BIOQUIMICA MOLECULAR, 5

Autor: SERRA MUXI MONTSERRAT.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: VETERINARIA.
Centro de realización: ESCUELA DE POSTGRADO.

Resumen: Esta tesis está centrada en el estudio de componentes de la matriz extracelular y su papel en el desarrollo del melanoma. La tesis está estructurada en tres bloques diferenciados. En el primero se hace un estudio comparativo entre diferentes líneas de melanoma humano y canino para establecer la validez de las líneas caninas como futuro modelo para la investigación oncológica. Los diferentes aspectos estudiados demuestran que existe un paralelismo entre las líneas humanas y las caninas. Como los resultados anteriores indican que hay una expresión diferencial de las diferentes isoformas de versicano tanto en las líneas de melanoma humano como las de canino, en el segundo bloque de la tesis se estudia el efecto de la sobreexpresión de la isoforma V3 de versicano. Estos experimentos se realizaron en dos líneas celulares de melanoma humano y dos de melanoma canino, donde una era indiferenciada y expresada las isoformas V0 y V1 de versicano, y la otra era diferenciada y no expresaba ninguna isoforma. Los resultados obtenidos demuestran que la sobreexpresión de V3 reduce marcadamente el crecimiento celular, incrementa la adhesión celular sobre una matriz de ácido hialurónico e incrementa la migración sobre este substrato. Así mismo, este incremento en la migración se bloqueaba cuando las células eran pre-incubadas con ácido hialurónico soluble o con anticuerpos bloqueantes de CD44, lo cual sugiere que V3 actua alterando la interacción entre el ácido hialurónico y CD44. También se realizaron estudios tumorigéncios en estas líneas en los que se demuestra que los ratones inyectados con las células que sobreexpresan V3 tienen unas latencias más largas que los animales control, lo cual coincide con el retraso del crecimiento observado in vitro. Además, en el estudio de los tumores generados en ratones también se observó la expresión diferencial del versicano, ácido hialurónico y CD44. En el último bloque se estudió la presencia de CD44 y ácido hialurónico, así como su papel en la formación de la matriz pericelular, en el melanoma canino. De estos estudios se concluye que la presencia de versicano, ácido hialurónico y CD44 que las benignas. La aplicabilidad de los resultados de la tesis parece clara para establecer el melanoma canino como un modelo que permita la realización de estudios clínicos más asimilables al modelo humano, a diferencia de los que pasa con el modelo murino, más utilizado en la actualidad. Los resultados de esta tesis se han publicado en forma de tres artículos en revistas internacionales.

Autor: CARRO PUENTEDURA DAVID.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: ESCUELA DE POSTGRADO.

Resumen: Las levaduras silvestres presentan una acusada inestabilidad cariotípica durante el crecimiento vegetativo. Hemos analizado alrededor de 500 cariotipos de derivados mitóticos y meióticos de la cepa vínica silvestre DC5, la cual presenta una frecuencia de inestabilidad cariotípica de 8.2x10-2 cambios/clon/generación. Un 70% de los derviados meitóticos de DC5 presentó una baja frecuencia de inestabilidad cariotípica, con una media de 5.8x10-4 cambios/clon/generación, sugiriendo que la inestabilidad cariotípica es un fenotipo de carácter dominante. Los derviados diploides con una baja tasa de inestabilidad cariotípica mitótica, también presentaron una baja tasa de inestabilidad cariotípica en meoisis, sugiriendo que los dos fenotipos están ligados. La cepa DC5 y alguno de sus derivados meióticos (tanto los de baja como los de alta frecuencia de variabilidad cariotípica) presentaron una manifiesta hipervariabilidad en el cromosoma XII, aunque esta no es un indicativao de inestabilidad genética. Los derivados cariotípicamente inestables,pueden dar lugar a derivados estables con un alta frecuencia. La inestabilidad genética de una cepa dificulta la posibilidad de aplicar progrmas de mejora genétia en esta para su aplicación industrial. La inestabilidad cariotípica es un fenómeno de carácter dominante, y que depende de pocos elementos genéticos. La disrupción del gen RAD52 en una cepa hipervariable, estabiliza parcialmente su cariotipo. Concretamente la disrupción de RAD52 elimina la recombinación subtelomérica y telomérica, no influye en la hipervariabilidad del cromosoma XII y reduce en un 30% la frecuencia de inestabilidad cariotípica. Por consiguiente, existen al menos tres mecanismos relacionados con la inestabilidad cariotípica en cepas salvajes, de los que dos son independientes de recombinación homóloga-RAD52. El mutante rad52 presentó un fitness industrial equiparable a la cepa de salvaje, en la segunda fermentación del cava, en concreto en lo que a capacidad de fermentación vigorosa se refiere. El aislamiento físico y el análisis de algunas variantes de tamaño del cromosomoa I en etas cepas, mostró cmo estas diferían en las regiones subteloméricas, permaneciendo el cuerpo central cromosómico de 150 Kb inalterado. El mapeo fino de dichas regiones subteloméricas, mostró grandes alteraciones en dos loci muy similares, FLO1 y FLO9. Estos loci se localizan en los brazos derecho e izquierdo del cromosoma I. Estos genes poseen secuencias repetidas internas. Algunas variantes del cromosoma I que carecen del gen FLO1 mostraron un evidencias de procesos recombinatorios en regiones del brazo derecho que contienen LTRs y Tys. Por lo tanto proponemos que las secuencias repetidas en algunas regiones subtelomérivas de S.cerevisiae pueden jugar un papel la hipervariabilidad cariotípica. Algunas de dichas secuencias codifican proteínas de membrana y de interacción con el medio, por lo que la plasticidad subtelomérica puede implicar un mecanismos de adaptación a substratos específicos. Este patrón semi-conservatorio de reorganizaciones cormosómicas puede tener importantes implicaciones, tanto desde un punto de vista evolutivo como para diferentes procesos biotecnológicos.

