 42 kDa, 44 kDa y 75-80 kDa. La cinética de activación de la quinasa MAPK nos mostró que su máxima actividad se produce a tiempos tempranos a diferencia de los tiempos de activación de las quinasas P13-K y FAK. Mientras la adhesión a VCAM-1 parece producir un aumento transitorio en la activación de MAPK, la adhesión a Fn 40 parece producir un aumento en la activación de MAPK a tiempos más largos y de forma mantenida. También hemos llevado a cabo experimentos para tratar de clarificar la posible implicación de la quinasa DGK en la cascada de señalización mediada por VLA-4. Datos preliminares parecen mostrar un aumento en la producción de ácido fosfatídico tanto en experimentos realizados por HPLC como por TLC, así como una asociación en entre la DGK y FAK inducida tras la adehsión vía VLA-4.

Autor: CORELLA FRANCES ALBERTO.
Año: 1998.
Universidad: PUBLICA DE NAVARRA.
Centro de lectura: CIENCIAS .

Resumen: En este trabajo se ha determinado la estructura del gen que codifica el receptor de retinoides humano hRXRbeta. Este gen posee 10 exones y nueve intrones. No se han detectado secuencias especificas para el exon 1 de la isoforma betados del gen humano. Tambien se ha determinado la estructura del gen HKE4, que se encuentra fisicamente ligado con el gen HRXRB y que consta de 7 exones y 6 intrones. El punto de inicio de la transcripción se ha determinado para ambos genes mediante experimentos de "primer extensión" revelando varios puntos posibles de inicio de la transcripción en los dos genes. Se discuten las posibles secuencias reguladoras de la expresión de ambos genes.

Autor: PEREZ GALLEGO LUCIA.
Año: 1998.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: MEDICINA.

Resumen: La mayoría del medio millón de nuevos casos de carcinoma cervical que ocurren al año en todo el mundo y sus lesiones precursoras están asociados a la infección por el virus del papiloma humano (HPV). La mayor parte de las de bajo grado regresan, pero un porcentaje de casos persiste o progresa a SIL de altogrado, más frecuentemente en éstar últimas. Entre los factores que pueden influir en la progresión de lesiones precursoras a carcinoma, el tipo de HPV y la inmunidad de las pacientes son los más relevantes, así como algunas variantes intratípicas de HPV recientemente descritas. Con respecto al HPV 16 se han definido variantes más frecuentemente asociadas a progresión. La variantes E-350 G, y la variantes europea E-131G. Estas modificaciones proteicas confieren mayor capacidad transformante a E6 o modifican la respuesta inmunológica del huésped. Para conocerel papel del tipo de HPV y la influencia del estado inmunológico en el desarrollo de las lesiones intraepiteliales escamosas del cérvix, se ha realizado un estudio en 386 pacientes, en las cuales se ha estudiado el tipo de virus y variantes del HPV16 en SIL de bajo y alto grado, tanto en pacientes inmunocompetentes como en pacientes con síndrome de inmunodeficiencia adquirida. La detección del HPV se ha realizado mediante la técnica de PCR utilizando los iniciadores consenso MY09/MY11 que amplifican una porción altamente conservada de la ORF L1. La tipificación se ha realizado por análisis de restricción del producto amplificado, que muestra un patrón característico para numerosos tipos de HPV tras la digestión con la enzima Rsa I. La identificación de las variantes del HPV 16 se ha obtenido con el análisis completo de la región E6, mediante secuenciación directa de la región amplificada por PCR. En pacientes inmunocompetentes la distribución de tipos de HPV anogenitales se correlaciona con el tipo de lesión intraepitelial escamosa: los condilomas acuminados se asocian siempre a infección por los HPV6 y 11; las lesiones de bajo grado se asocian a cualquier tipo de HPV, y en nuestra serie, a diferencia de otras, predomina el HPV16. La distribución de tipos de HPV en las lesiones de alto grado difiere de la observada en lesiones de bajogrado, pero es similar a la de los carcinomas infiltrantes. En pacientes con síndrome de inmunodeficiencia adquirida se ha observado más heterogeneidad de los distintos tipos virales, con una mayor incidencia de tipos poco comunes. También se han detectado más infecciones mixtas, destacando la baja incidencia de HPV16 en lesiones debajo grado. Sin embargo, en lesiones de alto grado, predominan los tipos más oncogénicos de HPV, sobre todo el HPV 16, tanto en infecciones aisladas como mixtas. Con respecto a las lesiones intraepiteliales de cérvix en las que se detectó HPV 16, el 38% están producidas por variantes, de las cuales todas excepto una pertenecen a la rama o subtipo Europeo. La variante más frecuentemente observada ha sido la E350G (84%) y el resto de las variantes poseen mutaciones en más de un nucleótido. Hay que destacar que en el análisis de la secuencia de la región E6, se ha detectado una infección mixta por el HPV16 prototipo y por la variante E350G en el 5% de las pacientes inmunocompetentes. En este grupo, la frecuencia de variantes de HPV 16 es mayor en las lesiones de alto grado y carcinomas infiltrantes, lo que sugiere un mayor poder patógeno de las variantes. Por el contrario, en pacientes con síndrome de inmunodefiencia adquirida predomina el HPV 16 prototipo tanto en las lesiones de bajo como en las de alto grado. Estos resultados sugieren que la inmunidad es importante en el control de la infección productiva de los distintos tipos de HPV, pero el tipo de virus es el responsable de la transformación neoplásica.

