BIOQUIMICA MOLECULAR, 7

Autor: PEINADO SELGAS HECTOR.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: El factor de transcripción Snail se ha caracterizado recientemente como un represor directo de la expresión de cadherina E en tejidos epiteliales estando implicado en la adquisición de un fenotipo mesenquimático e invasivo tras su sobreexpresión. Igualmente estudios durante el desarrollo embrionario han confirmado que la expresión de este factor de transcripción es esencial en el control de los procesos de transición epitelio mesénquima (TEM) que se produce en el desarrollo embrionario temprano. En nuestro laboratorio se ha analizado el papel de Sanil en la represión de la adherina E en diversos modelos celulares; sin embargo se desconocen todavía en gran medida las señales que controlan su expresión, así como del mecanismo de represión de cadherina E y su implicación en la tumorogénesis. Durante el desarrollo de esta tesis hemos determinado que el factor de transcripción Snail se encuentra regulado por diversas señales, que también se han visto implicadas en el control de las TEMs durante el desarrollo y la tumorogénesis, como son el TGFbeta1 y el FGF-2, indicando que las señales que regulan ambos procesos podrían ser las mismas. De igual modo, hemos determinado el mecanismo por el cual Snail reprime la expresión de cadhereina E en diversas líneas celulares. Este mecanismo de represión es dependiente del reclutamiento de complejos de represión, en los que participan el corepresor mSin3a y las histonas deacetilasas 1/2, implicados en la modificación y compactación de la estructura cromatínica. Por último, hemos analizado la implicación de Snail en la tumorogénesis y fenómenos asociados como la invasión celular y angiogénesis. El análisis de los transfectantes estables de Snail en cultivos tridimensionales in vitro e in vivo ha demostrado una correlación directa entre la expresión de Snail y la adquisición se encuentra implicado en los fenómenos de invasión local y en la progresión tumoral. En su conjunto, los resultados presentados en esta tesis han permitido avanzar en el conocimiento de los mecanismos de actuación y control de Snail, así como en el entendimiento de su implicación en la tumorogénesis.

Autor: MERCADER HUBER NADIA.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO NACIONAL BIOTECNOLOGÍA.

Resumen: En la presente tesis doctoral se describe la función de los factores de transcripción Meis durante el desarrollo de las extremidades en vertebrados. En vertebrados, la extremidad emerge como una pequeña protrusión de células mesenquimales derivadas del mesodermo lateral cubierta por una capa ectodérmica. En la parte más apical de la extremidad, se aprecia un engrosamiento del ectodermo que se denomina cresta apical (AER). El AERE constituye un importante organizador que controla el crecimiento de la extremidad y la especificación de elementos a lo largo del eje proximodistal (PD). Durante las siguientes fases del desarrollo, el primordio de pata va creciendo y se empiezan a formar condensaciones cartilaginosas que luego darán lugar al esqueleto de la extremidad. Las primeras estructuras que se forman son las cercanas al tronco o proximales, de esta manera se produce una generación de elementos cada vez más distales. El brazo, denomindado estilopodio, es la primera estructura que se diferencia; a este le sigue el antebrazo, o zeugopodio, y por último se forman los carpales y falanges de la mano, también llamado autopodio. Los genes Meis codifican factores de transcripción homeobox TALE. En Drosophila, su homólogo homothorax está implicado en la especificación de las regiones proximales de la extremidad y su expresión es incompatibles con la formación correcta de los segmentos distales. Hemos estudiado el patrón de expresión de los genes Meis durante el desarrollo de las extremidades en vertebrados. Meis1 y Meis2 se expresan en la parte proximal del primordio de la extremidad que va a dar lugar al brazo/pierna (estilopodio). Para estudiar el papel que Meis desempeña durante el desarrollo de la extremidad se llevó a cabo un ensayo de sobreexpresión de Meis, para ello utilizamos un retrovirus aviar e infectamos embriones de pollo en la región presuntiva de ala y pata. Observamos que la sobreexpresión de Meis es incompatible con la formación correcta de la parte distal de las extremidades sinv erse afectado el desarrollo del estilopodio. Meis ectópico impide una correcta especificación de las unidades proximodistales del a extremidad promoviendo la proximalización de estructuras distales. Proponemos una conservación evolutiva en el papel de los genes Meis durante el establecimiento del eje PD de las extremidades. Tanto su patrón como su función presentan una alta homología entre artrópodos (Drosophila melanogaster) y vertebrados (pollo y ratón). En los dos casos, genes implicados en la especificación del tronco pudieran haber sido reutilizados a lo largo de la evolución para dar lugar a la generación de ejes secundarios tales como las extremidades. Estudiamos la regulación de los genes Meis durante el desarrollo de las extremidades. La expresión está controlada por señales activadoras provientes del tronco y señales inhibidoras de la cresta apical del primordio. El derivado de la vitamina A, ácido retinoico (AR), se sintetiza en el tronco embrionario. La retinal. Bolas impregnadas con AR implantadas en la parte distal del primordio de pata son capaces de inducir expresión ectópica de Meis1 y Meis2. Implantación de bolas impregnadas con Factor fibroblástico 8 (FGF8) o bolas impregnadas con inhibidor del receptor de FGE mostraron que en la parte distal de la pata. FGF8 neutraliza la actividad de AR a dos niveles, por un lado impide su síntesis y por otro inhibe la expresión de genes diana de AR. Concluimos que AR activa la expresión de Meis en el primordio de pata y FGF contrarresta la actividad de AR restringiendo la expresión de Meis a la parte proximal. La división de la pata en desarrollo en una región proximal de actividad AR/Meis y un dominio distal, en el cual la señalización AR/Meis es inhibida, es de primordial importancia para el desarrollo correcto de los elementos proximodistales de la pata. Por último se estudió el papel de Meis en la regeneración de las extremidades del axolote. AR es capaz de cambiar la información posicional de células de blastema. En presencia de AR, una pata amputada a la altura de la muñeca, no sólo regenera la mano sino que forma una pata completa a partir del nivel de corte. Exte experimento sugiere que las células del blastema distal habían adquirido un cambio en la información posicional de distal a proximal. Basándonos en nuestros resultados anteriores, que sugieren la capacidad de AR y Meis de proximalizar la identidad celular durante el desarrollo de las extremidades en pollo, nos dispusimos a estudiar el papel de Meis como mediador del efecto proximalizante de AR en la regeneración de la extremidad del axolote. Nuestros datos sugieren una función de Meis bajo la vía de señalización de AR durante la regeneración de la extremidad en urodelos.

