BIOQUIMICA MOLECULAR, 6

Autor: HERRERO SÁNCHEZ JAVIER.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIONES ONCOLÓGICAS.

Autor: OLIVEROS COLLAZOS JUAN CARLOS.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGÍA - CSIC.

Resumen: Gracias al desarrollo de la tecnología de DNA arrays es posible estudiar el comportamiento, a nivel transcripcional, de miles de genes en varias condiciones experimentales. Durante la última década, la información obtenida con esta tecnología ha permitido llevar a cabo un ingente esfuerzo en el estudio del control génico de los procesos celulares, con importantes repercusiones en investigación básica y biomédica. Dado el volumen y la complejidad de los datos obtenidos en los experimentos con DNA arrays, la gestión y el análisis de los resultados ha de realizarse con métodos computacionales específicos. En esta memoria se describe el desarrollo de tres sistemas informáticos asociados a la generación y el análisis de resultados de DNA arrays. AlmaZen es un sistema para la gestión de muestras biológicas que contempla la simulación de los protocolos de trabajo específicos de esta tecnología, particularmente en la fase de preparación de los DNA arrays. El sistema está basado en el desarrollo de una base de datos relacional y un conjunto de herramientas de acceso remoto capaces de simular los protocolos de trabajo de prácticamente cualquier laboratorio de DNA arrays. SimplyQuant es un programa completo para el análisis de imágenes complejas, generadas con un tipo concreto de DNA arrays (macroarrays). El programa incluye un robusto algoritmo para la detección y cuantificación de puntos muy próximos entre sí, consiguiendo un porcentaje muy alto de reproducibilidad en la cuantificación de los resultados. GEISHA es una plataforma computacional destinada a facilitar la anotación de la función de grupos de genes detectados en experimentos de expresión génica. Está basada en un conjunto de nuevos métodos estadísticos para la extracción automática de información a partir de textos científicos. En este nuevo área de aplicación ha resultado especialmente interesante la comparación simultánea de los procesos de agrupación de genes en función de la similitud de sus patrones de expresión y en función de la similitud de la información funcional extraída de textos científicos, un resultado cuya interpretación revela interesantes pautas del comportamiento de los procesos biológicos subyacentes. Gran parte del trabajo descrito en esta memoria se refiere a la evaluación de la capacidad de los sistemas y métodos desarrollados con datos de expresión génica procedentes de experimentos reales, que, en algunos casos, han sido obtenidos en colaboración directa con grupos experimentales. En particular, SimplyQuant ha sido utilizado para el análisis de datos procedentes de estudios de división celular en la bacteria Escherichia coli. Por su parte, GEISHA ha sido aplicado a datos de expresión génica enSaccharomyces cerevisiae, de los que se han obtenido, entre otros, interesantes resultados relacionados con la regulación transcripcional de la glucólisis y otros procesos fisiológicos. También se ha utilizado GEISHA en una combinación de estudios de expresión génica en E.coli gracias a los cuales se ha podido confirmar la relación que existe, a nivel transcripcional, entre genes relacionados con la movilidad celular y genes responsables de la detección de nutrientes en el medio. Finalmente se expone cómo se integran los sistemas desarrollados de la perspectiva general de la evolución de los sistemas bioinformáticos asociados a la tecnología de DNA arrays.

Autor: PÉREZ FERNÁNDEZ CORALIA.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CBM "SEVERO OCHOA"/UAM.

Resumen: El envejecimiento está asociado a estados de resistencia a la insulina tanto en roedores como en humanos. Los cambios asociados al incremento de la adiposidad y el peso corporal que se producen a lo largo de la vida pueden contribuir al desarrollo de este estado de resistencia a la hormona. En nuestro estudio hemos utilizado un modelo de envejecimiento que es la rata Wistar de 24 meses. En estos animales los niveles de glucosa e insulina permanecen normales durante toda la vida, sin embargo el porciento de grasa visceral se incrementa significativamente al igual que los niveles de leptina en sangre. Estos cambios son ya observados en los animales de 7-8 meses. Por otra parte, cuando los animales de 7-8 y 24 meses se someten a restricción calórica durante tres meses, estos parámetros disminuyen significativamente en ambos grupos. En este trabajo estudiamos la sensibilidad a la insulina en adipocitos procedentes de animales de 3, 7-8 y 24 meses de edad, la cual fue evaluada mediante la estimulación de la actividad MAPK y de la fosforilación de la GSK3beta. Los resultados muestran que los adipocitos aislados procedentes de animales de 7-8 y 24 meses de edad presentan una disminución de la respuesta a la insulina. Los experimentos realizados con vanadato (un agente insulinomimético) sugieren que la señal de la insulina es empeorada en un paso temprano de la cascada de señalización, probablemente a nivel de la autofosforilación del receptor de la insulina. La restricción calórica mejora la estimulación de la actividad MAPK por insulina, en ambos grupos de animales, siendo mayor esta mejora en los animales de 7-8 meses de edad. La restricción calórica no produce ningún cambio significativo sobre la estimulación de la fosforilación de la GSK3beta. Además los animales de 24 meses desarrollan resistencia central a la leptina, que se manifiesta por una disminución de la respuesta a la infusión intracerevroventricular de leptina, analizada mediante los cambios en el peso corporal y la ingesta. La leptina actuando centralmente modula la señal de la insulina en adipocitos, lo cual es observado por la disminución de la estimulación por insulina de la actividad MPAK y de la fosfosrilación de la GSK3beta en animales de 3 meses, mientras que las ratas de 24 meses no son sensibles a la infusión icv de leptina. Cuando estos animales son sometidos a restricción calórica se incrementa la sensibilidad a la insulina y la leptina infundida icv recupera la capacidad modular la estimulación de la MAPK. En adipocitos aislados, la preincubación con altas concentraciones de leptina empeora la señalización de la insulina, lo cual se manifiesta por los bajos valores de estimulación de la actividad MAPK, de la fosforilación de la GSK3beta y d ela autofosforilación del receptor de insulina. Este empeoramiento es paralelo al incremento de los niveles de la proteína SOCS3, la cual podría ser responsable de los efectos de la leptina. Nosotros postulamos que la resistencia a la insulina durante el envejecimiento es debida en parte a la acción de la leptina. En ratas con edad por debajo de los 8 meses, la leptina puede actuar a nivel central inhibiendo la acción de la insulina. Por el contrario en los animales de 24 meses de edad, que muestran resistencia a la leptina e hiperleptinemia, la leptina empeora la señalización de la insulina actuando directamente sobre el adipocito.

