BIOQUIMICA MOLECULAR, 50

Autor: MONEDERO GARCIA VICENTE.
Año: 1997.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: DEPARTAMENTO: BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR PROGRAMA DE DOCTORADO: BIOLOGIA MOLECULAR (030A).

Resumen: El proceso de represión por catabolito (RC) en Gram-positivos implica la interacción de la proteína HPr del sistema de transporte de carbohidratos fosfotranferasa dependiente de fosfoenolpiruvato (PTS) con el regulador transcripcional CcpA. Se han estudiado estos componentes en la bacteria láctica Lactobacillus casei, un microorganismo empleado en numerosas fermentaciones alimentarias. Primeramente se abordó la clonación del gen ptsH, que codifica la proteína HPr. Se complementó un mutante ptsH de Escherichia coli con una genoteca de L. casei. La secuenciación de uno de los clones, reveló la presencia de un gen con homología a priA de E. coli, que participa en la replicación del ADN. Los experimentos de fosforilación de proteínas, transporte de fructosa y mutagénesis dirigida, han permitido concluir que la complementación es debida a la titulación del represor Cra por una secuencia situada en la pauta de lectura del gen clonado, lo que produce la presencia constitutiva de la proteína DTP del sistema PTS de fructosa, que puede suplir la falta de HPr. Se ha aislado el gen ccpA de L. casei. El mutante ccpA de L. casei presentó un crecimiento reducido y una falta de RC de algunas actividades enzimáticas como la N- acetilglucosaminidasa y la fosfo-beta-galactosidasa, codificada por lacG, además de una desregulación en la expresión de actividades del metabolismo de carbohidratos, como la fosfofructoquinasa, aldolasa, piruvato quinasa, acetato quinasa y PTS-glucosa. La regulación del operón de utilización de lactosa de L. casei (lacTEGF), se ha caracterizado a nivel molecular. La expresión del operón está regulada por dos mecanismos de RC. El primero es dependiente de la proteína CcpA y su secuencia de unión al ADN en la zona promotora, el segundo precisa el transporte del azúcar represor por el sistema PTS. Adicionalmente, existe una inducción por lactosa mediante un sistema de antiterminación de la transcripción, basado posiblemente en el producto del gen lacT y su regulación por los componentes del PTS de lactosa, LacE y LacF.

Autor: MONTE COLLADO ELENA.
Año: 1997.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: DEPARTAMENTO: BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR PROGRAMA DE DOCTORADO: BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR.

Resumen: Mediante la técnica de "Differential Display" se han aislado varios cDNAs de expresión inducida en hoja, durante el proceso de tuberización, y se han caracterizado tres de ellos. El primero corresponde a una fibrilina descrita en fruto y flor, que se ha detectado asociada a la membrana tilacoidal en cloroplasto. Por analogía con la función de unión de lípidos carotenoides en fruto y flor, se propone que en hoja su función estaría asociada a los carotenos implicados en la fotoprotección en los complejos fotosintéticos. Plantas de patata transgénicas con niveles disminuidos de fibrilina, presentan alteraciones en parámetros relacionados con la fotoinhibición. El segundo cDNA corresponde a una fosfatasa tipo 2C y la reducción de sus niveles en plantas de patata adelanta la tuberización. El tercer cDNA no se ha podido identificar pero se ha determinado que tiene relación con el metabolismo de las giberelinas.

Autor: MONTEJO GADEA JUAN MANUEL.
Año: 1997.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: DEPARTAMENTO: BIOQUIMICA PROGRAMA DE DOCTORADO: BIOQUIMICA.

Resumen: La hemofilia B es una enfermedad recesiva ligada al cromosoma X producida por un gama muy variada de mutaciones en el gen del Factor IX de la coagulaci]on. Para poder identificar la mutaci]on en los pacientes españoles de Hemofilia B se examin]o sistemáticamente las zonas codificantes, la regi]on del promotor y las regiones implicadas en el procesamiento intr]on-ex]on del gen del Factor IX mediante la técnica del análisis de polimorfismos de cadena sencilla de DNA (SSCP o SSCA). Inicialmente se evalu]o la eficacia del método y se examinaron múltiples parámetros, fundamentalmente la temperatura de electroforesis, el tamp]on de electroforesis y la concentraci]on y composici]on del gel. Según los resultados obtenidos, el SSCP se mostr]o como un método muy eficaz para detectar mutaciones en Hemofilia B, con una sensibilidad del 90,47%. Este abordaje ha permitido la identificaci]on de 52 mutaciones distintas, de las que 21 no han sido identificadas previamente. Las mutaciones encontradas confirman la alta heterogeneidad molecular de esta enfermedad y apoya la necesidad de disponer de un método eficaz de diagn]ostico directo.