Autor: SANTAMARÍA NÚÑEZ GEMA.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: C. BIOLOGÍA MOLECULAR "SEVERO OCHOA".

Resumen: El complejo de la H+-ATP sintasa mitocondrial es necesario para la provisión de energía celular y para la ejecución eficiente del programa apoptótico. En esta tesis hemos estudiado tres temas relacionados con: 1,- La expresión de la subunidad beta de la H+-ATP sintasa en cáncer. 2,- El papel de la H+-ATP sintasa en muerte celular. 3,- La regulación de la expresión de la H+-ATP sintasa en células de mamífero. El análisis de los niveles de expresión de beta-F1-ATPasa en biopsias normales y tumorales de pacientes con cáncer de colon y de estómago sugiere que la competencia bioenergética de las mitocondrias de los tejidos tumorales se encuentra afectada. Estos resultados apoyan la hipótesis que Otto Warburg propuso a principios del siglo pasado según la cual esta alteración de la funcionalidad mitocondrial debe estar involucrada en la resistencia que estas células tumorales presentan frente a diversos estímulos apoptóticos. Hemos utilizado estaurosporina para inducir muerte celular programada en tres líneas celulares de hígao de rata (C9, FAO y As30D) que presenta una diferente dependiente de fosforilación oxidativa para la obtención de su energía metabólica (FAO mayor C9 mayor As30D). La estaurosporina induce apoptosis a través de mecanismos tanto dependientes como independientes de caspasas en las líneas celulares C9 y FAO. La línea celular As30D es resistente a la apoptosis inducida por esta droga. La oligomicina, un inhibidior específico de la H+ -ATP sintasa previene la muerte celular en células C9 y FAO sugiriendo que la actividad de este complejo es importante para la ejecución de la apoptosis. Sin embargo, la oligomicina no previene el rápido hinchamiento mitocondrial ni la liberación de componentes pro-apoptóticos de la mitocondria. Por otro lado, la estaurosporina induce la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS). En estas condiciones se detecta la modificación covalente de proteínas mitocondriales como AIF y Endo G. Tanto la producción de ROS como la modificación post-traduccional de estas proteínas es prevenida por el pre-tratamiento con logomicina de las células primadas con estaurosporina. Estos resultados sugieren que el complejo de la H+ -ATP sintasa controla la producción de ROS y con ello, el estrés oxidativo celular provocado tras un estímulo apoptótico como es la estaurosporina. De esta forma, la disminución del potencial apoptótico de las células con menor actividad de la H+ -ATP sintasa podría contribuir a la progresión tumoral. Por último, hemos demostrado que el elemento de secuencia beta 1.2, implicado en la localización del mRNA de beta-F1-ATPasa, actúa como represor de la traducción de este mensajero. También hemos demostrado que la actividad traduccional de quimeras beta-gfp es mucho mayor en aquellas construcciones que sufren el procesamiento de los intrones 2 y 3 del RNA de beta-F1-ATPasa, sugiriendo fuertemente que la historia nuclear de un tránscrito es esencial para definir su posterior metabolismo citoplasmático.

Autor: RENEDO GARRIDO MARTA ALICIA.
Año: 2003.
Universidad: VALLADOLID.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: En las enfermedades inflamatorias debidas al depósito tisular de complejos inmunes, los fenómenos mediados por los receptores para la región Fc de las moléculas de anticuerpo (FcyR), expresados en la superficie de las células fagocitarias, son fundamentales para la producción del daño tisular. Un conocimiento detallado de los mecanismos moleculares que llevan a los efectos proinfamatorios derivados de la estimulación de estos receptores, podría ser la base para nuevos tratamientos en el caso de estas enfermedades inflamatorias. Esta memoria describe el estudio de la cascada de señalización citoplásmica desencadenada por la estimulación de los receptores FcyR sus efectos sobre la inducción de la expresión de determinados genes, en monocitos humanos y en células de la línea monocítica THP-1. Asimismo, se definen algunas características de la señalización asociada a cada uno de los tipos de receptores FcyR que se expresan en estas células. El agrupamiento de los receptores produce respuestas a nivel de señalización citoplásmica que incluyen la fosforilación de Kinasas de la familia MAP, y la liberación de ácido araquidónic de los fosfolípidos de membrana, a través de la ruta de la cPLA2. Entre los genes que se inducen como consecuencia de esa estimulación, se encuentra la enzima ciclooxigenasa-2 (COX-2) implicada en la síntesis de eicosanoides que son potentes mediadores proinflamatorios, y los genes de varias quimiocinas que incluyen RANTES, MIP-1a, MIP-1b, MCP-1 e IL-8. La última parte del trabajo se centra en analizar el efecto que produce la incorporación de las moléculas de C3b del complemento a la red de inmunocomplejos. Este es un proceso que sucede normalmente cuando los inmunocomplejos se forman en fluidos que contienen complemento, y aunque no se conoce totalmente el mecanismo por el que sucede, se ha relacionado clásicamente con la eliminación de los complejos con una respuesta inflamatoria limitada. Los resultados obtenidos revelan un mecanismo en el que la activación del complemento modula el efecto proinflamatorio de los inmunocomplejos, por alteración de las interacciones con los receptores implicados en la señalización.