Autor: SEGURA PEREGRINA ROSA DE LIMA .
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: INSTITUTO DE CATÁLISIS Y PETROLEOQUÍMICA DEL C.S.I.C..

Resumen: Muchos extractos de lipasas pueden contener diferentes isoenzimas e incluso pueden estar contaminados por otras lipasas y esterasas. Por ello el estudio de procesos quirales catalizados por lipasas requiere una muy buena caracterización bioquímica de los extractos utilizados, para así poder seleccionar y purificar la enzima concreta que mejor se adapte a nuestras necesidades de estabilidad, actividad y selectividad. Por otro lado, el complejo mecanismo de acción de las lipasas aumenta las posibilidades de modular las propiedades catalíticas de estas enzimas (la actividad y sobre todo la selectividad) tanto en medios acuosos como en medios orgánicos. Así pues una buena caracterización bioquímica de los extractos comerciales y una buena ingeniería bioquímica de cada una de las enzimas purificadas e identificadas (pe., diseño de diferenetes derivados y diferentes condiciones de reacción) nos puede permitir mejorar muy notablemente el diseño de biotransformaciones enantioselectivas catalizadas por lipasas. A,- PURIFICACIÓN DE LIPASAS La purificación de enzimas industriales es siempre esencial para mejorar el diseño macroscópico de biocatalizadores enzimáticos. El uso de enzimas puras nos permite eliminar otras enzimas que podrían catalizar reacciones indeseables sobre nuestros substratos de interés (oxidaciones, hidrólisis indeseables, etc.) y lograr derivados inmovilizados con muy elevada carga enzimática. En este sentido, queremos resaltar como ejemplo paradigmático la lipasa de páncreas porcino que ha sido muy utilizada por químicos orgánicos para catalizar biotransformaciones muy interesantes sin someterla previamente a un proceso de purificación de las diferentes lipasas y esterasas posiblmente presentes en los extractos comerciales. En esta tesis hemos purificado tres enzimas con actividad lipásica de un extracto crudo de páncreas porcino: una nueva enzima de 25 kDa y pI 5.5; una lipasa de 33 kDa y la ya conocida PPL (lipasa de páncreas porcino). Así, la nueva lipasa de 25 kDa mostró las mejores propiedades (actividad y enantioselectividad) en la hidrólisis del (r,s)-butirato de glicidol. B,- MODULACIÓN DE PROPIEDADES POR INGENIERÍA DEL BIOCATALIZADOR El mecanismo de apertura y cierre delipasas puede modificarse profundamente cuando utilizamos diferentes protocolos de inmovilización. Si somos capaces de inducir cierta rigidez en regiones de la superficie de la enzima próxima al centro activo es muy posible que alteremos el mecanismo de apertura del centro activo de la lipasa y podamos así modificar sus propiedades de estabilidad, de actividad y sobre todo de selectividad. En esta tesis se han preparado diferentes derivados de una misma enzima que dependiendo de la estrategia de inmovilización empleada han mostrado enantioselectividad muy diferentes (desde E=10 hasta E=69). C,- MODULACIÓN DE LAS PROPIEDADES DE BIOCATALIZADORES DE LIPASAS MEDIANTE INGENIERÍA DE LA REACCIÓN Del mismo modo el mecanismo de apertura de la lipasa (que implica la exposición al medio de un gran bolsillo hidrofóbico) puede alterarse substancialmente y cuando utilizamos diferentes condiciones de reacción. En medio acuoso el pH, la temperatura y la presencia de co-disolvente orgánicos pueden modificar el mecanismo de apertura de las lipasas. En medio orgánico las variables clave podrían ser la polaridad del disolvente, la actividad termodinámica de agua y la temperatura.