Autor: GONZÁLEZ TIMÓN BELÉN.
Año: 2003.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGÍA.

Resumen: El balance entre proliferación y supervivencia de células musculares lisas vasculares (CMLV) juega un papel crítico en el desarrollo de la lesión aterosclerótica. Estos procesos están regulados por cambios en la expresión local y en la señalización del eje IGF-I en CMLV de la placa de ateroma. La acumulación de lipoproteínas de baja densidad (LDL) y su oxidación en la pared vascular tienen un papel central en la aterogénesis. Recientes evidencias sugieren que la acumulación de LDL en la pared vascular induce cambios locales en la expresión y señalización de IGF-I. En este trabajo hemos estudiado los efectos de las LDL sobre la proliferación, supervivencia y vías de señalización de IGF-I en un modelo de CMVL de neoíntima (CMLV-A10). Hemos demostrado que las LDL nativas y oxidadas modulan opuesta y específicamente la vía de señalización IRS-1/PI3K/Akt inducida por IGF-I en CMLV-A10. Este efecto se asocia con una modulación diferencial de las acciones proliferativas y antiapoptótica de IGF-I por las LDL en función de su concentración y grado de oxidación. El óxido nítrico (NO) modula los efectos finales tanto de IGF-I como de LDL en CMLV. En la última parte de este trabajo hemos estudiado su efecto sobre la interacción de LDL e IGF-I en nuestro modelo celular. Hemos demostrado que el NO es capaz de regular la interacción de IGF-I y LDL en señalización, proliferación y apoptosis de CMLV-A10.

Autor: RIERA MENÉNDEZ JOSÉ.
Año: 2003.
Universidad: OVIEDO.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: En este trabajo se aborda la identificación y caracterización de un gen aislado en condiciones inflamatorias en macrófagos de ratón dentro del proyecto en estudio de la respuesta inflamatoria mediada por macrófagos. Las características en las que fue aislado le confieren además una serie de características propias de los macrófagos que están en una situación de inflamación crónica. La caracterización de su cDNA nos permitió la identificación de este gen como MnudC, e incluirlo dentro de un grupo de proteínas, denominado NUDC, muy conservadas durante la evolución. Estas proteínas fueron implicadas inicialmente en al migración nuclear de Emericella nidulans, pero a medida que se fueron identificando nuevos miembros en otros organismos el número de funciones se ha ido incrementando considerablemente hasta el punto de considerar a estos genes como esenciales para la supervivencia celular. En este trabajo se llevó a cabo la identificación y caracterización del gen, poniendo especial interés en la zona 5' no codificante en cuanto a su importancia como región promotora y reguladora del gen. Hemos verificado la funcionalidad de esta zona como región promotora si como identificado una serie de sitios de unión a factores de transcripción posiblemente implicados en su regulación. Hemos estudiado su expresión tanto en tejidos adultos como a lo largo del desarrollo embrionario así como en células en cultivo sometidas a diferentes estímulos inflamatorios. Nuestros estudios indican que MNUDC está implicado en la regulación de la actividad de enzima PAF-AH(I). Así hemos demostrado que MNUDC se une a la subunidad reguladora b de PAF-AH(I), y como consecuencia de esta unión se produce un incremento en la actividad enzimática del holoenzima PAF-AH(I) sin que haya efecto sobre la subunidad catalítica aislada.

Autor: QUESADA FERNANDEZ VICTOR.
Año: 2003.
Universidad: OVIEDO.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: El degradoma de un organismo se define como el conjunto de proteasas que se expresan en dicho organismo en un momento dado. Las proteínas influyen en múltiples procesos fisiológicos, desde el ciclo celular y la apoptosis hasta la formación del hueso y el establecimiento de rutas neuronales. Además, la actividad de las proteasas está involucrada en el desarrollo de diversas enfermedades, incluyendo la formación de metástasis tumorales. En la presente Tesis Doctoral se describe la identificación y caracterización de nuevas proteasas, la matriptasa-2 y la poliserasa-1, pertenecen al grupo de las serín-proteasas transmembrana de tipo II. El gen de la matriptasa-2 se expresa específicamente en hígado, mientras que el gen de la poliserasa-1 se expresa en múltiples tejidos y líneas celulares tumorales. La estructura de la poliserasa-1 se caracteriza por la presencia de dos dominios catalíticos de tipo serín-proteasa y un dominio homólogo inactivo del mismo tipo. Los dominios catalíticos recombinantes de la matriptasa-2 y la poliserasa-1 muestran actividad proteolítica frente a sustratos típicos de las serín-proteasas. Además, se describe la identificación y caracterización de 22 nuevas proteínas de la familia USP de cisteín-proteasas específicas de ubiquitina, incluyendo cuatro homólogos inactivos. Los genes de estas nuevas proteasas se expresan preferentemente en músculo esquelético y testículo, aunque algunas USPs se expresan en múltiples tejidos. Las formas recombinantes de doce de estas nuevas USPs son activas proteolíticamente frente a un sustrato que contiene ubiquitina. Ninguno de los homólogos inactivos muestra actividad proteolítica en este ensayo. Por último, se describe la identificación y caracterización de la ovastacina, una nueva metaloproteasa de la familia de las astacinas. Las estructura de la ovastacina contiene una secuencia, una nueva metaloproteasa de la familia de las astacinas. La estructura de la ovastacina contiene una secuencia señal de secreción, un prodominio, un dominio catalítico de tipo astacina y una extensión carboxilo terminal sin similitud significativa con otros dominios conocidos. El gen de la ovasticina se expresa específicamente en ovarios humanos y murinos. La expresión de este gen en ratones es específica de los óvulos sin fertilizar y de embriones de 1,5 días de edad. El dominio catalítico recombinante de la oyastacina humana hidroliza sustratos típicos de las metaloproteasas, y se inhibe en presencia de inhibidores generales de este tipo catalítico. Los inhibidores tisulares de metaloproteasas (TIMPs) no afectan significativamente a la actividad de este enzima recombinante.