Autor: CASTELLÓ CROS REMEDIOS.
Año: 2003.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: MEDICINA .
Centro de realización: BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR.

Resumen: La invasión tumoral y la metastasis requieren la regulación coordinada de una serie de procesos adhesivos, proteolíticos y migratorios. El sistema fibrinolítico y el sistema de las metaloproteasas juegan un papel clave en la degradación de la matriz extracelular. Los estudios previos se han centrado en estudiar los niveles antigénicos de componentes de ambos sistemas. En el presente trabajo se ha puesto a punto, por primera vez, la técnica de la RT-PCR cuantitativa en tiempo real para cuantificar los niveles de mRNA de componentes del sistema fibrinolítico: UPA, PAI-1 y PAI-3 y del sistema de las metaloproteasas MMP-3 y TIMP-1 en 76 tejidos de cáncer de mama. Además, se han cuantificado sus niveles antigénicos y funcionales y se ha detectado la localización antigénica de UPA, PAI-1 y PAI-3- (inmunohistoquímica) y la localización de mRNA de UPA y PAI-1 (hibridación in situ). Los resultados indican que la técnica RT-PCR cuantitativas en tiempo real permite una rápida, reproducible, sensible y específica cuantificación del mRNA de UPA, PAI-1 PAI-3, MMP-3 y TIMP-1 en cáncer de mama. Además se ha puesto de manifiesto que el PAI-3 es expresado en cáncer de mama. Los niveles antigénicos y de mRNA de UPA, PAI-1, PAI-3 y TIMP-1 aumentaron significativamente con la gravedad del tumor y con la afectación ganglionar. Los niveles antigénicos de MMP-3 y PAI-1 fueron significativamente mayores en pacientes con recaida que en pacientes sin afectación ganglionar. Sin embargo, los niveles antigénicos de PAI-3 fueron significativamente mayores en pacientes sin recaída. El PAI-3 antigénico fue localizado en las células del estoma que rodean a los tumorales. Por otro lado, el UPA y PAI-1 antigéninco fueron localizados en las células del etoma y en los tumorales; sin embargo sus mRNAs fueron localizados en el estoma. Indicando de UPA y PAI-1 son sintetizados en el estoma y posteriormente captados por las células tumorales. Así pues, nuestros datos indican que UPA, PAI-1, MMP-3 y TIMP-1 contribuirán a la invasión metástasis del cáncer de mama. Sin embargo, el PAI-3 parece inhibir estos procesos.

Autor: GRANERO MOLTÓ FROILÁN.
Año: 2003.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: MEDICINA .
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS.

Resumen: El trabajo describe el aislamiento e identificación del promotor de CIL4A3BP, gen que codifica para la proteína GPBP (Goodpasture antigen-binding protein). Además se han caracterizado los elementos y factores de transcripción implicados en la regulación de la expresión de GPBP tanto a nivel basal como tras tratamiento con TNF, una citocina que muestra efecto inhibidor sobre el promotor. El trabajo también analiza las diferencias entre los promotores humano y múrido y la implicación de estas diferencias en la actividad del promotor. Finalmente se identifican promotores con homologías estructurales al promotor de interés y se analizan los factores de transcripción comunes a las secuencias homólogas localizadas como la respuesta de los distintos promotores a TNF.

Autor: GALÁN RIVAS ARANZAZU.
Año: 2003.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: La implantación embrionaria es un proceso de gran importancia. Para que sea posible el blastocisto humano debe ser capaz de adherirse al epitelio endometrial y atravesarlo. En ratón la inducción de apoptosis es un mecanismo básico en la regulación de los procesos de adhesión y para averiguar si este proceso también ocurre en la implantación embrionaria en el ser humano, se plantan diversos experimentos para cuantificar la existencia de procesos apoptóticos en las fases de aposición y adhesión del blastocisto humano. En este trabajo se demuestra una regulación embrionaria de la apoptosis en el epitelio endometrial, resultando que en la fase de aposición, la presencia de un embrión humano ejerce un papel protector sobre las células del epitelio endometrial, mientras que en el momento de la adhesión, el blastocisto induce apoptosis selectivamente en aquellas células con las que entra en contacto. Por otra parte estudiamos los sistemas de control de este proceso y averiguamos que el sistema Fas/FasL de regulación de apoptosis está presente en la interfase embrión endometrio y que si logramos bloquear su funcionamiento, disminuyen significativamente las tasas de adhesión embrionaria.

Autor: LÓPEZ MITXELENA TERESA.
Año: 2003.
Universidad: PAIS VASCO.
Centro de lectura: MEDICINA .
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA (UPV/EHU)..