Autor: CUBELOS ALVAREZ BEATRIZ .
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGÍA MOLECULAR "SEVERO OCHOA".

Resumen: Mediante el empleo de técnicas inmunohistoquímicas, se describe una nueva localización del transportador GLYT1 en las especializaciones sinápticas de las neuronas glutamatérgicas. Esta es una ubicación especialmente destacable con respecto al posible papel regulador de este transportador en la neurotransmisión mediada por el receptor de tipo NMDA. Además, se describe la interacción con proteínas con dominios PDZ que juegan un papel importante en la organización de la sinápsis glutamatérgicas.

Autor: CHINCHON GARCIA FRANCISCO JAVIER.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS .
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGÍA MOLECULAR (SEVERO OCHOA).

Resumen: En esta tesis se ha tratado de sentar bases de trabajo para la futura caracterización funcional y estructural de la chaperonina de la haloarquea H.mediterranei y su posible uso en nanotecnología. Para alcanzar estos objetivos se han clonado y secuenciado los genes codificantes para chaperoninas en H.mediterranei cpna, cpnb y cpnc), lo que ha permitido expresar estos genes en E.coli para su estudio de forma individual. La reconstrucción de la chaperonina a partir de las subunidades desnaturalizadas han permitido observar importantes diferencias en su comportamiento in vitro. Estas diferencias se basan en la capacidad de la subunidad CPNA de formar anillos y filamentos durante el proceso de aumento de la fuerza iónica, mientras que a través del mismo procesamiento CPNB no forma estructuras cuaternarias. La construcción de modelos tridimensionales por homología ha permitido localizar, a través del mapa de interacciones descritas a partir de la cristalización del termosoma, dos zonas con cambios aminoacídicos que pudieran ser significativos. También se ha realizado un estudio estructural durante la reconstitución a partir de la subunidad CPNA reconstituída. Estos estudios muestran dos grupos de chaperoninas, uno con siete subunidades por anillo y otro con ocho subunidades. Estudios sobre la chaperonina nativa han mostrado simetría ocho ya que esta partícula está formada por cantidades similares de CPNA y CPNB se ha sugerido que CPNB fuerza simetría ocho en la estructura nativa debido a interacciones más débiles entre ella misma y con las subunidades adyacentes en la formación del anillo.

Autor: JUSTO DÍAZ M. PILAR.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA (FUND. JIMENEZ DÍAZ).

Resumen: La muerte de células tubulares es el único parámetro histológico que se correlaciona con el grado de insuficiencia renal durante el fracaso renal agudo por necrosis tubular aguda. Además, la atrofía tubular de la insuficiencia renal crónica se debe a la muerte de las células tubulares. Sin embargo los mecanismos moleculares de la muerte del epitelio tubular renal son pocos conocidos. La comprensión de estos mecanismos puede llevar al diseño de nuevas estrategias terapéuticas en pacientes con insuficiencia renal, una situación clínica con enormes implicaciones económicas y sociales. Hemos profundizado en los mecanismos del efecto letal de factores patogénicos endógenos (citoquinas) y exógenos (nefrotóxicos: paracetamol y ciclosporina A). Ambos nefrotóxicos producen apoptosis en células del epitelio tubular renal. Hemos observado que el mecanismo de acción de estos nefrotóxicos es completamente diferente. La CsA produce daño mitocondrial dependiente de Bax y caspasa-2, y los inhibidores de caspasas aumentan la supervivencia celular a largo plazo. Sin embargo, el paracetamol induce lesión del retículo endoplásmico y la inhibición de caspasas evita la apoptosis pero no la muerte celular. En el transcurso de estudios del papel de FADD en la apoptosis por nefrotóxicos, observamos que la sobreexpresión de la proteína FADD producía apoptosis de células tubulares, pero contrariamente a lo esperado, la sobreexpresión de la FADD-DN (dominante negativo, carece del "death effector domain") también producía apoptosis en estas células. Además, abordamos el efecto de la citoquina letal Tweak y su receptor Fn 14 en el epitelio tubular renal. En presencia de un microambiente proinflamatorio, Tweak induce apoptosis dependiente de caspasas del epitelio tubular. Sin embargo, la inhibición de caspasas favorece la lesión oxidativa y la muerte necrótica de la célula. Esta información puede ser útil para diseñar abordajes terapéuticos de la muerte celular en patogenía renal.

Autor: TEJERA ALVAREZ PAULA.
Año: 2003.
Universidad: LA LAGUNA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA .
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGÍA.

Autor: LUCENA SOTO JOSÉ MANUEL.
Año: 2003.
Universidad: SEVILLA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA .
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGÍA.

