BIOQUIMICA MOLECULAR, 8

Autor: CORTINA PASTOR CAROLINA .
Año: 2003.
Universidad: POLITECNICA DE VALENCIA.
Centro de lectura: INGENIEROS AGRÓNOMOS.
Centro de realización: IBMCP.

Resumen: Se analizó y optimizó la regeneración y transformación de tomate. Explantes de cotiledón de Lycopersicon esculentum cv. UC82B fueron infectados con la cepa de Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 portadoras del gen marcador neomicina fosfotransferasa II (NPTII). Se estudió el efecto de compuestos fenólicos, vitaminas y reguladores de crecimiento en la regeneración y transformación de plantas. Aumentando la concentración de tiamina desde 0.1 mg l-1, en medio estándar, hasta 0.4 mg l-1 se redujo la pérdida de clorofila que acompañaba a la expansión de áreas necróticas en los explantes de cotiledón. La tasa de regeneración óptima se obtuvo con una concentración de 0.5 mg l-1 de la auxina ácido indolacético (AIA) y 0.5 mg l-1 de la citoquinina ribósido de zeatina. Finalmente, con una concentración de 200 uM de actosiringona en el medio de cocultivo un 50% de los tallos resistentes, obtenidos en el medio de regeneración, dieron lugar a plantas transgénicas confirmadas. La eficiencia de transformación fue del 12.5% bajo las condiciones arriba mencionadas. Mediante la transformación por Agrobacterium, el gen de levadura trehalosa-6-fosfato sintetasa se incorporó en el ADN genómico y se expresó constitutivamente en plantas de Lycopersicon esculentum cv. UC82B. La biosíntesis de trehalosa en tomate transgénico mejoró la tolerancia al estrés hídrico y salino. La trehalosa se comportó in vitro como un potente secuestrador de radicales hidrolixo y su expresión en plantas transgénicas TPS1 de tabaco y tomate mejoró la tolerancia al estrés oxidativo producido por especies de oxígeno reactivas. Los fenotipos pleiotrópicos mostrados por las plantas transgénicas TPS1 indican que su biosíntesis, altera el metabolismo de azúcares de tal forma que aumenta la tolerancia de la planta frente al estrés ambiental.

Autor: RONCAL MANCHO CARMEN.
Año: 2003.
Universidad: NAVARRA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE NAVARRA.

Resumen: Se ha examinado la influencia del polimorfismo 4G/5G sobre la expresión endotelial de PAI-1 en respuesta a Angiotensina II (Ang II), Interleucina-1 (IL-1) y lipoproteínas de baja densidad (LDL) en presencia y ausencia de fármacos antiateroscleróticos. Asimismo se han determinado los niveles antigénicos de PAI-1 en relación al polimorfismo 4G/5G en sujetos aparentemente sanos (n=170). Se estimularon células endoteliales de la vena de cordón umbilical humano (HUVEC) con Ang II (10-8 M), IL-1 (500U/mL) y LDL (100 ug/mL) en presencia o ausencia de Losartan (0,01-0,05uM), Pravastatina (1-5uM) y Gemfibrozilo (50-500uM) respectivamente durante 24 horas . El mRNA de PAI-1 se determinó en extractos celulares y la secreción y actividad en sobrenadantes y matriz extracelular (MEC). La Ang II aumentó la expresión, actividad y secreción de PAI-1 en HUVEC 4G/4G significativamente (p menor 0,05) respecto a las HUVEC 4G/5G y 5G/5G. Mediante micrsocopía confocal se observó que la mayoría de la proteína se localizaba a nivel de la MEC. Este aumento de expresión y secreción fue inhibido en presencia de losartan (p menor 0,05) indicando un efecto mediado por los receptores AT1. Tanto lL-1 como LDL oxidadas aumentaron la expresión de PAI-1 en HUVEC 4G/4G en comparación con los controles. El pretratamiento con 5uM de pravastatina y 50 uM de gemfibrozilo redujo este efecto, indicando una acción antiinflamatoria de estos fármacos. Subgrupos de pacientes hipertensos y obesos con genotipo 4G/4G presentaron niveles significativamente aumentados de PAI-1 (p menor 0,05) (35,3 +- 24,2 vs 25,6 +- 12,1 ng/mL) (43,5 +- 23,2 vs 24,9 +- 9,5ng/mL), respecto a los hipertensos y obesos 5G/5G. El polimorfismo 4G/5G de PAI-1 determina una respuesta endotelial genotipo dependiente a Ang II, lL-1 y LDL oxidadas siendo su modulación con losartam, pravastatina y gemfibrozilo dependiente de dicho genotipo. El análisis de polimorfismo 4G/5G del PAI-1 podría ayudar a identificar subgrupos de pacientes con un mayor riesgo cardiovascular.