Autor: MONTON PELO MERCEDES.
Año: 1997.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: DEPARTAMENTO: BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR PROGRAMA DE DOCTORADO: BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR.

Resumen: El endotelio vascular ha adquirido durante los últimos años gran importancia en diversas patologías de origen cardiovascular. El objetivo de esta Tesis fué analizar si el endotelio regula la expresión de la óxido nítrico sintasa inducible (NOSi) en células de músculo liso de la pared vascular. La interleuquina I-beta estimula la expresión de la NOSi en las células de músculo liso, liberándose grandes cantidades de óxido nítrico. La presencia de endotelio disminuye la expresión de la NOSi mediante dos mecanismos: la liberación de factor transformante del crecimiento-beta y de angiotensina II. La angiotensina II ejerce su efecto a través de los receptores de tipo AT-I. El endotelio inhibe la expresión de la NOSi probablemente para protegerse del NO (óxido nítrico) liberado por las células de músculo liso vascular, ya que este ejerce efectos tóxicos sobre el endotelio.

Autor: MORENO MOZO JUAN IGNACIO.
Año: 1997.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: DEPARTAMENTO: BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR PROGRAMA DE DOCTORADO: BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR.

Resumen: Con el fin de conocer los elementos celulares que intervienen en el mecanismo de defensa vegetal frente a microorganismos patógenos, llevamos a cabo un proceso de búsqueda de plantas mutantes de arabidopsis thaliana en los que algún paso de la ruta de defensa vegetal se viese alterado. Para facilitar nuestro propósito, preparamos plantas transgénicas para que, en base a la expresión del transgen, nos permitiese aislar los mutantes de interés. Una vez identificados, los mutantes se caracterizaron desde el punto de vista fenotípico, molecular y genético. Toda la información obtenida nos permitió asignar una posible función a los productos génicos codificados, así como ubicarlos en la ruta de transducción de señal que conduce a la planta a un estado de resistencia frente a diversos microorganismos patógenos. Nuestro propósito en este momento se centra en el mapeo y posterior clonaje de los genes identificados mediante mutación, para caracterizar más en detalle los elementos reguladores del mecanismo de resistencia vegetal.

Autor: MOUSSAOUI MOHAMMED.
Año: 1997.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: DEPARTAMENTO: BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR PROGRAMA DE DOCTORADO: BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR.

Resumen: La ribonucleasa A (RNAasa A) de páncreas bovino es una enzima que cataliza la degración de su sustrato natural, el RNA. Varios estudios han indicado que en la actividad de la enzima con el RNA participan, además del centro catalítico, otros subcentros de interacción del sustrato. Este trabajo se centra en el estudio de la función de los subcentros de interacción p0 y p2 utilizando sustratos de diferente tamaño y formas de la RNAasa A modificadas en estos subcentros por modificación química y mutagénesis dirigida de los aminoácidos implicados en el proceso de interacción del sustrato. Se ha observado que cuando se utilizan concentraciones elevadas del nucleótido 2',3'-fosfato cíclico, varias moléculas de este sustrato pueden interaccionar con la enzima. Cuando se utilizan los ácidos oligocitidílicos y el ácido policitidílico como sustratos se ha observado que la eficiencia catalítica de la enzima aumenta a medida que aumenta el tamaño del oligonucleótido hasta el trímero y la eficiencia de la enzima es óptima con el sustrato polimérico poli(C). Estos resultados sugieren la participación de los subcentros adicionales en la actividad de la RNAasa A. El estudio de la actividad de las enzimas modificadas en los subcentros p0 y p2 utilizando C mayor que p y poli(C) como sustratos ha indicado que la modificación de estos subcentros afecta la actividad endonucleasa de la RNAasa A que muestra un comportamiento intermedio cuando se modifica el subcentro p0 y un comportamiento análogo a una actividad exonucleasa cuando se modifica el subcentro p2. Por tanto, se puede decir que estos subcentros participan en la interacción de la enzima con el sustrato y son necesarios para la actividad endonucleasa de la RNAasa A.