Resumen: La interleucina-10 (IL-10) es una citocina supresora de la proliferación específica de los linfocitos T después de la presentación antigénica. Su efecto se produce a través de la inhibición de la expresión de los antígenos de la clase II del Complejo Mayor de Histocompatibilidad y de la molécula de adhesión intercelular-1 (ICAM-1). Por el contrario, la IL-2 es una molécula estimuladora de la respuesta inmune antitumoral. En trabajos previos hemos demostrado que diferentes líneas celulares de melanoma humano expresan el receptor de la interleucina-2 (RIL-2) y sintetizan IL-2, por lo que esta citocina puede ser utilizada como factor de crecimiento paracrino y/o autocrino. Con el objeto de valorar la respuesta inmune antitumoral que se produce durante la evolución de los pacientes con melanoma y su implicación en la evolución metastática, en el presente trabajo hemos estudiado la participación de la IL-10 e ICAM-1 en la progresión maligna del melanoma y su modulación por la IL-2. Para ello, hemos determinado los niveles séricos de IL-10 e ICAM-1s en 188 pacientes con melanoma durante 4 años de seguimiento y los hemos analizado junto a los niveles del receptor soluble de la IL-2 (RIL-2s). Por otra parte, ya que las células de melanoma expresan IL-10, hemos estudiado el efecto in vitro de la IL-2 sobre la expresión y síntesis de IL-10 y la expresión de los antígenos HLA-DR e ICAM-1 en dos líneas de melanoma humano A375 y Hs294T. Los resultados han mostrado un incremento de los niveles séricos de RIL-2s, IL-10 e ICAM-1s que están significativamente relacionados con la evolución metastática del melanoma. Por otro lado, el tratamiento de las células del melanoma con IL-2 estimula la expresión y síntesis de IL-10 en ambas líneas celulares y además, modula la expresión en la membrana de las células tumorales de los antígenos HLA-DR e ICAM-1. Estos resultados sugieren que la inmunosupresión observada en los pacientes con melanoma metastático podría ser debida a la presencia de estas citocinas sintetizadas por las propias células tumorales.

Autor: GOMEZ CABRERA M. CARMEN.
Año: 2003.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: MEDICINA .
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA Y ODONTOLOGÍA.

Resumen: Desde hace años se sabe que el ejercicio físico regular y no agotador tiene efectos beneficiosos, que son especialmente importantes en el tratamiento de la diabetes mellitus y de la cardiopatía isquémica, al mejorar el perfil lipídico del plasma y ayudar a perder peso. Sin embargo, los beneficios del ejercicio desaparecen con el agotamiento y la falta de entrenamiento. Durante el ejercicio físico agotador se genera un exceso de especies reactivas del oxígeno de manera que las defensas antioxidantes son incapaces de prevenir el daño que éstas inducen. En la actualidad son cada vez más los trabajos que apuntan hacia el papel de las especies reactivas del oxígeno en la señalización celular y en la adaptación muscular el ejercicio físico. En la presente tesis se han demostrado el importante papel de los radicales libres derivados de la xantina oxidasa en la activación de la vía de las proteín kinasa activadas por mitógenos, en la cascada de señalización que conduce a la activación del factor nuclear kB y en la expresión de genes involucrados en las adaptaciones al ejercicio físico (superóxido dismutasa Mn dependiente, óxido nítrico sintasa inducible y óxido nítrico sintasa endotelial). Los resultados obtenidos confirman que las especies reactivas del oxígeno producidas durante el ejercicio físico actúan como señales reguladoras de procesos moleculares importantes para las adaptaciones de las células musculares al ejercicio físico. La prevención del estrés oxidativo asociado al ejercicio físico mediante la administración de antioxidantes orales puede llegar a ser perjudicial al condicionar la respuesta adaptativa. Por tanto, la extendida prescripción del uso de suplementos antioxidantes entre los deportistas debe ser revisada. Los antioxidantes orales, aunque recomendables durante la competición deportiva cuando el ejercicio se realiza hasta el agotamiento, pueden no ser tan apropiados durante los periodos de entrenamiento.

Autor: GARCÍA BARCHINO M. JOSÉ.
Año: 2003.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: QUÍMICA.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS.

Resumen: El receptor con actividad tirosina quinasa Her-2 se encuentra sobreexpresado en el 25-30% de los casos de cáncer de mama. Tradicionalmente la sobreexpresión de Her-2 se ha asociado con una peor evolución de la enfermedad. Con nuestro estudio hemos caracterizado la expresión de las formas completa, p185 Her-2 y truncada, p95 Her-2 del receptor. Nuestros resultados han demostrado la presencia de una estrecha asociación entre la expresión de la forma truncada con el grado de afectación ganglionar de las pacientes. Asimismo los elevados niveles de expresión de p95 Her-2 se asocia con una peor evolución de las pacientes, presentando unas mayores probabilidades de sufrir una recaída y muerte a causa de la enfermedad. Por el contrario la forma completa P185 Her-2 no se mostró ser un factor pronóstico en nuestras pacientes de cáncer de mama.

Autor: VILLARROYA GRAU M. MAGDALENA.
Año: 2003.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: INSTITUTO DE INVESTIGACIONES CITOLÓGICAS.