Autor: NATAL GORGOJO CRISTINA.
Año: 2003.
Universidad: NAVARRA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: En la actualidad, está bien establecido que la inflamación es un proceso asociado a patologías muy variadas y podría ser importante en el desarrollo de las mismas. Como consecuencia de la degradación tisular que ocurre durante la inflamación, diversos componentes de la matriz extracelular son degradados, y sus productos, péptidos de bajo peso molecular. Se acumulan localmente promoviendo el desarrollo de las sucesivas etapas de este proceso. Los mecanismos moleculares implicados en la terminación de la reacción inflamatoria en humanos no se conocen completamente. Los monocitos, diferenciados y activados, son esenciales durante el desarrollo de la inflamación, pero son potencialmente peligrosos y deben eliminarse al terminar su función. En esta trabajo hemos puesto de manifiesto que, péptidos procedentes de la degradación de la fibronectina, proteína muy abundante en los lugares donde se desarrolla la reacción inflamatoria, podrían contribuir a la resolución del proceso inflamatorio y a la transición hacia una fase reparativa, al inducir la eliminación local por apoptosis d emonocitos/macrófagos. Los resultados obtenidos sugieren que los motivos "2-6-11" y RGD confieren, a los péptidos que los poseen, la capacidad de ejercer efectos apoptóticos o antiapoptóticos respectivamente, sobre los monocitos humanos, al menos a determinadas concentraciones. Además, hemos podido identificar a FCgammaRIII como el receptor a través del cual péptidos de fibronectina con el motivo "2-6-11", como por ejemplo FN6, ejercen sus efectos. Asimismo hemos investigado los mecanismos moleculares y las vías de señalización implicadas en la apoptosis inducida por FN6 en monocitos humanos, ya que podría ser interesante su conocimiento a la hora de aplicar terapias antiinflamatorias. También, hemos comprobado que el proceso podría estar potenciado por la acción autocrina del no sintetizado por la INOS, inducida por esos mismos péptidos, y que provoca la nitración en tirosinas de algunas proteínas que parecen en la activación de los mecanismos apoptóticos que operan en los monocitos humanos.

Autor: FERNÁNDEZ ROBREDO PATRICIA.
Año: 2003.
Universidad: NAVARRA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE NAVARRA.

Resumen: El ratón apoE deficiente (apoE-/-), modelo de hipercolesterolemia genética, desarrolla alteraciones ultraestructurales retinianas similares a las observadas en la degeneración macular asociada a la edad (DMAE). Si el estrés oxidativo estuviese relacionado con la aparición de dichas alteraciones, el tratamiento con antioxidantes podría prevenir su desarrollo. Nos planteamos comprobar el estado oxidativo retiniano y determinar en epitelio pigmentado de la retina (EPR)-coroides, la expresión del VEFG y la actividad gelatinasa, así como estudiar la ultraestructura del EPR y membrana de Bruch (MB) e investigar el efecto de la administración de luteína o un complejo multivitamínico no luteína y glutatión (CV) sobre dichos parámetros. Ratones apoE-/- (n=40, 3 meses), tratados diariamente durante 3 meses con luteína o CV en dos dosis: CV-15 (15 mg/kg/día) y CV-50 (50mg/kg/día), se compararon con un grupo control sin tratamiento. El mismo esquema experimental se aplicó con ratones normales (n=40). Los ratones apoE-/- mostraron mayor estrés oxidativo retiniano asociado con una elevada expresión del VEGF y la actividad gelatinasa que podrían ser responsables de la aparición de depósitos laminares basales, vacuolas de aspecto vacío y engorsamiento de la MB. La suplementación con el CV redujo el estrés oxidativo plasmático y retiniano, expresión del VEGF y actividad MMP-2, además de prevenir la aparición de cambios morfológicos. La luteína sola no previno todas las alteraciones observadas en los apoE-/-. Estos resultados sugieren que en los ratones apoE-/-, el estrés oxidativo unido al aumento de factores proangiogénicos, podrían ser responsables, al menos en parte, de las alteraciones morfológicas observadas a nivel retiniano, y que dichas alteraciones son potencialmente prevenibles con tratamientos antioxidantes eficaces.