Autor: NIETO LOPEZ MARTA .
Año: 1997.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: DEPARTAMENTO: BIOLOGIA MOLECULAR.

Resumen: Las quimioquinas, en combinación con las moléculas de adhesión, dirigen la migración selectiva de las distintas subpoblaciones de leucocitos a los tejidos durante la respuesta inmune. En este trabajo se describen los efectos de las quimioquinas y otras citoquinas quimiotácticas (IL-2 e IL-15) en la polarización de los linfocitos T y células NK. Las quimioquinas inducen en los linfocitos T y células NK la formación de dos polos funcionalmente distintos en la célula. Al frente de avance de la célula se redistribuyen los receptores de quimioquinas, guiando a la célula durante la quimiotaxis. A la parte posterior o urópodo, se redistribuyen los receptores de adhesión ICAM-1,-3,CD43 y CD44. El urópodo celular, una estructura que concentra gran cantidad de moléculas de adhesión exponiéndolas al medio, media el reclutamiento de células T o NK adicionales. La polarización de los linfocitos correlaciona con la adquisición del fenotipo migratorio y es dependiente de la adhesión vía integrinas.

Autor: NUÑEZ PASCUAL BELEN.
Año: 1997.
Universidad: CANTABRIA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: DEPARTAMENTO: BIOLOGIA MOLECULAR PROGRAMA DE DOCTORADO: BIOLOGIA MOLECULAR.

Resumen: Este trabajo analiza las regiones de transferencia y de movilización de los plásmidos R6K y CloDF13 respectivamente, mediante mutagénesis por inserción de Tn5tacl y análisis de las secuencias. La región de transferencia del plásmido R6K se localiza en un segmento de 15 Kb, siendo la organización general: oriTalfa-taxA-taxC-PILx-taxB. A una distancia de 5 kb y fuera de la región TRA existe un segundo oriT funcional, oriTbeta. Ambos orígenes pueden ser procesados simultáneamente en una misma molécula. La región esencial de movilización de CloDF13 ocupa 3,6 Kb y contiene oriT-mobB-mobC. Derivados movilizables de CloDF13 pueden ser aislados como formas relajadas de DNA. La relajación del oriT in vivo requiere la presencia de mobB y mobC.

Autor: OBREGON GONZALEZ M. EVA.
Año: 1997.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: DEPARTAMENTO: BIOLOGIA MOLECULAR PROGRAMA DE DOCTORADO: INMUNOLOGIA CLINICA.

Resumen: En este trabajo se ha demostrado que existe una interacción bidireccional entre el VIH-1 y las células del sistema nervioso central, especialmente neuronas. La infección por VIH-1 altera las propiedades de las mismas. El virus induce la producción de TNF-a y NO contribuyendo en cierta medida a las alteraciones patológicas asociadas a la infección por VIH-1. Por otra parte el TNF-a y NO producido incrementa la replicación viral y permite estar en un estado crónico de infección contribuyendo a perpetuar el virus en el SNC. Estos fenómenos probablemente tienen lugar en pacientes pediátricos donde la incidencia de complicaciones neurológicas es más severa debido probablemente a la inmadurez de las neuronas.

Autor: OÑATE SANCHEZ LUIS JAVIER.
Año: 1997.
Universidad: POLITECNICA DE MADRID.
Centro de lectura: INGENIEROS AGRONOMOS.
Centro de realización: DEPARTAMENTO: BIOTECNOLOGIA PROGRAMA DE DOCTORADO: BIOTECNOLOGIA AGRARIA Y FORESTAL.

Resumen: Se han caracterizado dos factores de transcripción tipo bZIP de cebada, B1Z1 y B1Z2. B1Z1 se expresa en endospermo, raices y hojas y B1Z2 sólo en endospermo. Ambos factores funcionan cómo activadores transcripcionales en levaduras y heterodimerizan en este sistema. Mediante experimentos de bombardeo de endospermos de cebada en desarrollo, se demostró que ambos genes están implicados en la regulación positiva de la expresión génica en el endospermo.