Resumen: Las cianobacterias son procariotas fotosintéticos que presentan la peculiaridad de tener un ciclo de Krebs incompleto, al carecer de la 2-oxoglutarato deshidrogenasa. Como consecuencia, dicho ciclo se divide en dos ramas aparentemente inconexas. No obstante, es posible que existan rutas alternativas que puedan soslayar la ausencia de la 2-oxoglutarato deshidrogenasa y, de esta forma, cerrar el cliclo de Krebs. Una de estas vías es la llamada ruta del y-aminobutirato (GABA), que transforma glutamato en succinato y que incluye tres enzimas: glutamato descarboxilasa, GABA transaminasa y succinato semialdehido deshidrogenasa. Para conectar esta ruta con el ciclo de Krebs, el 2-oxoglutarato debe convertirse en glutamato. Este paso, asociado al metabolismo del nitrógeno, es un proceso bien estudiado en cianobacterias donde corre a cargo del ciclo GS/GOGAT, bien sólo o con el auxilio de la glutamato deshidrogenasa. Los objetivos de esta tesis han sido tanto dilucidar la existencia de la ruta del GABA en la cianobacteria heterotrófica facultativa Synechocystis sp. PCC 6803, como determinar la función fisiológica de la glutamato deshidrogenasa. De los estudios realizados se han obtenido los siguientes resulados: La NADP-glutamato deshidrogenasa tiene una función preferencial en la asimilación de nitrógeno en las fases inicial y tardía de crecimiento de los cultivos. También se ha observado que la luz no es, per se, el factor que provoca el aumento de expresión del gen gdhA en la fase tardía de crecimiento. Se ha confirmado la presencia de las actividades glutamato descarboxilasa y succinato semialdehido deshidrogenasa en extractos de Synechocystis, si bien no se ha encontrado actividad GABA transaminasa. Como consecuencia puede excluirse la presencia de una ruta del GABA convencional que permitiese cerrar el ciclo de Krebs en esta cianobacteria. La clonación del gen estructural de la glutamato descarboxilasa, gadA, ha permitido su sobreexpresión en Escherichia coli y la posterior purificación de la enzima a homogeneidad. De su carcterización físico-química se deduce que pertenece a la familia de las glutamato descarboxilasas bacterianas, así como la presencia de fosfato de piridoxal como cofactor, siendo necesario tanto para su actividad como para mantener la conformación nativa. Se ha clonado, igualmente, el gen gabD, que codifica la succinato semialdehido deshidrogenasa de Synechocystis. Ambas enzimas no son esenciales para Synechocystis, ya que los respectivos mutantes carentes de actividad son viables. Cabe destacar, por último, que el mutante carente de actividad glutamato descarboxilasa presenta un menor crecimiento en condiciones fotoheterotróficas, así como que se ha observado que una parte importante del glutamato se metaboliza a través de dicha enzima.

Autor: GONZÁLEZ GALVEZ BEATRIZ.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS .
Centro de realización: AUTONOMA DE MADRID.

Resumen: Las MMPs juegan un papel muy importante durante la migración celular y la remodelación de la matriz extracelular. En este trabajo, hemos utilizado un modelo in vitro de migración celular así como generado anticuerpos contra el dominio catalítico de MT1-MMP para caracterizar el papel de esta metaloproteasas durante la migración de las células endoteliales. La migración es capaz de inducir la expresión y la actividad de MT1-MMP así como de relocalizar la proteína a estructuras mótiles. Además, los anticuerpos bloquean la migración, invasión y formación de tubos capilares de células endoteliales demostrando el papel que MT1-MMP desempeña durante estos procesos. También estudiamos como las distintas matrices extracelulares pueden regular a MT1-MMP. Así demostramos que MT1-MMP se relocaliza a las zonas de contacto de células endoteliales sobre matrices tipo colágeno tipo 1, fibronectina, ó fibrinógeno. En esta nueva localización, MT1-MMP es incapaz de internalizarse y su actividad esta impedidad de modo dependiente de la activación de RhoA por estas matrices. Además vemos que MT1-MMP se internaliza en células endoteliales mayoritariamente por la vía de las caveolae y que este tráfico se requiere para su correcta localización en estructuras mótiles, para su actividad degradativa así como para sus funciones en migración y en formación de tubos. Finalmente, hemos demostrado como MT1-MMP esta implicado en la angiogenesis inducida por quimioquinas como CCL2 ó CXCL8. Así, la ausencia de MT1-MMP en ratones deficientes impedía la formación de nuevos tubos inducida por CCL2 ó CXCL8. Estas quimioquinas además son capaces de inducir la actividad y el agrupamiento de MT1-MMP de modo dependiente de la polimorización de actina así como de la activación de Rac y P!3K. Por tanto, este trabajo resume el papel que MT1-MMP desempeña en las células endoteliales durante procesos angiogénicos.

Autor: GÓMEZ MATALLANAS DAVID.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: La familia Ras GTPasas incluye las isoformas H-Ras, K-Ras y N-Ras. A pesar de sus grandes similaridades bioquímicas y biológicas, en los últimos años se han acumulado un gran número de evidencias que apuntan a que estas proteínas no son funcionalmente redundantes. Una de las estrategias más extendidas para esta familia de GTPasas es la utilización de los mutantes dominantes inhibitorios de Ras, que son capaces de bloquear específicamente la activación de sus respectivas proteínas salvajes. Así, H-Ras N17 ha demostrado ser un reactivo extremadamente útil para estudiar las funciones de Ras. A pesar de lo extendido de su utilización, hasta la fecha no se ha realizado ningún estudio comparativo de las especificidades inhibitorias los mutantes H-Ras N17, K-Ras N17 y N-Ras N17. En este trabajo demostramos que los mutantes H-, K- y N-Ras N17 presentan marcadas diferencias en sus especificidades inhibitorias con respecto a H-, K- y N-Ras. H-Ras N17 es capaz de inhibir la activación de las tres isoformas de Ras. K-Ras N17 inhibe completamente la activación de K-Ras y ligeramente la de H-Ras. N-Ras N17 inhibe principalmente a N-Ras. A la luz de descubrimientos recientes, que apuntan a que las proteínas H-Ras y K-Ras están compartimentalizadas en distintos microdominios membrana plasmática, hemos realizado el primer estudio de la microlocalización celular de N-Ras.En conjunto, nuestros resultados indican que la especificidad inhibitoria de los mutantes Ras N17, está relacionado con la localización de las distintas isoformas de Ras en diferentes microdominios de membrana.