Autor: INFANTE VIÑOLO JUAN JOSÉ.
Año: 2002.
Universidad: CADIZ.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS DEL MAR Y AMBIENTALES - UNIVERSIDAD DE CÁDIZ.

Resumen: Las levaduras de velo de flor son las responsables del proceso de crianza biológica de los vinos de tipo fino y presentan características únicas, tanto fisiológicas como metabólicas. Su principal peculiaridad consiste en la capacidad de formar una película sobre la superficie del vino. Cuano el vino ha sido fermentado, la principal fuente de carbono para las levaduras de velo de flor es el etanol, que debe ser asimilado a través de un metabolismo aerobio y es por ello que las células se disponen en la superficie del vino, la zona donde la cantidad de oxígeno disuelto es mayor. No se conocen los mecanismos moleculares responsables de este peculiar comportamiento de las levaduras de velo de flor. Además, se conoce muy poco acerca de otras cuestiones relacionadas con el metabolismo, fisiología y ecología de estas levaduras, como por ejemplo su tolerancia a altas concentraciones de etanol, capacidad de desarrollarse en las condiciones de la crianza biológica, evolución de las distintas cepas presentes en el biofilm o mecanismos moleculares que permiten su adaptación al medio. El presente trabajo de Tesis Doctoral se ha dedicado a esclarecer estas cuestiones, con la importancia que ello tiene tanto a nivel industrial para la mejora de este caro proceso que produce el vino fino, como para la ciencia básica, describiendo la capacidad de estas células de adaptarse a un medio tan adverso. Las colonias de levaduras aisladas del velo de flor de varios sistemas de envejecimiento se sometieron a técnicas de estudio de la variabilidad genética: obtención al cariotipo electroforético y estudio del polimorfismo del ADN mitocondrial. En distintos sistemas de envejecimiento se seleccionaron cepas con distintas características genéticas, que tenían influencia en la diferente calidad del vino envejecido. Por ello, se han estudiado estas cepas de manera individual en experimentos de crianza biológica en el laboratorio, demostrándose la diferente capacidad de adaptación e influencia sobre el vino de las mismas. El establecimiento de correspondencias entre las características genotípicas y fenotípicas de las distintas cepas permite el diseño de estrategias de mejora del proceso de crianza, acortando el tiempo requerido para que el vino alcance el grado de envejecimiento necesario. Finalmente mediante la aplicación de la tecnología de los chips de ADN a las levaduras de velo de flor se ha comparado el genoma de dos cepas de S.cerevisiae de velo de flor entre las que previamente se había detectado polimorfismo cromosómico describiéndose 116 regiones genómicas afectadas por aneuploidía. Además, se ha comparado el nivel de expresión de los genes a nivel de todo el genoma entre una cepa de levadura de velo de flor y una cepa de laboratorio durante su crecimiento en condiciones que imitan las de la crianza biológica de los vinos de Jerez, detectándose diferencias en el nivel de expresión que afectan a un centenar de genes. El estudio detallado de los mismos ha puesto de manifiesto los genes implicados en la formación del velo y otras características de las levaduras de velo de flor.

Autor: GONZÁLEZ POLO ROSA ANA.
Año: 2002.
Universidad: EXTREMADURA.
Centro de lectura: VETERINARIA.
Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA.