Autor: ORTEGA DE LA TORRE M. ANGELES.
Año: 1997.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: DEPARTAMENTO: BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR PROGRAMA DE DOCTORADO: BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR.

Resumen: El intestino es un tejido de rápida renovación, proceso en el cual intervienen como moduladores los nutrientes. Además de los nutrientes esenciales conocidos, en los últimos años se había postulado que los nucleótidos podían ser necesarios para el intestino, aunque sólo ante ciertas situaciones. Un aporte de nucleótidos exógenos puede optimizar la función del tejido particularmente en períodos de crecimiento acelerado y durante la recuperación de la lesión de la mucosa, cuando el aporte endógeno puede ser insuficiente. La información de que se disponía sobre la función de los nucleótidos de la dieta en el intestino indicaba un importante papel de éstos ante situaciones de daño intestinal en neonatos, sin embargo apenas se conocía su importancia en organismos adultos. Por ello, el presente trabajo tuvo como objetivo, en primer lugar, analizar el efecto de los nucleótidos en animales adultos y viejos alimentados normalmente y tras una situación de ayuno, así como contrastar estos efectos en una situación de agresión intestinal grave, provocada por ingesta oral de tioacetamida; y en segundo lugar, estudiar los procesos de crecimiento y diferenciación de enterocitos aislados y de la línea celular IEC-6, y caracterizar el efecto de los nucleótidos. Los resultados obtenidos demuestran, en primer lugar, que los nucleótidos de la dieta aceleran la regeneración intestinal tras el ayuno, no sólo en ratas adultas sino también en ratas viejas; en segundo lugar, que los nucleótidos de la dieta son necesarios para el mantenimiento intestinal en condiciones fisiológicas normales, de forma que la supresión de los mismos de la dieta reduce la síntesis proteica intestinal; y en tercer lugar, que los nucleótidos favorecen la maduración de los enterocitos, de forma que la supresión de los mismos de la dieta induce un descenso progresivo en el contenido y en la actividad específica de las enzimas comúnmente utilizadas como marcadoras de maduración intestinal, al tiempo que contribuyen a una mayor durabilidad de las características funcionales de los cultivos de las células IEC-6. Por tanto, los efectos observados en este estudio, tanto en los experimentos desarrollados "in vivo" como en las células en cultivo, indican que los nucleótidos exógenos deben ser considerados como nutrientes para el intestino delgado y como nutrientes necesarios para la rápida adaptación a los cambios nutricionales que afectan a su funcionalidad.

Autor: PALOMERO VAZQUEZ M. TERESA.
Año: 1997.
Universidad: OVIEDO.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: DEPARTAMENTO: BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR PROGRAMA DE DOCTORADO: BIOLOGIA FUNCIONAL.

Resumen: Los mecanismos de activación de la MAP quinasa (MAPK) por el receptor de TRH se han estudiado tanto en las células adenohipofisarias que contienen dicho receptor, como en el sistema modelo constituído por las células COS-7 transfectadas transitoriamente con el receptor más la quinasa etiquetada con el epítopo HA. A pesar de que el efecto hormonal es mediado por una proteína G insensible a las toxinas del cólera y pertúsica, probablemente la Gq/11, la activación de la quinasa es tan sólo parcialmente dependiente de la proteín quinasa C (PKC). Nuestros resultados demuestran por primera vez que, contrariamente a lo supuesto hasta ahora, la fracción PKC-independiente es mediada por dímeros Beta de la proteína G. Un intermediario clave de esta segunda ruta, que coexiste pero es independiente de la mediada por la activación de la PKC vía subunidades alfa de la proteína Gq/11, es la proteína p21ras. La activación de una o más tirosín quinasas y de la fosfoinosítido 3 quinasa, pero no del receptor para el factor de crecimiento epidérmico, es un componente esencial del efecto de la TRH sobre la MAPK. Todo ello, junto con la demostración de la inducción de focos de transformación dependientes de la hormona en células NIH 3T3 transfectadas con el receptor de TRH, sugiere que dicho receptor constituye un factor potencialmente oncogénico bajo ciertas condiciones fisiológicas y/o patológicas.