Autor: SÁNCHEZ RODRÍGUEZ M. ROSARIO.
Año: 2003.
Universidad: SEVILLA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: INSTITUTO DE BIOQUÍMICA VEGETAL Y FOTOSÍNTESIS.

Resumen: El objetivo de este proyecto de Tesis ha sido profundizar en el estudio de la implicación de la fosfoenolpiruvato carboxilasa (PEPC) en la respuesta a estreses abióticos en plantas. Para ello, se han estudiado los efectos de diversos estreses abióticos (sequía, salinidad, frío y anaerobiosis) sobre la expresión de PEPC en plántulas de trigo, como ejemplo de planta monocotiledónea. También se ha trabajado con una planta dicotiledónea como es Arabidopsis thaliana, en primer lugar caracterizando la familia génicade PEPC de dicha planta y posteriorment analizando el efecto de la salinidad y la sequía sobre la expresión de los distintos miembros de esta familia génica. Así, mismo, se ha estudiado el posible control hormonal de la implicación de la PEPC en al respuesta a condiciones de estrés abiótico. Finalmente, se han caracterizado las distintas isoformas de PEPC de Arabidopsis thaliana en cuanto a sus propiedades inmunológicas, cinéticas y de regulación postraduccional por fosforilación y efectores metabólicos.

Autor: NAJIB SOUAD.
Año: 2003.
Universidad: SEVILLA .
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Autor: LEÓN BLANCO M. MERCEDES.
Año: 2003.
Universidad: SEVILLA.
Centro de lectura: MEDICINA .
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Autor: GOMEZ GAVIRO M. VICTORIA.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: Nuestro grupo ha descrito que algunos antiinflamatorios no esteroideos (AINEs) pueden inducir el corte y liberación de la selectina- L en PMN neutrófilos a través de un mecanismo aún no completamente aclarado pero aparentemetne independiente de la activación celular. En el presente estudio analizamos difrentes efectos biológicos de estos fármacos que pueden explicar su capacidad de liberar la selectina-L. Los AINEs producen una reducción variable en la concentración de ATP intracelular en los PMN neutrófilos que se correlaciona con su capacidad de liberar la selectina-L. Estos resultados sugieren que nos niveles de ATP deben desepeñar un papel relevante en la regulación del nivel de expresión de la selectina-L, al menos en parte, debido a su capacidad para disminuir el estado energético celular. Además, hemos identificado a la difenilamina como la estructura química común en la que reside la capacidad de los AINEs de inducir el corte de la selectina -L a través de un mecanismo independiente de prostaglandinas y probablemente asociado a la regulación del ATP intracelular. Los AINEs basados en la difenilamina no fueron capaces de inducir la pérdida de la selectina-L en células DRM-/-, una línea monocítica de ratón deficiente en el enzima conversora del TNF-alfa o TACE, lo que indica que esta metaloproteasa participa en el corte de la selectina-L inducido por AINEs en PMn neutrófilos. El conocimiento de estos nuevos mecanismos de acción de los AINEs pueden ayudar al desarrollo de fármacos antiinflamatorios basados en su capacidad de bloquear la función de la selectina-L y que carezcan de los efectos secundarios derivados de la inhibición sistémica de la síntesis de prostaglandinas.

Autor: HERRANZ BARRANCO RAUL.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: DPTO. BIOQUIMICA (FAC. DE MEDICINA UAM).