Autor: MARTINEZ GIMENO MARIA.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: ESCUELA DE POSTGRADO.

Resumen: La retinosis pigmentària (RP) es una enfermedad hereditaria que provoca una degeneración progresiva de la retina y en la mayoría de los casos conduce a la ceguera. El trabajo realizado ha permitido clasificar genéticamente a los pacientes afectados de RP, atendiendo a su patrón de herencia. Uno de los objetivos ha sido la determinación del origen molecular de la RP en los casos de retinosis pigmentaria autosómico dominante (RPAD) en la población española así como en casos esporádicos o aislados de RP (SRP). Así, se ha realizado el estudio genético directo de los genes de expresión específica de retina asociados a retinosis pigmentària autosómica dominante (RHO, RDS-periferina, ROM-1, RP1, NRL y CRX) y la caracterización de las mutaciones detectadas. Se recogen también la expresión clínica de las mutaciones descritas y, en los casos que ha sido posible, se ha procurado establecer una co-relción genotipo-fenotipo. Así mismo, se han clonado los genes NRL y CRX, factores de transcripción de genes específicos de retina asociados a RPAD. A partir del gen NRL clonado y, mediante mutagénesis dirigida por PCR, se han obtenido in vitro dos mutaciones del gen NRL detectados en la población estudiada. Estudios in vitro de expresión génica con estos mutantes muestran una regulación diferencial del promotor del gen de la rodopsina con respecto a la proteína salvaje, produciendo una sobre expresión del gen regulado. Se postula que una sobre alteración de la dosis génica puede ser un mecanismo patológico que desencadene la enfermedad.

Autor: PEREZ PATALLO EUGENIO.
Año: 2003.
Universidad: OVIEDO.
Centro de lectura: BIOLOGÍA .

Resumen: La eloramicina es un compuesto antumoral producido por Streptomyces olivaceus Tü2353, que pertenece a la familia de las antraciclinas y está relacionada con el tetracenomicina C. Estructuralmente se define como un policétido aromático tetracíclico, que procede de la condensación de 10 unidades de acetato. Su aglicón se encuentra glicosilado, en el grupo hidroxilo de la posición C-8, por un residuo de L-ramnosa permitilada. No existe demasiada información sobre los genes responsables de la biosíntesis de eloramicina. A partir de una genoteca del microorganismo productor Strreptomyces olivaceus Tü2353, se aisló un cósmido (16F4) que contenía parte de los genes de la ruta de biosíntesis de eloramicina. La expresión de dicho cósmido en diferentes microorganismos productores de anitbióticos glicosilados, dio lugar a la formación de tetracenomicinas derivadas con diferentes 6-desoxiazúcares. A partir del cósmido 16F4 se aislaron, identificaron y carcterizaron cuatro genes (elmGT, elmMI y elmMIII) que codificaban una glicosiltransferasa y tres metiltransferasas responsables de la incorporación de L-ramnosa permetilada. Estos enzimas mostraron también cierta especificidad relajada cuando se utilizaban como sustrato diferentes derivados tipo tetracenomicina y, por este motivo, constituyen una poderosa herramienta en la síntesis de nuevos antibióticos mediante la glicosilación y metilación de los azúcares de sus respectivos aglicones

Autor: SIMÓN VECILLA ERNESTO.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y DE FORMACIÓN CONTINUADA.