Autor: PALOMINO GUTIERREZ M. TERESA.
Año: 1997.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: DEPARTAMENTO: BIOQUIMICA PROGRAMA DE DOCTORADO: BIOQUIMICA.

Resumen: Los receptores de la hormona tiroidea y del ácido retinoico (el metabolito activo de la vitamina A) forman parte de la superfamilia de factores de transcripción regulados por ligando. Estos receptores modulan programas específicos de expresión génica mediante su unión a secuencias en cis de los genes que regulan. En el presente trabajo se ha abordado el estudio de los mecanismos de regulación que ejercen los receptores de hormona tiroidea y de ácido retinoico sobre la actividad transcripcional del gen de la hormona de crecimiento de rata; asimismo se han estudiado sus efectos sobre la transcripción de un factor esencial en la activación del mismo como es GHF-1, demostrándose la implicación de las secuencias CRE del promotor de GHF-1 en los efectos producidos por la hormona tiroidea y el ácido retinoico en la transcripción de este gen en líneas celulares hipofisarias. Por otra parte, se analizaron las funciones relativas de cada uno de estos receptores y de GHF-1 en la activación del promotor de la hormona de crecimiento mediante la utilización de sistemas celulares heterólogos, detectándose en los receptores una actividad transactivadora independiente de ligando y en el caso del receptor de hormona tiroidea, la existencia de una fuerte inhibición transcripcional en respuesta a la hormona. Se mapearon las secuencias del promotor implicadas en esta regulación atípica mediada por los receptores en células no hipofisarias y se localizó una región del receptor de hormona tiroidea involucrada en la activación constitutiva de este promotor. Asímismo, se demostró que GHF-1 es requerido para la transactivación mediada por los ligandos que caracteriza al promotor de GH en la célula hipofisaria. Por otra parte, se analizaron los mecanismos de cooperación funcional entre los receptores y GHF-1 en la activación de dicho promotor, demostrándose la existencia de interacciones directas proteína-proteína. Finalmente se comprobó que la variante de procesamiento alternativo de GHF-1 (GHF-2), presenta una capacidad transactivadora muy débil en este promotor y tampoco es capaz de cooperar con los receptores, demostrándose además su escasa afinidad por la unión a ADN.

Autor: PARRAGA SAN ROMAN MARIO.
Año: 1997.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: DEPARTAMENTO: BIOLOGIA MOLECULAR PROGRAMA DE DOCTORADO: BIOLOGIA MOLECULAR.

Resumen: XYbp (XY body protein) es una proteína cuyo gen ha sido clonado y caracterizado por vez primera en este trabajo. XYbp presenta un alto grado de conservación evolutiva en eucariotas desde levaduras a humanos. Los análisis de expresión del gen XYbp revelan la expresión ubicua de un transcrito de 4.2 Kb y la expresión específica en testículo de un transcrito de 3.0 Kb. La secuenciación completa de las 18 Kpb del gen y de parte de su región promotora muestra una estructura que consta de 8 exones y 7 intrones. La región promotora contiene, entre otras, secuencias reguladoras inducibles del tipo AP-1 y HSE. El producto génico de XYbp aparece en células germinales, asociado al cuerpo XY (del que se tomó su denominación) y al centrosoma de los espermatocitos en paquitena. En células tanto de ovario como somáticas de ratón, la proteína se localiza únicamente en la región centrosómica, estando presente en todas las fases del ciclo celular. Se sugiere que XYbp pudiera ser un componente integral del centrosoma de todos los eucariotas. Finalmente y para investigar la función de XYbp, se iniciaron ensayos de transgénesis, transfecciones celulares e interacción proteína-proteína in vitro, que sugieren interacciones con proteínas microtubulares.

Autor: PARRAS PARDO CARLOS M..
Año: 1997.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: DEPARTAMENTO: BIOLOGIA MOLECULAR PROGRAMA DE DOCTORADO: BIOLOGIA MOLECULAR.