Resumen: En esta era genómica disponemos de una cantidad ingente de información y a pesar de las iniciativas de anotación automatizada, es necesaria la intervención directa de los bioquímicos para decidir cual es el verdadero contenido de los genomas secuenciados. En esta memoria presento el trabajo que he realizado en nuestro laboratorio con los genes del complejo Troponina en insectos. Hemos conseguido establecer definitivamente cuál es el número total de genes que codifican la Troponina C, y el de isoformas de procesamiento alternativo presentes en los genes de la Troponina T y la Troponina I. Se ha establecido el patrón de expresión de este repertorio de isoformas y su utilización diferencial en los diferentes tipos musculares de los insectos estudiados. El análisis evolutivo que hemos realizado no sólo nos ha permitido localizar nuevos elementos de los genes ya descritos por comparación, sino que nos ha permitido reconstruir la historia evolutiva de estos genes y describir así una variedad de "soluciones evolutivas" muy diversas para cada tipo de gen y organismo. Merece interés el hecho de que aunque el camino evolutivo seguido por algunos genes en distintas especies ha sido diferente, el resultado final ha sido convergente, hasta el punto de que un repertorio similar de isoformas se puede encontrar en todos los insectos investigados. Los músculos indirectos de vuelo han sido especialmente considerados dadas sus especiales características, su asincronía producida por el fenómeno de activación por estiramiento. Algunos de los nuevos genes e isoformas descritas estar implicados en este mecanismo, que curiosamente ha evolucionado independientemente en distintos tipos de insectos. Combinando los dos tipos de abordaje utlizados, es decir, la coexpresión de isoformas en diferentes tejidos musculares de los insectos, y la coevolución de las secuencias implicadas en esas isoformas, hemos podido construir un modelo que explica el papel que puede tener toda la variabilidad genética descrita, en el contexto funcional de la regulación de la contracción muscular por el filamento fino en Drosophila. Como Anexo a este trabajo experimental, se han adjuntado los resultados preliminares obtenidos en una línea de investigación en Biología Espacial que pretende establecer la respuesta de Drosophila a la microgravedad en los entornos de la nave Soyuz y la Estación Espacial Internacional, para los que hemos puesto a punto una unidad de cultivo automatizada de Drosophila y nuevos protocolos de fijación.

Autor: GALAZ LEIVA SERGIO.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID.

Resumen: En este trabajo se han estudiado los efectos sobre la morfología y la adhesión celular de queratinocitos murinos en cultivo tras ser sometidos a tratamientos fotodinámicos, utilizando como fotosensibilizador (FS) la ftalocianina de Zinc (ZnPc). La ZnPc es un FS de segunda generación, actualmente en fase II de experimentación clínica, que ha demostrado ser un excelente compuesto para la fotoquimioterapia. Sin embargo, los mecanismos por los cuales actúa dicho FS e induce la destrucción tumoral no están bien entendidos. Como modelo para este estudio in vitro se han empleado queratinocitos de ratón Pam-212, ya sea expresando resistencia a neomicina, (Pam-Neo) o sobre-expresenado el oncogen ras (V12H-Ras; Pam-Ras), a los cuales se aplicaron tratamientos con ZnPc y luz roja en dosis letales (DL100) o subletales (DL50-60). Los resultados muestran que la viabilidad celular de Pam-neo y Pam-Ras no se ve afectada significativamente cuando son incubadas con ZnPc en ausencia de luz en cualquiera de las concentraciones utilizadas (2,5 x 10-7; 10-6; 2,5 x 10-6 M) y tiempos cortos (2h) pero sí a concentraciones altas (5 x 10-6M) y tiempos largos (18h). La viabilidad celular determinada en Pam-Neo y Pam-Ras mediante el ensayo del MTT, tras ser sometidas al tratamiento con elevadas concentraciones de ZnPc (5 x 10-6 M) y tiempos largos de irradiación con luz roja (15 minutos), provocaron la inactivación completa de ambos tipos celulares. Los cambios morfológicos observados en los cultivos analizados mediante tinción con azul de toluidina después de aplicar la dosis letal (DL100) fueron semejantes en los dos tipos celulares, pero notablemente diferentes a los encontrados con las dosis subletales, siendo especialmente notales a 24 y 48 h. El análisis morfológico nuclear con Hoechst 33258, así como los resultados obtenidos por electroforesis de ADN, muestran que la muerte tras el tratamiento letal es por necrosis, mientras que después de un tratamiento subletal (2,5 x 10-7 M d eZnPc y 4 minutos de luz), el tipo de muerte es predominantemente por apoptosis, siendo mayor el número de células en esta situación en Pam-Neo presenta el patrón típico de apoptosis 48h después del tratamiento, mientras que Pam-Ras no lo presenta, en ninguno de los tiempos analizados. Estos datos fueron corroborados por el ensayo TUNEL. Por otro lado, el análisis de las proteínas involucradas en la muerte celular por apoptosis, muestra un comportamiento diferencial entre ambos tipos celulares. Mientras que en Pam-Neo, p53 comienza a expresarse pronto (1-3h) después del tratamiento, manteniéndose hasta 24 h y decayendo a 48h en Pam-Ras no se expresa hasta las 6-18 h. La expresión de procaspasa 3 aparece sin variaciones hasta las 18 h en Pam-Neo, tiempo a partir del lcual comienza una disminución de ésta, mientras que en Pam-Ras ocurre a las 24h. Por su parte, PARP se detecta intacta en células control, pero en las tratadas a partir de 6 h, se observa un incremento de la expresión de esta enzima en 90 kDa, que podría corresponder al fragmento principal producto de su rotura por las caspasas. Estos resultados se correlacionan razonablemente bien con los obtenidos de los análisis de proteínas de adhesión. Así, las proteínas del complejo cadherina E/beta catenina, estudiadas separadamente por microscopía de fluorescencia, muestran una disminución gradual de su inmunoexpresión a medida que transcurre el tiempo después del tratamiento fotodinámico, siendo más llamativa a 24-48h. Es interesante destacar que el análisis de la inmunofluorescencia cadherina E, demuestra una pérdida gradual de su expresión, de forma secuencial, comenzando en la región media d elas células y apareciendo posteriormente dicha reducción a nivel apical y basal. Esta observación es más llamativa en Pam-Neo que en Pam-Ras, indicado que probablemente Pam-Ras se afecta menos que Pam-Neo en sus complejos de adhesión célula-células. Estos resultados se correlacionan con los obtenidos en electroforesis de proteínas y Western blots, los cuales además revelaron una malyor expresión de integrina beta1 en tiempos cortos después del tratamiento en Pam-Ras que en Pam-Neo. Asimismo, el citoesqueleto de actina se ve afectado por la TFD, produciéndose una desorganización de éste tras el tratamiento. Debido a que la TFD es una modalidad terapéutica relativamente nueva que actualmente se aplica en varios países para el tratamiento de algunas neoplasias y otras enfermedades, pero que aún no están bien aclarados los procesos celulares por los cuales efectúa su acción, los resultados mostrados en este trabajo pueden ser de utilidad para la caracterización y mejor comprensión de los mecanismos involucrados en la foto-quimioterapia.