Resumen: Esta tesis está estructurada en forma de dos publicaciones. En la primera de ellas se utiliza una cepa de Saccharomyces cerevisiae que presenta un fenotipo sintético letal condicional que consiste en una parada del ciclo celular en la fase G1 con el fin de identificar genes que en multicopia revierten este fenotipo. La cepa en cuestión presenta una delección del gen que codifica la fosfatasa Sit4 y una sobreactivación de la fosfatasa Ppz1, que se consigue mediante la represión controlable de un inhibidor endógeno (Hal3). Utilizando esta aproximación se identificó el gen NHA1, que codifica un antiportador Na+, K+/H+ implicado en la detoxificación de cationes sodio y litio. Como consecuencia, se estudió si otros genes con función similar podían revertir el fenotipo sintético letal. En este sentido el trabajo demuestra que ni la potente Na+ -ATPasa Ena1 de S.cerevisiae ni el antiportador Sod2 de Schizosaccharomyces pombe son capaces de mimetizar la funcionalidad de Nha1 en este sentido. En este trabajo también se demuestra que en la región carboxi terminal de la proteína existen elementos imprescindibles para la función de Nha1 como regulador del ciclo celular y residuos importantes para el transporte de cationes potasio. No obstante, el hecho de que la proteína Cnh1 de Candida albicans, con una función similar a Nha1 sea incapaz de revertir el bloqueo de crecimiento de la cepa modelo, parece indicar que una la capacidad de transporte de potasio de Naha1 no es la responsable de la superación de esta parada del ciclo celular. Asimismo, el hecho de que versiones mutadas de Nah1 deficientes en el transporte de sodio y litio sean capaces de revertir el fenotipo de letalidad sintética y de que mutantes funcionales para el transporte estos cationes y de cationes potasio no lo sean, descarta una relación entre el transporte de cationes y el efecto de Nha1 en el ciclo celular. Otro resultado importante en este trabajo ha sido la identificación de mutaciones que permiten la descriminación entre cationes sodio y potasio en este tipo de antiportadores. En el segundo trabajo publicado se hace un estudio detallado de la región carboxi-terminal de Nha1 necesaria para su función en el ciclo celular que fue identificada en la publicación anterior. Este análisis se ha realizado mediante la generación de mutaciones al azar en la zona en cuestión por la técnica de Random Mutagenesis PCR. Como resultado, se han identificado una serie de residuos necesarios para la función en el ciclo celuar y se ha analizado la funcionalidad de las versiones mutadas resultantes como detoxificadores de sodio, litio y potasio, identificando residuos y zonas importantes para la actividad como detoxificador de sodio y litio por un lado y de potasio por el otro.

Autor: HERRÁEZ BARANDA LUIS ANTONIO.
Año: 2003.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: En esta tesis doctoral planteamos la hipótesis de que la tolerancia a los fármacos opioides que interaccionan con el receptor opioide kappa está relacionada con cambios en sus niveles de expresión. Para demostrar esta hipótesis inducimos tolerancia a un agonista opioide inespecífico (morfina) y a un agonista específico kappa (U-50,488H) en ratas. Una vez obtenidos los animales tolerantes, comparamos los cambios en la expresión del receptor opioide k entre los estadios tolerante y control mediante la técnica de hibridación in situ. Los niveles de expresión se cuantificaron en dos puntos cruciales de las vías nociceptivas, la sustancia gris periacueductal y las láminas I y II del asta dorsal de la médula espinal. Los resultados obtenidos muestras diferencias en la expresión del receptor opioide kappa entre las ratas tolerantes a morfina y sus controles en las columnas lateral y dorsal de la sustancia gris periacueductal, mientras que no se detectan cambios ni en las columnas dorsolateral ni ventrolateral del mismo área anatómica, ni en las láminas I y II del asta dorsal de la médula espinal. Respecto a las ratas tolerantes a U-50,4088H, no es posible evaluar si hay diferencias estadísticamente significativas en la expresión de este receptor debido a la falta de independencia muestral. Además, la disminución de la expresión del receptor opioide kappa ante la exposición prolongada a la morfina que hemos detectado nos permite postular un nuevo modelo que explica por primera vez porqué la tolerancia a agonistas tipo mu puede ser revertida mediante la administración simultánea de agonistas tipo kappa. Por otra parte, en esta tesis doctoral presentamos, por primera vez, pruebas concluyentes sobre la existencia del RNA mensajero codificante para el receptor opioide Kappa en el cerebelo de la rata. Esta expresión sucede tanto en la capa granular como en la molecular y en neuronas y células gliales.

Autor: MAS MONTEYS ALEXANDRE.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y DE FORMACIÓN CONTINUADA.

Autor: RAMÍREZ MORENO SERGIO.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y DE FORMACIÓN CONTINUADA.

Autor: ORREGO CARDOZO MARY.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y FORMACIÓN CONTINUADA.