Resumen: En el laboratorio de Genética Molecular de la FVIB hemos estado estudiando durante los últimos años la regulación de genes esenciales para la replicación del cromosoma de Escherichia coli. En concreto, yo me he encargado de analizar la regulación del gen dnaN, codificador del factor de procesividad de las replicasa bacteriana, y de caracterizar el gen MnmE, implicando en la regulación de dnaX, el gen codificador de las subunidades gamma y * de la replicasa. El producto del gen dnaN es la subunidad beta que es la responsable de la alta procesividad de la DNApolimerasa III. El gen dnaN se encuentra localizado en el operón dnaA. La actividad beta-galactosidasa de las fusiones que contienen las regiones promotoras de dnaN y recF aumentó durante la transción a la fase estacionaria. Esta inducción es independiente mayoritariamente de rpoS en el caso de dnaN pero no en el caso de promotores de recF esta inducción estacionaria no es consecuencia de la disminución de la velocidad de crecimiento que tiene lugar en esta transición. Tres de los cuatro promotores de dnaN se inducen durante la entrada en la fase estacionaria o por el crecimiento en medio hiperosmótico y esta inducción depende de RpoS: la acumulación de RposS no es suficiente para provocar la inducción de los promotores de dnaN a baja temperatura, y proponemos que la inducción de dnaN requiere factores adicionales a RposS en estas condiciones. Previamente había sido propuesta una secuencia consenso para el reconocimiento por O38 que consistiría en una secuencia -10 CTATACT, una región corriente arriba que presentará una curvatura intrínseca y una región -35 no sería necesaria. La región promotora de dnaN carece de una curvatura intrínseca, sin embargo, la región -35 de los promotores de dnaN es crucial para que tal activación acontezca. En la segunda parte de esta Tesis se ha presentado la caracterización bioquímica y funcional de MnmE. Nuestros resultados indican que: MnmE es una proteína multidominio con actividad GTPasa. MnmE presenta una actividad GTPasa intrínseca alta y muy baja afinidad por GTP y GDP; además, es capaz de formar multimeros. La proteína MnmE se localiza mayoritariamente en el citoplasma aunque una pequeña pero singificativa fracción se asocia a la membrana citoplasmática. Esta asociación no depende de la única cisteína que posee la proteína y que se localiza en un motivo C-terminal que guarda semejanza con la caja C-a-a-X de las proteínas Ras. La proteína MnmE es codificada por el gen mnmE que se cooresponde con el gen trmE, identificando inicialmente mediante procedimientos genéticos clásicos por otros autores. La proteína MnmE está implicada en la modificación de ciertos tRNAs y esta función depende tanto del dominio GTPasa como del dominio C-terminal. La ausencia de MnmE, y por tanto de modificación en sus tRNAs específicos, es letal cuando se combina con la presencia de una mutación SmR restrictiva de error.

Autor: ORZÁEZ CALATAYUD M. MAR.
Año: 2003.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.

Resumen: El análisis de secuencias genómicas completas de diversos organismos muestra que, aproximádamente, un 20-30% de las pautas de lectura abierta codifica para proteínas que atraviesan la membrana (Arkin, Brunger et al. 1997) (Wallin and von Heijne 1998). Sin embargo el medio en que estas proteínas adoptan su estructura nativa y desarrollan su función, la membrana, ha dificultado la aplicación directa de las técnicas de estudio habituales para proteínas solubles. Esta dificultad se refleja en el hecho de que en la era de la explosción de obtención de estructuras proteícas de alta resolución, se limita a unas docenas el número de proteínas de membrana resueltas. En este trabajo se ha utilizado la oligomerización del segmento transmembrana (TM) de una proteína modelo, Glicoforina A(GpA), para tratar de aportar nuevos datos que faciliten la comprensión de los factores que contribuyen al proceso de plegamiento de proteínas en el interior de la membrana. Los objetivos de este trabajo han consistido en: 1,- Averiguar el papel que desempeña el extremo C-terminal del segmento TM de GpA en el proceso de dimerización de esta proteína. 2,- Estudiar la contribución individual de los resíduos del motivo de dimerización de GpA al proceso de empaquetamiento hélice-hélice, utilizando un esqueleto homogéneo de polileucinas. Comprobar la contribución que la longitud del fragmento hidrofóbico desempeña en la oligomerización de este tipo de segmentos. 3,- Estudiar los efectos que provoca sobre el empaquetamiento entre hélices TM la presencia de resíduos de prolina utilizando la dimerización de la proteína GpA como sistema modelo. En conjunto, estos estudios aportan nuevos datos sobre un conjunto de factores que intervienen en el proceso de empaquetamiento entre fragmentos transmembrana, y que por lo tanto, afectan al plegamiento de proteínas transmembrana.

Autor: ANDOLLO VICTORIANO M. NOELIA.
Año: 2003.
Universidad: PAIS VASCO.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA (UPV/EHU)..

Resumen: Estudio de la implicación de los mecanismos epigenéticos de metilación del ADN y estructura de la cromatina en la regulación de la expresión génica que se produce en los procesos de diferenciación y apoptosis inducidos por ácido retinoico en las células madre embrionarias y de carcinoma embrionario. Su importancia radica en que se ha demostrado que dichos mecanismos están directamente implicados en la represión y activación de genes en la impronta del genoma así como en la carcinogénesis. En las células madre embrionarias el ácido retinoico induce fenómenos de diferenciación y de apoptosis, especialmente en ausencia del factor inhibidor de la leucemia (LIF). Asociado al proceso de diferenciación, se produce una metilación del gen sometido a impronta U2af1-rs1. Por otro lado, estas células diferenciadas muestran una mayor expresión del gen que las indiferenciadas, lo que está relacionado con una estructura cromatímica más abierta. De estos resultados se deduce que la expresión de este gen debe estar regulada por modificaciones en la conformación cromatínica más que por la metilación del ADN. Durante el proceso de apoptosis se aprecia la presencia de regiones génicas que eluden la fragmentación generalizada carcterística del mismo. Además, los cuerpos apoptóticos presentan una estructura cromatínica relativamente abierta, quizás consecuencia de la desmetilación observada en algunas secuencias génicas. Se constató, asimismo, la presencia en los cuerpos apoptóticos de transcritos correspondientes a varios genes. Incluso, los ARNms purificados a partir de estas estructuras perservan la integridad estructural y funcional, siendo capaces de dar lugar a proteínas de nueva síntesis. Estos resultados sugieren que los cuerpos apoptóticos pueden mantener una capacidad metabólica precisa hasta su degradación final y culminación del proceso apoptótico.

Autor: ABDEL HALIM GAAFAR AYMAN.
Año: 2003.
Universidad: PAIS VASCO.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: INMUNOLOGÍA, MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA.