Resumen: La presente tesis realiza un análisis detallado de la función de los genes proneurales en la formación de los precursores del Sistema Nervioso Central, y su posible función en la especificación de la identidad de los precursores que determinan, encontrando evidencias de que dichos genes están implicados en la especificación de rasgos de la identidad de algún neuroblasto. También se ha realizado un análisis de la función del gen vnd observándose su requerimiento absoluto para la formación de los neuroblastos mediales. Además, se han obtenido evidencias de su posible implicación en la generación de la diversidad neural en el eje dorso-ventral, mediante el estudio de mutantes de falta de función, así como por medio de la expresión ectópica del gen vnd utilizando el sistema GAL4.

Autor: PERALES ECEIZA BEATRIZ.
Año: 1997.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: DEPARTAMENTO: BIOLOGIA MOLECULAR PROGRAMA DE DOCTORADO: BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR.

Resumen: Se ha reconstituído in vivo un sistema para la transcripción-replicación del virus de la gripe a partir de genes clonados. Este abordaje experimental permite la detección de todos los tipos de RNA del virus: mRNA cRNA y vRNA. Utilizando este sistema se ha demostrado que la subunidad PB2 de la RNA polimerasa del virus de la gripe se requiere para la replicación del RNA viral, tanto en el primer paso (síntesis de cRNA a partir de un vRNA molde) como en el segundo (síntesis de vRNA a partir de un cRNA molde). Se ha reconstituído un sistema in vitro que es capaz de generar cRNA y mRNA virales a partir de extractos nucleares de células transfectadas con los genes virales clonados. Al igual que en el sistema in vivo, en este sistema la subunidad PB2 es necesaria para la replicación del RNA viral. El análisis mutacional de la subunidad PB2 ha confirmado que el determinante principal de la NLS de PB2 se localiza en el extremo C-terminal de la proteína y que además se requieren otras secuencias internas para que tenga lugar un transporte eficiente. Además se ha definido la región N terminal de PB2 como necesaria y suficiente para la interacción con el complejo de la polimerasa. Algunas mutaciones en diversas posiciones de la molécula afectan a la localización nuclear de la proteína, otras alteran su interacción con el complejo transcripcional y otras inhiben su actividad biológica. De interés especial son los mutantes de inserción que muestran un fenotipo ts o son defectivos en actividad de unión a cap.

Autor: PERNAS OCHOA MONICA.
Año: 1997.
Universidad: POLITECNICA DE MADRID.
Centro de lectura: INGENIEROS AGRONOMOS.
Centro de realización: DEPARTAMENTO: BIOQUIMICA PROGRAMA DE DOCTORADO: BIOTECNOLOGIA AGRARIA Y FORESTAL.

Resumen: Se ha llevado a cabo la purificación y caracterización de un inhibidor de cisteín proteasas, CsC, de semilla de C. sativa. Se ha aislado su clón de cDNA a partir de una librería de semillas inmaduras de castaña. El inhibidor fué expresado en E. coli y purificado del extracto bacteriano. La identidad de la cistatina recombinante y la de semilla fue confirmada por analisis MALDI, electroforesis bidimensional y las secuencias amino terminales. La CsC tiene una masa molecular de 11275 Da y un pI de 6.9. Su consecuencia de aminoácidos incluye tres motivos conservados esenciales para la actividad inhibitoria y muestra una identidad de secuencia significativa con otras fitocistatinas. La CsC recombinante inhibe papaína (Ki:29nM), ficina (Ki: 65 nM), quimopapaína (Ki: 366nM) y catepsina B (Ki: 473nM). Al contrario de la mayoría de las cistatinas también se detectó actividad inhibitoria frente a tripsina (Ki:3489 nM). Los patrones de expresión de CsC durante el desarrollo de la semilla fueron diferentes a los de otras cistatinas. La CsC es efectiva frente a extractos de distintos ácaros e insectos.

Autor: PIRE GALIANA CARMEN LUCIA.
Año: 1997.
Universidad: ALICANTE.
Centro de lectura: CIENCIAS .
Centro de realización: DEPARTAMENTO: AGROQUIMICA Y BIOQUIMICA PROGRAMA DE DOCTORADO: BIOTECNOLOGIA .