Autor: BORT MARTI BERNARDO ROQUE.
Año: 1998.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: FARMACIA.

Resumen: La presente Tesis ha estado dirigida a investigar aspectos básicos del metabolismo y hepatotoxicidad de loa AINEs haciendo uso de los modelos celulares hepáticos y, en concreto, a determinar las rutas metabólicas del diclofenac y sus análogos en el hombre y a esclarecer el mecanismo molecular de su toxicidad. La Tesis incluye el desarrollo de herramientas fundamentales en el estudio in vitro de la toxicidad y metabolismo de fármacos. La Tesis se compone de 5 capítulos interrelacionados de los que se extraen las siguientes conclusiones, que constituyen el resumen de la Tesis Doctoral. 1.- Los metabolitos identificados en cultivos de hepatocitos de rata fueron 4'-hidroxi-, 5-hidroxi y N,5-dihidroxidiclofenac, un metabolito secundario del diclofenac descrito por primera vez en esta Tesis. En hepatocitos humanos se identificaron además 3'-hidroxi y 4', 5-dihidroxidiclofenac. 2.- El CYP2C9 es responsable de la formación de 4'-hidroxi, 3'-hidroxi y 4', 5-hidroxidiclofenac. En la formación de 5-hidroxidiclofenac están implicados, de mayor a menor relevancia los CYP2C8, CYP2C19, CYP2C18 y CYP2B6. 3.- Hemos podido establecer que la célula el N, 5-dihidroxidiclofenac se genera a partir de 5-hidroxidiclofenac. A su vez, en N,5-dihidroxidiclofenac puede redurirse a su precursor en presencia de NADPH y mocrotosomas hepáticos. 4.- En hepatocitos humanos el aceclofenac es metabolizado casi exclusivamente a 4'-hidroxiaceclofenac; en hepatocitos de rata es hidrolizado por una esterasa hepática a diclofenac, el cual es posteriormente metabolizado a 4'-hidroxi y 5-hidrodiclofenac. 5.- El diclofenac y sus metabolitos son capaces de inhibir la síntesis mitocondrial de ATP, y ello, junto con la depleción de NADPH debida al ciclo fútil 5-OHDic/N,5-diOHDic, posiblemente constituyen la base de la hepatotoxicidad del diclofenac. 6.- Mediante el empleo de modelos in vitro hemos conseguido reproducir el fenómeno de la idiosincracia metabólica, aplicado al caso del metabolismo del diclofenac y la producción de 5-hidroxidiclofenac por el CYP2C19.

Autor: VARGIU PIERFRANCESCO.
Año: 1998.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.

Resumen: La hormona tiroidea (T3) actúa como un factor epigenético controlando el correcto desarrollo del Sistema Nervioso Central (SNC) de los mamíferos. Hasta la fecha se han descrito varios genes de expresión cerebral que están bajo el control de la hormona tiroídea, durante el desarrollo. Entre ellos se encuentra SE6C, un gen que due aislado con el objetivo de identificar genes que se expresan únicamente en el núcleo estriado. Su distribución está restringida al encéfalo y principalmente al núcleo estriado, capa mitral del bulbo olfatorio, corteza cerebral y cerebelar, a nivel de la capa granular interna y colículo inferior. Además, se expresa, aunque en menor medida, en el tiroides. El hipotiroidismo neonatal disminuye los niveles de ARNm de SE6C en todas las regiones cerebrales anteriormente mencionadas. El tratamiento de sustitución con T4 a animales hipotiroideos revierte los niveles de expresión de SE6C. Asimismo, el tratamiento agudo con T4 o T3 revierte los valores del mensajero de SE6C a nivel de los controles en tiempos muy rápidos. Estos resultados sugieren que el control de la expresión de SE6C por hormona tiroidea pueda ejercerse a nivel transcripcional. Los datos sobre la expresión de SE6C a lo largo del desarrollo en animales controles e hipotiroideos demuestran que el hipotiroidismo impide el aumento de expresión de SE6C que se produce postnatalmente en animales controles. SE6C al igual que otros genes diana de la T3 presenta una reducción de la expresión de su mensajero a lo largo de las tres primeras semanas de vida, normalizándose espontáneamente después del primer mes de vida. El análisis de la secuencia del ADNc y de la proteína que de ella se deduce muestran una alta homología con una gran variedad de proteínas que unen GTP pertenecientes a la superfamilia Ras. El dendrograma resultante del alineamiento entre las secuencias de los miembros de esta superfamilia, sitúa a SE6C junto con su homólogo en humanos y Dexras1, en una rama bien definida y diferenciada dentro de la subfamilia Ras. Hemos encontrado que la línea celular PC12 expresa el mensajero de SE6C. En el proceso de diferenciación de las PC12 inducida por NGF, no se observan cambios en la expresión del ARNm de SE6C, aunque no podemos descartar la posible implicación de la proteína SE6C en la cascada de señalización inducida por NGF a nivel postraduccional. Por último, SE6C se expresa en la línea celular FRTL-5 de tiroides de rata, siendo su expresión dependiente tanto de TSH como de insulina.