Resumen: Los objetivos que se plantearon para la realización de esta tesis doctoral fueron los siguientes: 1,- Establecer un protocolo definido de la muerte celular por apoptosis inducida por MPP + en CGCs. 2,- Estudiar los cambios metabólicos que se producen en las CGCs tratadas con MPP+. 3,- Determinar la producción y precisar el papel de las especies reactivas en la muerte celular inducida por MPP+ en CGCs. 4,- Determinar los mecanismos moleculares que tienen lugar en la muerte celular por apoptosis inducida por MPP+, y la posible implicación de diferentes proteínas anti y pro-apoptóticas. 5,- Estudiar los efectos neuroprotectores que diversos antioxidantes y, especialmente la vitamina E, ejercen sobre la muerte neuronal inducida por MPP+. Las conclusiones a las que llegamos fueron: 1,- MPP+ produce en las CGCs un modelo de muerte celular cuyos mecanismos moleculares son compatibles con un modelo aopotótico. 2,- MPP+ provoca en las CGCs cambios metabólicos, como depleción de NAD+, disminución de los niveles de ATP, y acumulación de lactato. 3,- MPP+ induce la formación de diversas especies reactivas. La incubación con diversos inhibidores de la NOS y agentes antioxidantes, en especial la vitamina E, incrementa notablemente los valores de supervivencia celular. 4,- La generación temprana de ROS supone un paso esencial en la señalización intracelular de la apoptosis inducida por MPP+ en CGCs. 5,- MPP+ induce, de una manera temprana, la traslocación de Bax desde el citoplasma a la mitocondria, defosforilación de Bad, salida de citocromo c desde la mitocondria al citosol y activación de caspasa 3. Todos estos fenómenos son bloqueados por la presencia de vitamina E. 6,- Otros bipiridinios de interés agroambiental, como el paraquat, producen neurotoxicidad siguiendo un modelo, en principio, similar al del MPP+.

Autor: SANTIAGO JOSEFAT M. BELÉN.
Año: 2002.
Universidad: EXTREMADURA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: Gran parte de los estudios realizados sobre el receptor de dioxina (AhR) en los últimos años se ha centrado en definir su contribución a procesos fisiológicos y al mantenimiento de la homeostasis celular. La así denomina función endógena del AhR implica, per se, la existencia de mecanismos moleculares de activación transcripcional independientes de la interacción con ligandos exógenos. En el trabajo presentado en esta Tesis Doctoral hemos aportado un posible mecanismo de regulación de la actividad del AhR en ausencia de ligandos exógenos. Estos estudios se han centrado en la regulación llevada a cabo por la maquinaria celular de proteolisis mediada por el proteosoma. Así, hemos observado que existe relación entre la inhibición de esta maquinaria proteolítica y el nivel de activación del AhR a través de la fosforilación de Sp1 por PKC. Por otra parte, hemos abordado el análisis de genes expresados diferencialmente entre cultivos primarios de fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) silvestres y "knock-out" para el AhR (Ahr-I). En este sentido, hemos centrado nuestro estudio en el gen que codifica para una proteína de unión de la forma latente del factor de crecimiento transformante beta 1 (TGF-beta 1), denominada LTBP-1. Este gen se sobreexpresa en los ratones Ahr-I- con respecto a ratones silvestres. Por otra parte, los niveles de TGF-beta, tanto de la forma activa como de la forma latente, detectados en MEFs procedentes de ratones Ahr-I- son significativamente mayores que los encontrados en MEFs de ratones silvestres. Además, en el medio de cultivo de MEFs Ahr-I-hemos detectado una menor actividad de la MMP-2, tanto de la forma pro-MMP2 como de las formas activas.

Autor: BEN MOHAMED FDHILA FAOUZI .
Año: 2002.
Universidad: SANTIAGO DE COMPOSTELA.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA.