Resumen: La notificación de un incremento de los aislamientos de M Kansasii en Vizcaya en los últimos cinco años, nos planteó la realización de un estudio epidemiológico cuyo objetivo fundamental sería conocer las implicaciones epidemiológicas de los aislamientos de M Kansaii mediante el desarrollo de técnicas de Biología Molecular. Mediante PCR-RFLP 293 aislamientos clínicos (98,9%) pertenecían al genotipo I, además la cepa de control CECT 3030T y una cepa escotocromógena de M. Kansasii (Sco-I). Unicamente 3 aislamientos clínicos generaron el genotipo II. Las tres capas pertenecían a dos varones que vivían en el mismo área (Barakaldo). Mediante RAPD los mejores resultados los obtuvimos combinando los iniciadores MPTR-1 e INS-2 generando seis clones: Al por 215 aislamientos clínicos (73.3%), B1 por 70 aislamientos (23.8%), A2 por 4 aislamiento, A3 por 1 aislamiento, D1 por 3 aislamiento del genotipo II, y C1- por una cepas control (Pas-1). El análisis mediante AFLP generó los mejores resultado con el enzima ApaI y con la combinación de 3 iniciadores Apa -A, Apa-C, y Apa-T. Con los aislamientos clínicos se generaron 10 clones: 1º: con 139 aislamientos clínicos (47.4%), 2º con 71 (24.2%), el 3º con 61 (20.8%),el 4º 13 (4.4%), el 5º 2 (0.06%), 6º,7º,8º y 9º con un aislamiento clínico cada uno y el 10º formado por los aislamientos pertenecientes al genotipo II. Además se generaron otros 3 clones con cepas eoidemiologicamente no relacionadas: (Sco-I, Pas-1 y CECT 3030T). Mediante LRF-PFGE se estudiaron 43 aislamientos clínicos pertenecientes a todos los clones obtenidos mediante AFLP. Los resultados mejores se obtuvieron con el uso del enzima Dral y se obtuvieron un total de 11 clones, se generaron otros 3 clones mas con cepas control usadas. La investigación en las muestras de agua ambientales, laboratorio de microbiología y agua de domicilios de pacientes no generó aislamientos de M. Kansasii, excepto en una muestra del agua del laboratorio de Microbiología pero perteneciente al genotipo V. El AFLP es una técnica afectiva, reproducible, flexible y muy discriminatoria para el tipado de M. Kansasii. El análisis por AFLP demostró una discriminación superior a la técnica de referencia LRF-PFGE que fracasó en la discriminación de algunas cepas epidemiologicamente no relacionadas. Por otra parate, RAPD análisis tenía discriminación muy pobre y no puede ser usado solo para la diferenciación de estos aislamientos firmemente clonal. La combinación de AFLP y RAPD ha distinguido 13 clones dentro los aislamientos del genotipo 1.90% de los cuales pertenecían a 3 clones predominantes, mientras los otros 10 clones fueron representados por pocos números de aislamientos. La alta clonalidad de este porcentaje en solo tres clones postula una fuente epidemiológica común responsable de la mayoría de los aislamientos. El 90% de los aislamientos de Portugalete pertenecían al mismo clon, lo que indica una fuente común de la infección en esta área. La recuperación de aislamientos M. Kansasii en miembros de una misma familia, que pertenecen al mismo clon, con la ausencia de una fuente ambiental, trae a la luz otra vez las preguntas sobre el modo de la transmisión, y a la posibilidad de transmisión de humano-a-humano de M.kansasii. La aparente alta clonalidad del genotipo I de M. Kansasii visto en estudios anteriores pudo deberse a la escasa discriminación de las técnicas empleadas. Otros estudios deben tomar en al consideración la posible alta heterogeneidad de los aislamientos del genotipo I de M. Kansasii. El uso de técnicas de tipado más eficaz, o combinaciones de técnicas, traerá a la luz esta heterogeneidad, y ayudará a los investigadores a contestar a muchas preguntas sobre el reservorio natural, el modo de transmisión, y la posibilidad de transmisión entre humanos de M. Kansasii.

Autor: MARÍN NAVARRO JULIA VICTORIA.
Año: 2003.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA .
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS.

Resumen: En este trabajo se ha profundizado en el conocimiento de los mecanismos que regulan la actividad y la disponibilidad proteolítica de la Rubisco a través del estado de oxidación de resíduos de cisteína del propio enzima. Se han estudiado los siguientes aspectos concretos dentro de este tema: 1,- Patrón diferencial de proteolisis de Rubisco reducida y oxidada. Los resultados indican que la oxidación de cisteínas conservadas de la Rubisco induce un cambio conformacional progresivo que favorece la exposición del lazo Sergi-THR68 de la subunidad grande a la acción de proteasas exógenas. El corte proteolítico en este lazo promueve el desembalaje y la digestión completa del enzima. La proteolisis de la Rubisco por subtilisina se modelizó mediante un sistema de tres ecuaciones diferenciales acopladas. El modelo obtenido describe correctamente la cinética de proteolisis y puede utilizarse como herramienta para detectar cambios conformacionales y comportamientos anómalos en enzimas mutantes. 2,- La obtención de mutantes de Rubisco por sustitución de resíduos conservados con cisteína. Se obtuvieron mutantes fotosintéticamente activos de cisteínas conservadas de la subunidad Grande (C84S, C247S, C427S, C449S, C459S y C449SSIC45aS) y de la subunidad Pequeña (C42S, C83S) de la Rubisco. 3,- Papel del par C4549-C4545S9 en la modificación Redox de la Rubisco. Los resultados obtenidos en este apartado indican que los resíduos de cisteína 449 y 459 de la subunidad Grande de la Rubisco son necesarios para inactivar completamente el enzima a potenciales Redox elevados y favorecen la exposición del lazo Sergi-THR68 a la acción de proteínas exógenas in vitro en condiciones oxidantes. El doble mutante acumula una mayor cantidad de biomasa por célula y responde al estrés intensificando la agregación, movilización a la fracción membranosa e inactivación del enzima.