Resumen: La histona H1 es necesaria para la condensación de la cromatina y puede estar implicada en la activación y en la inhibición de genes específicos. La histona H1 está codificada por una familia multigénica. En los mamíferos hay seis subtipos somáticos, H1a-e y H1º, una variante específica de la línea germinal masculina, H1t, y una variante propia de los oocitos, H1oo. Hemos estimado las afinidades relativas de los seis subtipos somáticos de mamíferos, H1a-e y H1º, por la SAR del agrupamiento de los genes de las histonas de Drosophila y por un fragmento de pUC19 de similar longitud, mediante un ensayo de competición de dos subtipos presentes en similar concentración por una cantidad limitada de DNA. El orden de afinidades por la SAR fue H1a (1,0) menor H1c (3,9) menor H1b (5,4) menor H1e (14,4) menor H1º (19,5) menor H1d (20,0), donde el número entre paréntesis es la afinidad relativa expresada en relación al subtipo de unión más débil, la H1a. El orden de afinidades por el fragmento de pUC19 fue H1a (1,0) menor H1c (5,3) menor H1b (6,4) menor H1e (16,5) menor H1º (22,3) menor H1d (25,5). Las afinidades relativas de los subtipos por la SAR y el pUC19 son similares. Es posible distinguir tres grupos de afinidad: la H1a de baja afinidad, la H1b y la H1c de afinidad intermedia y la H1d, H1e y H1º de alta afinidad. Experimentos de desplazamiento de un subtipo unido al DNA por otro subtipo añadido, posteriormente confirman cualitativamente el orden de afinidades obtenido de los experimentos de equilibrio. Experimentos de competición entre el fragmento SAR y el fragmento de pUC19 por una cantidad limitada de uno de los subtipos de la H1 muestran que todos los subtipos somáticos, H1a-e y H1º, comparten el carácter de proteínas de unión a las SAR. Las afinidades de cada uno de los subtipos por el DNA están determinadas a la vez por las características de cada subtipo y de las secuencias de DNA a las que se unen. La perturbación del complemento de H1 de la cromatina nativa mediante la adición de subtipos de la H1 exógenos, en presencia de SAR paramentener la estequiometría de la H1 en la cromatina, ha permitido estimar las afinidades relativas de los subtipos H1a-e y H1º por la cromatina. El orden de afinidades expresado en relación a la H1a fue H1a (1.0) menor H1b (4.1) menor H1c (6.2) menor H1e (15.3) menor H1º (16.6) menor H1d (19.0). Las afinidades relativas son similares a las obtenidas para el el DNA. Como en el caso del DNA, es posible distinguir tres grupos de afinidad: la H1a de baja afinidad, la H1b y la H1c de afinidad intermedia y la H1d, H1e y H1º de alta afinidad. Los experimentos de condensación de los fragmentos de la SAR, el PUC19 y el pBR322 con PEG, que condensa el DNA por efecto del volumen excluido, demuestran que las características estructurales y/o mecanoelásticas del propio DNA determinan en gran medida la tendencia a la condensación ordenada que da lugar al espectro *. La condensación mediante ligandos catiónicos, histonas H1c y H1e, que neturalizan la carga de los fosfatos del DNA, confirma esta conclusión, pues la intensidad de los espectros * de los complejos de los diferentes DNA con estos ligandos es proporcional a la observada con PEG. En la condensación por neutralización la naturaleza del ligando también tiene un papel, que se manifiesta por la, en general, mayor intensidad del espectro * con la H1e que con la H1c, esta última con menor afinidad por el DNA. Las curvaturas estables, presentes en la SAR, ejercen un efecto desfavoralbe sobre la condensación. Este efecto desfavorable puede ser limitado por la distamicina que "estira" el DNA.

Autor: PÉREZ ALCALÁ SIRO.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: INSTITUTO CAJAL, CSIS.

Resumen: Los miembros de la familia de factores de transcripción Sox están implicados en diversos procesos de desarrollo, incluyendo la determinación sexual, la neurogénesis y el desarrollo del esqueleto. LSox5 pertenece al grupo D de factores Sox y, en conjunción con Sox6 y Sox9, se ha descrito que es capaz de promover la condrogénesis por medio de la activación de la expresión de moléculas de matriz extracelular específicas del cartílago. Hemos clonado el homólogo en pollo de LSox5, viendo que se expresa inicialmente en la cresta neural premigratoria y migratoria después de Slug, Sox9 y FoxD3. Posteriormente, la expresión de LSox5, se mantiene en los derivados de la cresta neural cefálica y parece que podría ser requerido para el desarrollo del linaje glial, las células de Schwann y la glía satélite de los ganglios craneales. La sobreexpresión de LSox5 en el tubo neural cefálico produjo la activación inmediata de la expresión de RhoB en todo el eje dorsoventral del tubo neural. Además, la expresión forzada y prolongada de LSox5 aumentó el territorio dorsal de generación de cresta neural, así como el periodo temporal de formación de la misma, lo que condujo a una sobreproducción de células de cresta neural en regiones cefálicas. En adición al epítopo HNK-1, se indujo la expesión de genes como Sox10 y Pax7 en las células que delaminaban de la región dorsal extendida de generación de cresta neural, mientras que la expresión de genes como N-Cadherina, Wnt-1 y BMP-7 disminuyó en dicha zona. Además, las células de cresta neural adicionales generadoras expresaban marcadores anteriores a LSox5 en la cascada génica de producción de cresta neural, como Slug o FoxD3, indicando que podría estar operando un bucle de retroalimentación durante la generación de la cresta neural. De este modo, nuestros datos muestran que, en adición a los factores Sox del grupo E, como Sox9 y Sox10, un factor del grupo D, LSox5, también participa en la generación de cresta neural, y sugieren que podría haber una interacción cooperativa entre ellos durante este proceso, de un modo similar a lo que ocurre durante la formación del cartílago.

Autor: ORTEGA CÓRDOBA MERCEDES.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS .
Centro de realización: UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID.