Resumen: Se ha realizados el estudio de la actividad inhibidora del crecimiento de Vibrio anguillarum de 150 cepas bacterianas de origen marino de las que solamente las cepas C-148 y CF han mostrado capacidad inhibidora. La actividad antibacteriana se ha evaluado con análisis estadístico mediante ensayos de antagonismo tanto en medio sólido como líquido en cultivos puros y cocultivos (la cepa bacteriana + Vibrio anguillarum). Los análisis de las características fenotípicas, fisiológicas, bioquímicas y genéticas nos ha permitido la identificación de la cepa bacteriana C-148 como perteneciente al género Roseobacter y la cepa CF como una nueva cepa. Extracciones selectivas y aplicación de diferentes técnicas cromatográficas (Amberlita XAD-2, Gel Sephadex LH-20, silica gel y cromatografía líquido-líquido de alta eficacia (HPLC)) nos han permitido localizar, aislar y purificar los siguientes compuestos inhibidores: * Cepa C-148 compuestos: Z54, Z56, Z57 uy Z59. * Cepa CF compuestos: B711, B712, B713, B714 y B717. Aplicación de diversas técnicas espectroscópicas (espectrometría de masas y espectroscopia de RMN) nos ha permitido identificarlos como una serie de dicetopepiracinas. Síntesis de dicetopiperacinas análogos a las naturales y con estereoquímica variada (LL, DD, LD y DL) permitió comparar su actividad con las naturales, seleccionar las más activas e identificar las características estructurales ligadas a esa actividad. Ensayos in vivo indican que en presencia de estos antibióticos las supervivencia aumenta en valores que oscilan entre el 12% y el 33% a una concentración de 0,5 ug.ml-1 mientras que en los cultivos del control hubo una mortalidad del 100% entre el cuarto y el sexto día.

Autor: SPADAFORA MEJÍA CARMENZA.
Año: 2002.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: INSTITUTO DE PARASITOLOGÍA Y BIOMEDICINA "LÓPEZ-NEYRA", C.S.I.C..

Resumen: Los objetivos de la tesis fueron: 1,- Identificar, mediante el rastreo de una librería de expresión, secuencias relacionadas con la familia de caseína quinasas 1 en T.cruzi. 2,- Caracterizar molecularmente el gen de la CK1 de T.cruzi para conocer su organización genómica y su expresión a lo largo del ciclo de vida del parásito. 3,- Desarrollar un sistema de expresión heterólogo de la enzima CK1 de T.cruzi, E.coli y purificar la enzima recombinante para caracterizar sus propiedades bioquímicas. 4,- Desarrollar un sistema de expresión homólogo de la CK1 para estudiar el efecto de inhibidores de otras CK1 tanto en el crecimiento como en la infectividad de T.cruzi. Siguiendo los objetivos planteados, y utilizando una sonda obtenida por PCR de la zona conservada de CK1, se aislaron dos secuencias cDNA que codifican para dos isoformas CK1 en T.cruzi. Una de las isoformas, TcCK1.1, tiene 936 pb y la otra, TcCK1.2, tiene 990 pb. Estas isoformas codifican para proteínas de 36 y 37 kDa, respectivamente. Mediante el uso de sondas específicas para cada una de las isoformas hibridas contra Southern blots se pudo determinar que TcCK1.1 es un gen de dos copias y TcCK1.2 está multiplicado en tándem. La separación de cromosomas por electroforesis de campo pulsado reveló que ambos genes se localizan en dos cromosomas de más de 2 Mb. El modelaje teórico de la estructura de ambas isoformas revela diferencias con respecto a otras CK1 cristalizadas, en los residuos que hacen a la proteína funcional o interaccionan con ella. Al hibridar nothern blots con las sondas específicas para cada gen, se determinó que ambas isoformas se expresan diferencialmente en los diferentes estadíos de vida de T.cruzi, presentando una mayor expresión (a la altura de ARN) en el estadío infectivo, para TcCK1.1, y en la forma intracelular amastigota, para TcCK1.2. La expresión global de las CK1 en T.cruzi revela niveles significativamente más elevados de transcritos CK1 en los dos estadíos intracelulares. La actividad CK1 medida en extractos de parásitos también es superior en los estadíos intracelulares. El análisis de cultivos de epimastigotes sincronizados reveló que existe un pico de actividad CK1 durante las fases S y M del ciclo celular. Durante el crecimiento de cultivos de epimastigotes se determinó que la actividad CK1 es más elevada durante la fase de crecimiento logarítmo de los cultivos. También por centrifugación diferencial se pudo determinar que el mayor porcentaje de la actividad CK1 es retenido en la fracción microsomal. La isoforma TcCK1.1 fue colonada en el vector pET22b+ y expresada en E.coli. La proteína recombinante fue purificada en una columna de níquel y las fracciones con mayor actividad CK1 se utilizaron para determinar las Km aparentes para el péptido específico para CK1, para beta-casína. Los parámetros cinéticos varían con respecto a los descritos para otras proteínas homólogas, lo que apunta a una diferencia estructural para las isoformas CK1 de T.cruzi con respecto a las de otros organismos. El inhibidor específico CK1-7 es menos afin al sitio de unión a ATP que en otras CK12. La heparina no afecta la actividad de las isoformas TcCK1 a niveles bajos. Un nuevo inhibidor de CK1, Himenialdisina, probó ser muy eficaz contra las TcCK1 presentes en extractos de parásitos y contra la proteína recombinante TcCK1.1. Se consiguieron transfectantes con construcciones conteniendo los genes que codificaban para ambas isoformas TcCK1 fusionados o no a la proteína verde GFP. Despúes de probar que la expresión de RAN proveniente de las transfecciones se traducía en niveles más altos de actividad CK1, se pudo determinar que la sobreexpresión de la isoforma TcCK1.2 produce un aumento en el tiempo de duplicación de los parásitos, debido posiblemente a su implicación en el proceso de replicación celular. Este efecto se corroboró al observar que las fases del ciclo celular en esos transfectantes tardan más en sucederse, retrasando así la replicación del parásito. De tres nuevos inhibidores de CK1 descritos y probados sobre los parásitos salvajes, se determinó que sólo el aminopurvalanol NG-97 producía inhibición del crecimiento de los parásitos. Este inhibidor se probó sobre los transfectantes TcCK1.2 y se pudo observar que presentaban incrementada una resistencia al efecto del NG-97, concordante con el incremento en actividad CK1 que demostraron tener. Los transfectantes con las isoformas TcCK1 quimeras presentaban una localización en un túbulo multivesicular, en una región de unión al flagelo, en vesículas y en el núcleo , ésta útlima más intensa en el momento de la citoquinesis. La localización de las isoformas TcCK1 es coincidente con una posible función en tráfico vesicular como ha sido descrito para otras CK1 en otros organismos.