Autor: DÍAZ FLORES ERNESTO.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO NACIONAL BIOTECNOLOGÍA.

Resumen: La homeostasis inmunológica es un proceso que debe estar finamente regulado. Los linfocitos T de la sangre son los responsables de defender al organismo frente a agresiones externas asi como de tumores, pero también pueden llegar a alterar su función y derivar en procesos tumorales dando leucemias, linfomas y otros estados patológicos. Por ello es importante conocer qué señales median los procesos de activación y proliferacion linfocitarios a modo de poder controlarlos de manera específica en caso de alteraciones. El segundo mesajero lipídico diacilglicerol así como sus principales receptores moleculares, las proteínas quinasas C han demostrado ser muy importantes en todos los procesos celulares, siendo claves para transmitir la señal desde los receptores en superficie hasta el núcleo generando las distintas respuestas celulares. La función, distribución y mecanismos de activación es específica para cada isoforma de PKC y viene determinado por sus dominios reguladores, que en el caso de las nuevas, que aquí nos ocupan, es el que une diacilglicerol. En el caso de la activación linfocitica, la isoforma 0 de las PKCs se ha visto implicada en mediar las señales generadas tras unión del receptor especifico de celulas T al antígeno. Nuestros resultados demuestran que el mecanismo de activación de esta isoforma es diferente al descrito para las demas PCKs implicando la fosoforilación en un residuo de tirosina mediado por la tirosina quinasa Lck y la unión del diacilglicerol generado por la fosfolipasa C-gamma (PLC-gamma). La confluencia de ambas señales permite que la proteína se asocie a la sinapsis que se forma en el punto de contacto del linfocito con la celula presentadora de antigeno, que es donde se inicia la respuesta temprana del linfocito. Además de en activación, también se puede observar la activación de isoformas de PKCs en el proceso de proliferación linfocitaria. Nuestros resultados demuestran que tres isoformas estan implicadas en dicho proceso. La isoforma * está claramente activada durante la proliferación inducida por la interleuquina-2, sin embargo, no es imprescindible para dicha función. Por otro lado, las isoformas * y * son necesarias para que la proliferación tenga lugar en linfocitos y son capaces de mantener niveles altos de proliferación en ausencia de IL-2 cuando las células son tratadas con esteres de forbol. Estos resultados apoyan la idea de que las PKCs son proteinas cuya función es crucial para el correcto funcionamiento de la homeostasis inmunológica. Finalmente, analizamos la contribución de las quimerinas, proteinas que al igual que las PKCs, son capaces de unir diacilglicerol, en estos procesos, observamos que son necesarias para el reordenamiento del citoesqueleto celular, y este reordenamiento es importante en todos los procesos celulares de las células T tales como migración, activación, secreción, …

Autor: JIMÉNEZ LOZANO NATALIA.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS DE LA UAM.