Resumen: La hipótesis actual para explicar el origen del enfisema está basada en los procesos de inflamación-reparación que ocurren tras una agresión pulmonar. Dicha hipótesis pone de relieve no solamente el papel estructural de la matriz extracelular sino también su participación activa durante el desarrollo de la EPOC. Dada la experiencia de nuestro laboratorio en la elaboración de modelos animales de enfisema inducido (con cloruro de cadmio para inducir enfisema centroacinar y eelastasa porcina pancreática para inducir enfisema panacinar) y en el estudio de sus características a nivel funcional y morfométrico [Rubio ML y col., 198], justificamos el uso de dichos modelos experimentales por asemejarse al comportamiento del enfisema pulmonar humano. Nuestro objetivo fue estudiar estos modelos de un modo secuencial, estableciendo unos periodos de estudio que abarcaran desde las primeras horas tras la inducción de la lesión hasta los 28 días tras los cuales la lesión ya es evidente y más o menos estables. En dicho estudio secuencial, se quería conocer el comportamiento de la matriz extracelular durante el desarrollo del enfisema en ambos modelos animales y ver si dicho comportamiento o no diferente entre ambos. Conocer la participación de los procesos inflamatorios y la participación de factores de crecimiento tales como el TGF-beta y el CTGF, por ser las citoquinas con relación más directa con la síntesis de proteínas de matriz extracelular. Los datos funcionales y morfométricos en ambos modelos animales fueron compatibles con la presencia de enfisema. El estudio de las proteínas de matriz extracelular mostró un aumento de expresión de los colágenos tipos I y III y de elastina, a los 8 días tras la instilación en el modelo centroacinar y a los 4 días en el modelo panacinar. La respuesta inflamatoria aparece en las primeras horas tras la inducción de la lesión mediante un aumento significativo de TNFalfa en ambos tipos de enfisema, y una posterior participación del TGF-beta y del CTGF durante las fases temprana y tardía en el modelo panacinar y solamente en la fase tardía en el modelo centroacinar. En conclusión, la inducción de enfisema en estas condiciones experimentales provocan una primera respuesta inflamatoria y una posterior remodelación tisular con aumento de la expresión y la síntesis de las proteínas de la matriz extracelular, y la participación de citoquinas como el TGF-beta y el CTGF.

Autor: MARTÍNEZ JIMÉNEZ MARÍA I..
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGÍA.

Resumen: La replicación del bacteriófago de Bacillus subtilis, SPP1 es de dos modos: tipo theta y tipo sigma. Se ha caracterizado la replicación tardía, tipo sigma, llegando a las siguientes conclusiones: 1,- G34.1P y G35P forman parte de la familia de recombinasas RecET/Redab/Rad52 pero no complementan a las estirpes mutantes en formación de intermedios de recombinación de B.subtilis en recA, recU y recO. El sistema G34.1P y G35P de SPP1 ha podido evolucionar hacia un tipo de recombinación diferente al de la célula huésped ya que necesita como producto el establecimiento de la replicación tipo sigma. También puede deberse a la necesidad de interacciones específicas protéina-proteína que G34.1P y G35P no pueden realizarse. 2,- Se han clonado y purificado 2 proteínas mutadas de G35P. Estas aún mantienen el/los dominios de oligomerización y unión a ADN. Sin embargo la proteína G35P95-287 carece de actividad de anillamiento de cadenas. La región de apareamiento de cadenas probablemente se sitúe en el N-terminal de la proteína. 3,- G36P en un dímero que une con alta afinidad ADNcs de longitudes superiores a 41-nt. G36P compite con G35P por la unión a ADNcs y parece estar reclutada por esta. 4,- Se ha clonado y purificado G34.1P. G34.1P se presenta como dímero en solución. Se ha caracterizado su actividad exonucleasa: A,- G34.1P es una exonucleasa alcalina por polaridad 5' a 3' dependiente de Mg2+. B,- Digiere con mayor eficiencia ADNcd que ADNcs. C,- Necesita de la presencia de un fosfato en el extremo 5' para su unión. D,- La actividad exonucleasa en ADNcd es dependiente de la secuencia. 5,- G36P inhibe la acción de G34.1P sobre en ADNcs por la protección física de este. G36P dirige la actividad exonucleasa de G34.1P sobre en ADNcs por la protección física de este. G36P dirige la actividad exonucleasa de G34.1P hacia un sustrato útil. 6,- G35P estimula la unión de G34.1P al ADNcd, y favorece la producción de un sustrato útil para G35P. Ambas proteínas trabajan de forma coordinada produciendo anillamiento de cadenas homólogas. 7,- G38P puede parar la horquilla de replicación y protege al ADNcd de la acción de G34P. G38P redirige su actividad hacia un sustrato que de replicación * en el sentido que pueda ser empaquetable. 8,- La subunidad * de la ADN Pol III y 2 proteínas mutadas *(1-372) y *(373-563) se han clonado y purificado. La proteína silvestre es un tetrámero en solución y las delecciones se comportan como tetrámero inestable y dímero. Los datos sugieren que hay dos dominios de oligomerización, uno en la región N-terminal de la proteína y otro en la región C-terminal. 9.- La helicasa G40P interacciona con * en ausencia de ATP y ADN en una proporción 1:1. Las regiones implicadas son el C-terminal de G40P y el C-terminal de *. 10.- La presencia de * favorecela estabilidad del complejo G40P-ADN y puede re-establecer la unidireccionalidad de la helicasa. * aumenta la actividad ATPasa y helicasa de G40P probablemente de forma indirecta al incrementar su unión a ADN. 11,- La replicación dependiente de recombinación del fago SPP1 puede darse a partir de la rotura de cualquiera de las hebras molde y puede invadir en una molécula intacta o rota. El re-ensamblado de la maquinaria de replicación tine la dirección óptima para el empaquetamiento.

Autor: MORENO ALBIGER RENATA.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGÍA MOLECULAR S.O.