Autor: VARELA SANZ M. ELISA.
Año: 1998.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.

Resumen: La degradación de la lignina es un proceso oxidativo, llevado a cabo por los hongos de podredumbre blanca, en el que el peróxido de hidrógeno juega un papel primordial al ser necesario para la actividad de las enzimas ligninolíticas de tipo peroxidasa y precursor del agente oxidante más potente producido por estos organismos, el radical hidroxilo. La lignina peroxidasa (LiP) ha sido una de las peroxidasas más estudiadas en relación con este proceso, aunque esta enzima no se ha controlado en todos los hongos ligninolíticos. La aril-alcohol oxidasa (AAO) es una enzima implicada en la producción extracelular de H2O2 y puede utilizar sustratos comunes a la LiP, por lo que pueden existir algunas interferencias para detectar estas enzimas en los cultivos. En este trabajo utilizamos dos sondas de DNA, una obtenida por PCR a partir de la secuencia N-terminal y una secuencia interna de la AAO de Pleurotus eryngii y otra correspondiente al gen, previamente descrito, que codifica la LiP H8 de Phanerochaete chrysosporium, para detectar la presencia de estos genes en 30 hongos. Paralelamente, clonamos y caracterizamos por primera vez el gen que codifica la enzima AAO. El gen aao de P. eryngii codifica una proteína de 593 aminoácidos, incluyendo un péptido señal de 27 aminoácidos y dos regiones conservadas en otras oxido-reductasas, localizadas en las regiones N-terminal (sitio de unión a FAD) y C-terminal (que formaría parte del centro activo) de la proteína madura.

Autor: TAPIA CORRALES ESTHER.
Año: 1998.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.

Resumen: Esta tesis se basa en el estudio de la capacidad fusogénica e infectiva de distintos mutantes de deleción o inducibles del virus VV, de los genes A56R, K2L, A27L o H3L. Estos genes codifican para proteínas implicadas en el fenómeno de fusión celular. El estudio de la capacidad fusogénica de estos virus defectivos en distintas circunstancias y tipos celulares indicaría que en el proceso de fusión celular, son necesarios, aparte de factores virales, factores propiamente celulares. Asociada al exterior de la superficie celular están presentes, junto con VEE y VEE con la envuelta rota, VIM "activados" responsable del fenómeno de fusión celular en condiciones normales de infección (pH neutro). Para que el fenómeno de fusión ocurra es necesario por tanto, un tipo celular adecuado, la ausencia de proteínas inhibidoras de fusión (HA y Serpin, hasta ahora), y una correcta salida viral que permitía la exposición del VIM "activo", en el cual se encuentra la proteína de fusión ya activa a pH neutro. Se puede decir por tanto que el VEE no participa directamente en el proceso de fusión celular, y muy probablemente tampoco en el de fusión virus-célula. De nuestros resultados se concluye que la proteína de 14 kDa, codificada por el gen A27L, no es la proteína que el VV emplea en la fusión celular, y que la proteína de 14 kDa, no es la única que une de forma específica a receptores celulares del tipo heraránsulfato. Por otra parte la proteína de 35 kDa, codificada por el gen H3L, es una proteína no esencial para la replicación viral in vitro, de expresión tardía y presente en la membrana externa del VIM. Sin embargo el tránscrito de expresión temprana, que se inicia en el interior del gen H3L, parece ser necesario para la replicación.

Autor: CASES DIAZ ILDEFONSO.
Año: 1998.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.

Resumen: En este tesis se han analizado los mecánismos moleculares de la inhibición del promotor Pu del plásmido TOL pWW0 de Pseudomonas putida en respuesta al crecimiento en medio rico o en presencia de fuentes de carbono como la glucosa. Los resultados señalan que ambos fenomenos son independiente. Mientras que la inhibición de la actividad del factor sigma 54 de la ARM polimerasa es la causa de la represión del promotor en medio rico, la inhibición ejercida por la glucosa se realiza a través de la fosforilación de la proteína IIANtr, codificada por el gen ptsN. Este gen forma parte de un agrupamiento génico que incluye también el gen rpoN, que codifica el factor sigma. Los posibles mecanismos implicados y la relación entre ellos también se discute.