Autor: BIKJDAOUENE LEILA.
Año: 2002.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: MEDICINA .
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA, DEPARTAMENTO DE FISIOLOGÍA.

Resumen: Recientemente se ha demostrado que algunas kinureninas sintéticas, estructuralmente similares a los metabolitos de la melatonina, son antagonistas de receptor NMDA inhibiendo la nNOS. En este trabajo se ha demostrado el efecto anticonvulsivante de la melatonina y de ciertas kinureninas sintéticas, determinándose los niveles de aminoácidos y óxido nítrico en el modelo de epilepsia inducida por el pentilentetrazol. Las ratas se trataron con melatonina y dichas kinureninas a dosis de 10 a 160 mg/kg s.c., 30 min antes de la administración de PTZ (100 mg/kg s.c.). Se evaluaron la latencia, duración e intensidad de la primera convulsión y la supervivencia a las tres horas. La dosis administrada de PTZ causó una alta mortalidad (80%), que fue contrarrestada por la melatonina y las kinureninas a dosis altas, aumentando significativamente la latencia de la primera crisis y disminuyendo la intensidad y la duración de forma dosis-dependiente. Tres horas después de PTZ se sacrificaron los animales que sobrevivieron y se determinaron los niveles de aminoácidos y del óxido nítrico. La administración de PTZ disminuye el nivel de aspartato y aumenta lo del glutamato, glutamina, serina y taurina en las distintas áreas estudiadas. La melatonina contrarresta el efecto de PTZ de la dosis 10 a 40 mg/kg, reduciendo el glutamato, aspartato y serina a partir de la dosis 40 mg/kg y aumenta el GABA, taurina y glicina en la mayoría de las áreas estudiadas. También altas dosis de estos compuestos kinurenínicos contrarrestan el efecto de PTZ reduciendo los aminoácidos excitadores a partir de la dosis 40 mg/kg. Sin embargo el efecto más significativo tanto de la melatonina como de la kinureninas se observa a nivel del óxido nítrico alterado después de PTZ. La melatonina lo disminuye a partir de la dosis 40 mg/kg y las kinureninas a todas las dosis en la mayoría de las áreas estudiadas. Estos resultados indican que la melatonina y esta nueva familia de kinureninas sintéticas participan en la regulación de los aminoácidos y el óxido nítrico a nivel cerebral, lo que puede ser importante desde el punto de vista clínico.