Resumen: En este trabajo se describe la construcción de vectores bifuncionales E.coli-Thermus, en los cuales la trascripción se encuentra bajo el control de la región promotora (Pnar) del operón de una nitrato reductasa respiratoria de Thermus thermophilus HB8 siendo inducido mediante la adición de nitrato a cultivos anóxicos o microaerofílicos. Las excelentes propiedades de este promotor se demuestran a nivel de RNA expresando desde un vector doble, una ribozima SMalfa1 termoestable procedente de Schistosoma mansoni y, en orientación opuesta, y desde el promotor constitutivo de la proteína SlpA su RNA diana. Gracias a este sistema se ha podido ver por vez primera la actividad de una ribozima "in vivo" en un microorganismo termófilo y determinar la temperatura optima de actividad de la misma. Basados también en este promotor, se han creado un par de vectores para la producción de proteínas en Thermus tanto en forma nativa, como unidas a secuencias de polihistidinas en amino o carboxilo. Para su análisis hemos empleado por primera vez en termófilos dos genes testigo que codifican respectivamente una beta-galactosidasa citoplásmica procedente de una cepa de Thermus sp; y una fosfatasa hiperalcalina periplásmica que hemos clonado a partir de una genoteca de T.thermophilus y caracterizado. Como ejemplos de aplicación de estos vectores, se muestran datos de expresión de Thermus sp como la DNA polimerasa A cuya purificación apartir de Thermus le confiere ventajas en determinados ensayos clínicos, SlrA, una proteína periplásmica muy tóxica en E.coli, y de dos catalasas de manganeso que no dan lugar a formas activas en las sobreexpresiones en E.coli. Como ejemplo de expresiones de genes procedentes de mesófilos y pensando en su futura termoestabilización por selección funcional en Thermus, hemos expresado un GFP (proteína verde fluorescente) procedente de la medusa Aequorea victoria y la xilanasa Xhis1 procedente de Streptomyces hastedii. Otra enzima termófila de interés industrial, una penicilina G acilasa de T.thermophilus HB27 ha sido descrita, clonada y expresada tanto en E.coli como en su bacteria de origen. Se han realizado mutantes en esta enzima encaminados a dilucidar su posible implicación en la unión de ácido fenilacético al peptidoglicano de T.thermophiluls. Se ha descartado esta posibilidad y se ha visto la presencia en esta bacteria de otra enzima, además de la estudiada, con actividad peniclina G acilasa.

Autor: MARTÍN FERNÁNDEZ M. JESÚS.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS DE LA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA.

Resumen: En esta tesis hemos desarrollado herramientas bioinformáticas para estudiar diversos aspectos relacionados con la variabilidad de los organismos aportando soluciones para datos con diversos grados de complejidad, desde secuencias individuales hasta genomas. 1,- Una herramienta para detectar la región de tamaño mínimo cuyo contenido informativo pueda ser suficiente para una reconstrucción filogenética correcta. El método está basado en la comparación de distancias genéticas entre pares de secuencias, obtenidas a partir de un grupo de referencia, con aquellas obtenidas para diferentes ventanas de tamaño y posición variable mediante un índice sencillo. Además, hemos presentado dos procedimientos estadísticos para comprobar si el contenido informativo de las regiones seleccionadas con esta herramienta es significativamente distinta del contenido correspondiente mostrado por las regiones genómicas utilizadas como referencia. Con esta herramienta hemos identificado regiones cuyo contenido informativo no es significativamente distinto del mostrado por las secuencias completas en las proteínas VP1 y P1 del virus de la Fiebre Aftosa y en proteínas del virus del SIDA. 2,- Una herramienta para detectar selección positiva en proteínas de genomas virales altamente variables. El método está basado en el cálculo de la tasa media de mutaicones no sinómicas frente a las sinónimas (ns/s), y en su representación en función de las distancias genéticas entre las secuencias comparadas. Con esta herramienta, hemos obtenido superficies en las que se pueden identificar regiones con selección positiva en zonas antigénicas de la proteína VP1 del virus de la Fiebre Aftosa. 3,- Una herramienta para representar perfiles de conservación de genes entre genomas completos. Estos perfiles permiten visualizar, en genomas secuenciados completamente, diferentes características del organismo estudiado y, al mismo tiempo, revelar características relacionadas con los genomas analizados (tales como, genomas defectivos y genomas que carecen de un sistema biológico particular). En este trabajo, hemos empleado esta herramienta en el estudio del genoma de la cepa K-12 de Escherichia coli. Hemos podido observar que los genes conservados no se distribuyen uniformemente en el genoma de esta especie, sino que tienden a agruparse juntos, el orden de genes está bien conservado entre especies bacterianas estrechamente relacionadas, y es posible identificar de forma inmediata genomas defectivos como el de Buchnera. Un procedimiento para estudiar los patrones de distribución de genes en genomas comparados. Este procedimiento está basado en un sistema de agrupamiento que produce, a partir de patrones de distribución, familias de genes que pueden representarse en una jerarquía de proximidad. El estudio combinado de conservación y clases funcionales, nos ha permitido identificar algunos grupos de homólogos que están bien conservados con respecto al genoma de E.coli. El estudio combinado de conservación y características fenotípicas nos ha permitido analizar algunas asociaciones fenotipo/genotipo, que en última instancia pueden ser empleadas para sugerir el gen o los genes responsables de un determinado genotipo.

Autor: CIDAD VELASCO PILAR.
Año: 2003.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.