Autor: BERRENDERO DE SAN ANTONIO M. ANGELES.
Año: 1998.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.

Resumen: En el trabajo desarrollado en esta tesis doctoral se ha precedido a la semi purificación de los extractos de 14 lipasas microbianas, procedentes de bacterias, hongos, actinomicetos y levaduras. Con los liófilos obtenidos se ha realizado una caracterización preliminar de su actividad lipolítica en reacciones de hidrólisis en agua y de síntesis en medio orgánico de polaridad o puesta (heptano y acetona). Una vez determinada la selectividad de los nuevos biocatalizadores en las reacciones anteriormente citadas, se ha procedido a su aplicación como biocatalizadores en reacciones de síntesis de emulgentes de tipo no iónico (mono y diglicéridos). Dichos procedimientos de síntesis han sido previamente optimizados mediante el empleo de otros biocatalizadores de tipo comercial. Finalmente se ha realizado un estudio comparativo de los diferentes procedimientos empleados en la síntesis de dichos compuestos en presencia y ausencia de disolvente orgánico, con las lipasas microbionas no comerciales objeto de estudios. De la comparación establecida se deduce cual es la lipasa micriobiana más útil para cada procedimiento. Análogamente a la síntesis de monoésters de glicerina, se ha optimizado la síntesis de compuestos con mayor grado de sustitución, es decir grasas, y aceites útiles tambibes en la industria alimentaria, cosmética y de alimentación, mediante la aplicación de una estrategia de reacción limpia, respetuosa con el medioambiente, y que permite la obtención de compuestos con un alto grado de pureza y en cantidades importantes.

Autor: AGROMAYOR LUZAN MONICA.
Año: 1998.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.

Resumen: En este trabajo se realiza un estudio clínico de la enfermedad infecciosa producida por el poxvirus humano Molluscum contagiosum (MCV), analizándose la epidemiología molecular de MCV. Así mismo, se estudia la respuesta de anticuerpos en el suero de los pacientes y se caracteriza la respuesta inmune celular, con respecto a la presencia de poblaciones celulares del sistema inmune y la expresión de citoquinas humanas. Los datos presentados demuestran una elevada incidencia de la infección por MCV en niños, especialmente en casos de dermatitis atópica, e indican que el subtipo viral MCV I es predominante en la población estudiada. El análisis del suero de los pacientes indica que MCV genera una respuesta de anticuerpos débil y variable. El estudio de la respuesta inmune celular revela la ausencia de linfocitos CD4+ y CD8+ dentro del cuerpo molluscum, si bien aparecen en gran número en la dermis y en la epidermis perilesional en presencia de inflamación; las células de Langerhans CD1a presentan una distribución similar, independientemente del estado inflamatorio de la lesión. En este estudio se demuestra que el patrón de citoquinas es de tipo Th1, lo que está de acuerdo con la existencia de una respuesta humoral tan leve y apoya la hipótesis de que, en la infección por MCV, el mecanismo más importante en la resolución de la enfermedad es la inmunidad celular. Finalmente, se confirma la expresión in vivo de varios genes específicos de MCV, que están presuntamente implicados en la evasión de la respuesta inmune del huésped.

Autor: VICENTE TORRES M. ANGELES.
Año: 1998.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: QUIMICA.

Resumen: En esta Memoria de Tesis Doctoral se han analizado los efectos de la estimulación acústica, la ganglionectomía cervical superior y la perfusión por vía aórtica de una disolución anticoagulante sobre las concentraciones cocleares de dopamina, noradrenalina, serotonina y sus metabolitos. Estos compuestos se han cuantificado mediante HPLC en cócleas de ratas expuestas a las situaciones experimentales anteriores. Asimismo se han cuantificado las concentraciones basales de estos compuestos en el vestíbulo de la rata. La estimulación acústica modificó el metabolismo de la dopamina y la noradrenalina cocleares y no afectó el de la serotonina, lo cual sugiere la liberación sináptica de dopamina y serotonina debido al ruido. El pretratamiento con un agonista dopaminérgico disminuyó las modificaciones inducidas por el ruido en el metabolismo de la dopamina, sugiriendo el bloqueo de su liberación sináptica. En esta Memoria se concluye además que la dopamina coclear procede fundamentalmente del sistema eferente olivococlear, la noradrenalina del ganglio cervical superior y la serotonina de la sangre, aunque una proporción importante de serotonina tiene otro origen, probablemente neural. En el vestíbulo se ha descrito por primera vez la presencia de dopamina y serotonina y se ha cuantificado además la concentración de noradrenalina.