Resumen: La glucosa deshidrogenasa de Haloferax mediterranei se ha purificado a homogeneidad. La estructura de la proteína es un dímero de 89 KDa. Presenta el óptimo de actividad enzimática en NaCl 1.75 M o en KCl 1.3 M. La enzima es relativamente estable a concentraciones bajas de sal, presentando un tiempo de vida media de 163 h. a 0.6 M de NaCl y 17 h. a 45 mM de NaCl. Las sales estabilizan la conformación activa de la proteína aumentando su termoestabilidad, siendo el incremento de entalpía y la energía de activación independientes de la concentración salina. La enzima presenta especificidad dual para el coenzima, aunque posee una afinidad muy superior por el NADP. Puede emplear como sustrato alternativo xilosa y presenta inhibición por exceso de sustrato a concentraciones de glucosa superiores a 0.2 M. Presenta un mecanismo secuencial ordenado de estado estacionario. Se produce activación de la enzima por cationes divalentes. La enzima contiene dos átomos de zinc por subunidad. Empleando como sonda el extremo N ter. se ha clonado y secuenciado un fragmento de 1.5 kb, que tras realizar comparaciones no parece formar parte del gen de la glucosa deshidrogenasa. Se postula que se trate de parte del gen de una molibdoproteína.

Autor: PLENGE TELLECHEA FERNANDO.
Año: 1997.
Universidad: MURCIA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: DEPARTAMENTO: BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR A PROGRAMA DE DOCTORADO: BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR .

Resumen: Esta Tesis Doctoral se plantea el estudio de las posibles analogías y diferencias fundacionales entre las ATPasas dependientes de calcio de retículo sarcoplasmatico (SERCA) y de membrana plasmática (PMCA), así como de obtener un conocimiento más profundo del efecto de ciertas toxinas y drogas sobre estos enzimas. Parte A) Estudios sobre la ATPasa tipo SERCA El compuesto ácido ciclopiazónico (CPA) es una toxina que inhibe de forma específica a estas ATPasas cuando se utiliza en cantidades equimolares con respecto al enzima. En esta Memoria se han estudiado los efectos funcionales de CPA sobre el sitio de fosforilación del enzima y la interacción CPA-enzima en relación con los estados conformacionales de la proteína dependientes de calcio. Parte B) Estudios sobre la ATPasa tipo PMCA. En estos estudios se ha utilizado el agonista adrenérgico tipo beta 2 ritodrina y los antidepresivos triciclicos. Los estudios se basan en el análisis del ciclo catalítico y de las etapas esenciales involucradas en la interacción de calcio, ATP y fosfato inorgánico con el enzima. Los resultados obtenidos en este trabajo confirman que las ATPasas de tipo SERCA y PMCA comparten las características básicas relacionadas con el proceso de trasduccion de energia, es decir, transporte de calcio e hidrólisis acoplada de ATP. La distinta sensibilidad frente a determinadas drogas y toxinas indica la existencia de aspectos diferenciadores que pueden estar relacionados con la capacidad de regulación.

Autor: POZO PEREZ DAVID.
Año: 1997.
Universidad: SEVILLA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: DEPARTAMENTO: BIOQUIMICA MEDICA Y BIOLOGIA MOLECULAR PROGRAMA DE DOCTORADO: BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR..

Resumen: Mediante RT-PCR se demuestra la expresión del ARNm para el gen del VIP en linfocitos peritoneales de rata, así como la coexpresión génica del receptor de VIP (VIP-R-1) y PACAP Tipo I (PACAP-R-I) en macrófagos peritoneales, mientras que el linfocito peritoneal expresa tan sólo el gen de VIP-R-1. Análisis funcionales demuestran un acoplamiento del receptor de PACAP-R-I al sistema de la PLC, mediante proteínas G insensibles a TxP. Se demuestra, así mismo, la regulación homóloga del sistema receptor-efector de VIP en macrófagos peritoneales de rata, así como se caracteriza enzimáticamente la estimulación por VIP de la enzima adenilil ciclasa. Por otra parte se pone de manifiesto la expresión de proteínas G del tipo alfa-s por inmunodetección y ADP-ribosilación por TxC. En relación al otro agente neuroinmunomodulador estudiado, la melatonina, se demuestra un efecto inhibidor sobre la NOS-I mediado por su interacción con la proteína calmodulina. Por otra parte, se caracteriza por primera vez, mediante RT-PCR, souther-homólogo, secuenciación e hibridación in situ la expresión del receptor Mella en sistema inmune de rata (CD4+, CD8+, DP, DN y Linfocitos B).