Resumen: El tratamiento de los astrocitos con lipopolisacárido (LPS) promueve la expresión transcripcional del transportador de glucosa neuronal GLUT3, efectos que se acompaña de un aumento en la velocidad de captación de glucosa. Para estudiar si GLUT3 es responsable del aumento de captación de glucosa provocado por el óxido nítrico (NO), expresamos, en astrocitos y en la línea celular derivada de riñón humano HEK293T, un plásmido que codifica una proteína de fusión del transportador GLUT3, unido por su extremo carboxilo a la proteína fluoresecente verde. El transportador se localiza preferentemente en membrana plasmática de forma que las células muestran una mayor actividad transportadora así como una mayor protección frente a la muerte por apoptosis provocada por bajas concentraciones de glucosa. La inhibición de la cadena respiratoria mitocondrial por NO provoca un rápido aumento de la velocidad de captación de glucosa mediado por GLUT3, que es independiente de GMP cíclico y que no implica translocación de transportadores a la membrana plasmática. Además el silenciamiento del sensor de la carga energética celular, la proteína quinasa dependiente de AMP (AMPK) mediante la tecnología del RNA de interferencia, dda lugar a células que no responden al óxido nítrico estimulando la captación de glucosa. Por lo tanto el NO, vía AMPK, puede tener un efecto citoprotector contra la hipoglucemia a través de la estimulación de la captación de glucosa por GLUT3.

Autor: SERRANO CARBALLAL ELENA.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: DPTO. BIOLOGÍA MOLECULAR.

Resumen: La enfermedad de Alzheimer es un síndrome neurodegenerativo multifactorial y multigénico, en el que se ha implicado al péptido Abeta como agente causal. En este estudio, hemos analizado, en un modelo celular de neuroblastoma humano, la toxicidad del péptido amiloidogénico Abeta25-35 y el efecto de ApoE sobre dicha toxicidad, y en segundo lugar, las consecuencias de las obreexpresión de APP en este neuroblastoma. El péptido Abeta25-35 produjo una pérdida de viabilidad, acompañada de la formación de especies reactivas de oxígeno (ROS) en la línea de neuroblastoma humano SK-N-MC. Así mismo, a concentraciones subtóxicas, activaba al factor de transcripción NF-kB. La proteína ApoE, independientemente de isoforma, restauraba la viabilidad del neuroblatoma tratado con Abeta25-35, si bien, por sí misma, no tenía efecto sobre la viabilidad del cultivo. Por otra parte, hemos generado, mediante la transfección del cDNA completo correspondiente a la isoforma 695 de la proteína APP, dos líneas de neuroblastoma humano -C2 y C3- que sobreexpresan de forma estable dicha proteína. Ambaslíneas secretan Abeta1-40 al medio, y la línea con mayor expresión de APP (C2), secreta también Abeta1-42. Así mismo, ambas líneas presentan unos niveles de muerte celular basal que no presenta la línea SK-N-MC ni una línea celular control (C1-) generada por transfección de este neuroblastoma con el mismo vector de expresión utilizado para generar las líneas C2 y C3, pero sin el inserto que codifica la proteína APP695. Dicha muerte presenta características propias del programa apoptótico de muerte celular. Los experimentos de cocultivo celular, inducción de la muerte por privación de suero y la inhibición de la muerte apoptótica con un inhibidor de caspasas (Z-VAD-fmk) mostraron que el péptido Abeta producido por las líneas celulares no era el responsable de la muerte celular. La proteína ApoE no tenía ningún efecto, positivo o negativo, sobre la muerte celular basal de las líneas C2, C3 y C1-. Por último, el análisis comparativo de la expresión génica en las líneas C2 y C1- mostró que la sobreexpresión de APP en la línea celular de neuroblastoma humano SK-N-MC, conlleva la sobreexpresión de genes implicados en el programa apoptótico de muerte celular, estrés oxidativo y control de la proliferación celular. Entre los genes implicados en la EA, cabe destacar la sobreexpresión de los genes APOE y BACE2 por parte de la línea C2.

Autor: CARO AZOY EDDY.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: DEPARTAMENTO BIOLOGÍA MOLECULAR. CBM SEVERO OCHOA UAM.

Resumen: Este trabajo aborda el desarrollo de nuevas metodologías para la expresión estable de genes mesófilos en Thermus thermophilus. Se realizó la selección funcional de dos proteínas, una glucosamina-6-P-sintasa híbrida, obtenida por fusión del cominio amino terminal (Nt) de Thermus thermophilus y el dominio carboxilo (Ce) de E.coli, obteniendo un gen quimérico que se inserto mediante recombinación en el cromosoma de la bacteria termófila y se procedió posteriormente a su selección en el cromosoma de la bacteria termófilia y se procedió posteriormente a su selección funcional a temperaturas crecientes bajo condiciones nutricionales restrictivas. Al tratarse de un gen vital, relacionado con la síntesis del peptidoglicano de la pared celular, su expresión y posterior selección en "batch", condujo a la sobreexpresión de la proteína como respuesta termoadaptativa, probablemente por alteración de un gen regulador no identificado. El otro gen clonado, Xhis1, procedente de Strptomyces halstedii JM8, codifica una beta-1,4-endoxilanasa que es secretada el medio de cultivoL la expresión y posterior selección del enzima en presencia de xilano como fuente de carbono a temperaturas crecientes hasta 70ºC, provocó la selección de mutaciones en la región -10 del promotor de slpA (gen que codifica la proteína principal de la capa S de Thermus), que conllevaron a una sobreexpresión de la misma, lo que permitió el crecimiento de Thermus thermophilus a expensas de un sustrato macromolecular. Este trabajo ofrece nuevas alternativas a la posibilidad de seleccionar enzimas termoestables mediante metodologías de evolución dirigida.