Resumen: La microscopía electrónica junto con las técnicas de reconstrucción ha emergido en los últimos años como una poderosa metodología dentro del campo de la determinación de estructuras macromoléculas biológicas. Los microscopistas son conscientes de los potenciales de esta técnica que no sólo permite la elucidación de grandes complejos macromoleculares que son difíciles de estudiar mediante las técnicas de alta resolución, sino también la observación de cambios conformacionales sutiles que se dan frecuentemente en las macromoléculas cuando llevan a cabo sus funciones biológicas y cuando se unen a diferentes sustratos. La ausencia de conclusiones estructurales obtenidas mediante la comparación de conjuntos de datos numerosos y diversos resueltos mediante 3D-EM, nos animó a desarrollar y aplicar algunas herramientas. Como consecuencia se creó la base de datos FEMME para sentar las bases metodológicas e infraestructurales que permitieran un análisis exhaustivo de los volúmenes de 3D-EM indpendientemente de la resolución alcanzada en cada estudio. La base de datos FEMME almacena información geométrica y topológica extraída a partir de los volúmenes 3D-EM mediante una serie de herramientas basadas en aplicaciones previas de la teoría de alfa-formas al análisis de las coordenadas atómicas. Los datos procesados siguiendo esta metodología se han almacenado en la base de datos FEMME. El tipo de información estructural almacenada para cada entrada de FEMME está referida a canales, cavidades (cavidades internas -huevos- o cavidades externas -o bolsillos-), superfice y topología de las macromoléculas. Estas propiedades estructurales pueden ser extraídas fácilmente a partir de la representación en alfa-formas de la macromoléculas. La superficie y la topología son inherentes a la representación en alfa-formas. Para la detección y extracción de cavidades externas y canales, se aplicaron métodos basados en la teoría de flujo. Se aplicó un análisis del espacio complementario en el caso de cavidades internas. El método analítico denominado inclusión-exclusión se utilizó para calcular el volumen de las cavidades/canales a partir de la definición de alfa-formas. Actualmente FEMME es la única base de datos que almacena alfa-formas de complejos macromoleculares junto con toda la información que se puede derivar de este tipo de representación. Así, cada entrada de la base de datos es un fichero XML donde se puede encontrar una descripción de la superficie y la topología de la maromolécula en términos de su representación en alfa-formas. Además, se puede encontrar también información detallada sobre el número y tipo de propiedades estructurales contenidas en la macromolécula junto con sus características (como volumen, esqueleto o número de bocas). La creación de la base de datos FEMME ha permitido probar el buen funcionamiento de un método de búsqueda por contenido basado en la utilización de imágenes de revolución. Se han llevado a cabo estudios comparativos sobre conjuntos de datos utilizando la representación en alfa-formas. Este es el caso del estudio de las relaciones existentes entre un conjunto de propiedades estructurales procedentes de macromoléculas que interaccionan con el DNA. Además en este estudio se ha demostrado que la representación en alfa-formas es adecuada para la extracción y descripción de las propiedades estructurales existentes en los ribosomas tanto eucariotas como procariotas.

Autor: CASTRO BLANCO SUSANA.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA (UAM).

Resumen: Los procesos hipóxicos se definen como aquellas situaciones que cursan con un aporte deficiente de oxígeno (O2) a un tejido, órgano o sistema. En el caso concreto de hipoxia hipobárica es la disminución en la presión total atmosférica quien desencadena una disminución en la concentración celular de O2. Ante estas situaciones deficitarias de O2 se desencadenan una serie de mecanismo compensatorios biológicos para garantizar un correcto aporte de este gas, y entre ellos destaca el fenómeno de vasodilatación. El óxido nítrico (NO) es una molécula gaseosa con multiples funciones biológicas en el sistema nervioso central, entre las que destacan su actuación como neurotransmisor atípico y segundo mensajero intracelular que interviene entre otros en procesos de vasorelajación, en fenómenos de neuroplasticidad neuronal o en la inhibición de la agregación plaquetaria, fenómenos por los cuales el NO ha sido implicado en procesos de neuroprotección ante daños del tipo hipóxico. Sin embargo, ante un exceso de su producción, el NO puede interaccionar con especies reactivas derivadas del O2 para formar peroxintrito (ONOO-), molécula con gran capacidad oxidante y que puede producir daños en el ADN, fenómenos de lipoperoxidación lipídica o de nitración proteica, alteraciones por las que se implica al NO en los procesos de neurotoxicidad. Entre los múltiples sistemas diana de la acción del sistema del NO cabe mencionar a las metaloproteinasas de matriz (MMPs) que se definen como una familia de endoproteasas implicadas en la degradación de los componentes de la matriz extracelular y que por tanto, se relacionan no solo con fenómenos de remodelación vascular (formación de edema y angiogénesis) sino también en los de remodelación neuronal. Nuestro estudio experimental englobó el uso de una cámara hipobárica en la que ratas albino wistar fueron sometidas a una presión atmosférica equivalente a 38.000 pies durante 30 minutos, seguidas de un periodo de reoxigenación en condiciones normobáricas en el cual se procedió a su sacrificio a las 0 y 24 horas, así como a los 5,8,15 y 30 días de reoxigenación. Las observaciones derivadas de este estudio se pueden englobar como sigue: 1,- Nuestro modelo de hipoxia hipobárica aguda produjo un incremento en la expresión y actividad de la isoforma neuronal en la corteza cerebral de los animales experimentales, seguido del consecuente incremento en las proteínas nitradas en residuos tirosina. 2,- El cerebelo de estos mismos animales no mostró tales cambios, confirmando la distinta susceptibilidad regional existente en condiciones de bajas presiones parciales de O2. 3,- No se encontró expresión de la isoforma incudible de la NOS, sugiriendo que la cantidad de NO sintetizado por la isoforma neuronal es suficiente para garantizar sus funciones biológicas celulares. 4,- Los efectos neurotóxicos de la nitración proteica se comprobaron mediante la relación de esta y la expresión de la MMP-9. 5,- Todas las alteraciones observadas en los animales experimentales han de ser transitorias en el tiempo, en vista de su recuperación hasta valores similares a controles, tras 30 días de reoxigenación. 6,- No se encontraron mecanismos de angiogénesis, confirmando la aparición de este mecanismo compensatorio del fujo sanguíneo vascular solo antes estímulos hipobáricos crónicos.