Autor: LLOP PÉREZ PABLO FERNANDO.
Año: 2003.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: INSTITUTO VALENCIANO DE INVESTIGACIONES AGRARIAS-IVIA.

Resumen: Agrobacterium tumefaciens es una bacteria fitopatógena causante de tumores en el cuello de muchas especies vegetales de interés económico, siendo en viveros donde más daño produce. Los estudios epidemiológicos y de poblaciones del patógeno son poco abundantes. Se ha señalado el predominio de cepas no patógenas frente a patógenas de ambientes donde éstas últimas estarían en ventaja, pero apenas se ha investigado la pérdida del poder patógeno en tumores. Se pretende ampliar el estudio de este fenómeno en diversas cepas y en diversos huéspedes, para comprobar si se presenta en la mayoría de cepas y existen interacciones con las plantas. En primer lugar, se ha puesto a punto un método de identificación de cepas A.tumefaciens, por medio de RAPDS con indicadores inespecíficos, y se ha comprobado que es eficaz para diferenciar entre las especies del género. En segundo lugar, se ha llevado a cabo inoculaciones en diversos huéspedes, y de los tumores producidos, se anularon colonias de las que se ha estudiado el fenotipo patógeno, para comprobar la frecuencia de aparición de este fenómeno y los cambios moleculares sufridos. También se ha llevado a cabo experimentos in vitro mediante siembras sucesivas en un medio general para ver si la pérdida del poder patógeno se reproduce de forma espontánea. El sistema de identificación mediante RAPDS ha confirmado que, del análisis de 5.000 colonias no patógenas de los aislamientos hechos de tumores, solo 7 se corresponde con la que se había inoculado previamente. El resto eran cepas de Agrobacterium, de los que se desconoce su origen. Por tanto, en este trabajo, se comprueba que la pérdida del poder patógeno, en las condiciones y cepas estudiadas, se produce de forma muy escasa. La caracterización molecular de los mutantes ha mostrado que 6 de 7 presentan cambios en su plásmido Ti, como inserciones de elementos transponibles o mutaciones puntuales. El caso más llamativo lo presenta dos mutantes con grandes cambios en su plásmido Ti, de un tamaño doble del de la cepa salvaje. El resto de mutantes presenta variaciones en el tamaño o número de plásmidos respecto de las cepas parentales. Los cambios parecen implicar grandes reorganizaciones en el genoma de los mutantes.

Autor: BOIX CHORNET MANUEL.
Año: 2003.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: QUÍMICA.
Centro de realización: FACULTAT DE BIOLOGÍA.

Resumen: Durante la apoptosis se producen diversos procesos nucleares característicos, tales como la fragmentación internucleosomal del DNA, la condensación de la cromatina, la degradación de proteínas por caspasas y la liberación de histonas de la cromatina. Aunque estos procesos nucleares contribuyeron a la propia definición de apoptosis no existe una completa comprensión de los mismos. Es posible que las modificaciones post-traduccionales de las histonas estén implicadas en estos procesos. En esta tesis doctoral se han investigado los cambios epigenéticos de la cromatina durante la apoptosis utilizando como modelo dos líneas celulares de leucemia y dos agentes pro-apoptóticos. En primer lugar, se han analizado los cambios globales en el patrón de modificación de las histonas y el DNA. Se ha observado que la apoptosis está asociada con un descenso sutil en el grado de acetilación de las histonas así como una disminución en el contenido de metilcitosina. Además, se ha determinado que las histonas que son liberadas de la cormatina durante la aopotosis se encuentran más hipoacetiladas que las que permanecen asociadas a la cromatina. La fracción de la histonas H4 que es liberada de la cromatina en apoptosis posee un patrón de metilación específico respecto a la que permanece asociada a la cromatina. El DNA asociado a estas fracción liberada se encuentra hipometilado y procede la región de heterocromatina perinuclear. Se ha realizado un análisis global de la expresión mediante el uso de microarrays tras la inducción de apoptosis. Se ha observado un descenso generalizado en la expresión, aunque algunos genes aparecen sobreexpresados. Mediante ensayos de inmunoprecitipación de cromatina se han analizado los patrones de acetilación asociados con genes reprimidos y sobreexpresados. Entre el primer grupo de genes se ha observado que los patrones de acetilación se corresponden en general con los esperados, según su nivel de expresión. El patrón de modificaicón de los genes sobreexpresados indican la existencia de una regulación fina.

Autor: VEGAS LUZURIAGA M. LAURA.
Año: 2003.
Universidad: PAIS VASCO.
Centro de lectura: FARMACIA .
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA Y ODONTOLOGÍA, FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: Este trabajo estudia la posible implicación del sistema encefalinérgico troncoencefálico en el mecanismo de acción cerebral de diversos fármacos antidepresivos. Para ello se realizó una administración crónica de fluoxetina, nefazodona e imipramina en ratas, seguida de un extenso estudio inmunocitoquímico regional, abarcando leu-encefalina y receptor opioide mu. El tratamiento antidepresivo produjo variaciones significativas en la espresión inmunocitoquímica de leu-encefalina en diversas regiones troncoencefálicas, sugiriendo una posible alteración en la actividad del sistema opioide por efecto del tratamiento antidepresivo. Los resultados obtenidos sugieren la implicación del sistema opioide en el mecanismo antidepresivo de estos fármacos.

Autor: PARDO JIMENO JULIAN.
Año: 2003.
Universidad: ZARAGOZA.
Centro de lectura: CIENCIAS .
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: Los linfocitos citotóxicos son las células del sistem inmune encargadas de eliminar células tumorales o infectadas por virus. Los linfocitos citotóxicos más importantes son los linfocitos T citotóxicos y las células NK. Estas células inducen la muerte de la célula tumoral o infectada por virus a través de dos mecanismos principales; el mecanismo de exocitosis granular dentro del cual se encuentra el sistema perforina/granzimas y la granulisina, y el sistema de receptores mortales, de los cuales Fas/FasL y DR5/APO2L_TRAIL son los dos más importantes. En este trabajo se han estudiado las vías de transducción de señal implicadas en la inducción del ligando de Fas y en la regulación del mecanismo de exocitosis granular tras la activación del complejo TCR/CD3. Asimismo, se ha analizado el papel del sistema perforina/granzimas en la eliminación de células tumorales in vivo, así como el mecanismo a través del cual induce apoptosis. Por último, se ha estudiado el mecanismo de apoptosis inducida por la granulisina sobre células Jurkat. Para analizar la expresión de FasL y la regulación de la exocitosis granular se han realizado ensayos de citoxicidad utilizando clones de CTL e inhibidores específicos de diferentes quinasas y se han realizado trasfecciones de una línea de CTL (para estudiar la exocitosis granular) y de la leucemia humana T Jurkat (para estudiar la inducción de FasL) con mutantes constitutivamente activos o dominante negativos de PI3K y PKC, junto con una construcción de FasL-Luciferasa. Se ha observado que la PI3K, las isoformas theta y epsilon de la familia de las PKC y las MAPK ERK y p38 MAPK se encuentran implicadas en la expresión de FasL, mientras que isoformas clásicas de las PKC, como la alpha y la MAPK ERK regulan la exocitosis granular. Para estudiar el papel fisiológico del sistema perforina/granzimas se han utilizado ratones C57BL/6, de fenotipo silvestre o los siguientes ratones KO: gzmA-/-, gzmB-/-, gzmAxB-/-, prf-/- y prfxgzmAxB-/-. A partir de estos ratones se han generado CTL alogénicos o específicos para el virus LCMV, o bien se han utilizado para analizar el desarrollo in vivo del linfoma RMA-S. Se ha observado que las granzimas A y B son capaces de inducir muerte celular al mismo nivel y con la misma cinética, pese a que en algunas células como L1210.3, la granzima A no sea capaz de inducir fragmentación oligonucleosomal rápida del DNA, aunque sí que lo sea sobre otras como EL4.F15. Asimismo, se ha observado que para el control óptimo in vivo del desarrollo del linfoma RMA-S, se necesita la acción concertada de la perforina y ambas granzimas. Por último, se ha observado que durante la muerte inducida por los CTL, el sistema perforina/granzimas induce una despolarización mitocondrial muy rápida y transitoria y dependiente de la activación de las caspasas 3 y 9 de forma simultánea a la primera despolarización mitocondrial. Por último s eha observado que la granulisina induce apoptosis en células Jurkat, mediante dos mecanismos principales: uno lento que depende de la generación intracelular de ceramida y la activación de una caspasa desconocida, y uno rápido que es independiente de caspasas y que depende de la elevación del nivel intracelular de Calcio, la despolarización mitocondrial, la generación de radicales libres de oxígeno, y en último lugar, la liberación de AIF de la mitocondria y su traslocación al núcleo, donde induce condensación de la cromatina y muerte celular.

Autor: CUTANDA PEREZ M. CRUZ .
Año: 2003.
Universidad: POLITECNICA DE VALENCIA.
Centro de lectura: INGENIEROS AGRÓNOMOS.
Centro de realización: INSTITUTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR DE PLANTAS.

Resumen: Gracias a la transformación genética se han conseguido importantes avances en el conocimiento del metabolismo de carbohidratos en levadura y plantas, que han cambiado incluso conceptos que se consideraban básicos en la regulación de rutas como la glicólisis, la fotosíntesis, etc. El concepto de enzima clave, por ejemplo, ha cambiado drásticamente y el objetivo se traslada ahora al estudio del funcionamiento de las rutas de señalización que modulan los distintos tipos de control. Esto proporcionará las bases para conseguir objetivos tan importantes económicamente ocmo la mejora del rendimiento de la fermentación en levadura, la producción de metabolitos de uso industrial o la mejora de la productividad en plantas (Paul et al., 2001; Fernie et al., 2002a) El objetivo de este trabajo es el estudio de la función de las hexosas fosfato en el metabolismo de carbohidratos y la señalización por glucosa en levadura y en plantas. Para llevarlo a cabo, se ha sobreexpresado el gen DOG R 2 de S.Cerevisiae en el mutante tps1 de levadura y en plantas de tabaco transgénica. Este gen codifica un enzima con actividad específica 2-desoxi-glucosa-6P fosfatasa y con actividad inespecífica in vitro sobre hexosas-P (Randez-Gil et al., 1995a). En el mutante tps1 de levadura, la actividad fosfatasa sobreinducida restablece parcialmente los niveles de metabolitos relacionados con la actividad hexokinasa, y permite el análisis de su función en el control de la glicólisis y la represión catabólica. En plantas, mediante el uso de los análogos de glucosa 2-desoxi-glucosa y 3-O-metil-glucosa y del inhibidor de la actividad hexokinasa N-acetil-D-glucosamina, se ha podido comprobar que la alteración de los niveles de metabolitos relacionados con la actividad hexokinasa es responsable de algunos de los efectos represivos que producen niveles altos de glucosa en plantas, como retraso en el crecimiento, disminución del contenido en clorofila y represión de genes fotosintéticos. También se ha comprobado que son importantes en el mantenimiento de las relaciones entre la producción, el consumo y el almacenamiento de carbohidratos en plantas.