Autor: VIEITES FERNÁNDEZ JOSE M..
Año: 2002.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: El enterocito es la unidad funcional con capacidad absortiva de la vellosidad intestinal, que se genera a partir de células indiferenciadas localizadas en la base de la cripta, en un continuo proceso de recambio celular. Los enterocitos migran desde la base de la cripta hasta la zona apical de la vellosidad donde se desprenden por descamación, durante este proceso de migración a lo largo del eje cripta-vellosidad sufren un proceso de diferenciación funcional progresiva, influida por el contacto con las células adyacentes, por los componentes de la dieta, por la interacción con hormonas y factores de creciente tisular sdi como distintos componentes de la matriz extracelular protéica. El enterocito posee además una función inmunológica, pues constituye la primera barrera defensiva contra la invasión de microorganismos patógenos. En este contexto se ha comprobado recientemente que los enterocitos son células presentadoras de antígeno y que existe intercambio de señales moleculares entre la microbiota intestinal y el epitelio intestinal que regula no sólo la respuesta inmune sino también la diferenciación celular. Un error en la interpretación de estas señales por el sistema inmune en un individuo susceptible genéticamente es el desencadenante de la enfermedad inflamatoria intestinal: enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa. En este sentido el objetivo de esta tesis ha sido indagar sobre el control de la expresión de genes asociados a la diferenciación morfológica y funcional del enterocito. Para desarrollar este objetivo hemos utilizado un modelo ex vivo de diferenciación celular, la producida sobre la línea celular IEC-6 cuando se crece en contacto con una matriz de proteínas extracelulares. Para ello el trabajo de investigación fue desarrollado en base a los siguientes objetivos: * Puesta a punto del método de expresión diferencial de genes ("Differential display"). * Identificación de los genes expresados diferencialmente durante la diferenciación inducida de las células epiteliales de intestino (IEC-6). * Estudio de la expresión de los genes identificados en el epitelio de rata. * Estudio de los genes identificados en la enfermedad inflamatoria intestinal. Los resultados de este trabajo nos hanpermitido por un lado poner as punto la técnica de expresión diferencial de genes disenando una variante que aumenta sensiblemente la eficacia analítica. Al mismo tiempo nos ha permitido identificar 3 genes dos de los cuales el gen rhoE y el gen cd200r son reprimidos durante la diferenciación del enterocito y, el gen mr4a3 inducido durante dicha diferenciación. El gen nr4a3 es un receptor nuclear huérfano de la familia NGFI-B que se expresa tanto en intestino fetal como en intestino adulto. El gen rhoE, cuya secuencia no estaba descrita en rata, presenta una baja expresión en intestino de rata de 7 y 21 días de vida, no expresandose en intestino de rata adulta. Su expresión puede estar regulada por la presencia del factor de crecimiento tisular TGF-beta durante la diferenciación del enteriocito, represión que es acelerada por la presencia de nucleósidos en el medio. Además el gen rhoE muestra una expresión ligeramente mayor en individuos enfermos de colitis ulcerosa frente a individuos sano y enfermos de Crohn. Por último el gen cd200r presenta una expresión decreciente a lo largo del tiempo. De forma que es alta en intestino fetal y desaparece en intestino de ratas al destete. Por otra parte dicho gen no estaba identificado en el genoma humano. Por lo que nuestro trabajo permitió su identificación y localización en el cromosoma 3 en la posición 3q.12-13, estando constituido por 8 exones. Su expresión es mayor en intestino de individuos enfermos de Crohn frente a individuos enfermos de colitis ulcerosa e individuos sanos.

Autor: GARCÍA PÉREZ JOSÉ LUIS.
Año: 2002.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: La presente tesis analiza diferentes actividades enzimáticas codificadas por el elemento móvil de tipo LINE L1Tc del parásito humano, Trypanosoma cruzi. Una primera parte de esta Tesis analiza tres actividades enzimáticas codificadas por el elemento, las cuales participan en el mecanismo de su transposición. Así, en primer lugar se presentan resultados donde se observa reparación del DNA asociada a la región con homología a proteínas con actividad endonucleasa AP presente en este elemento; dicha reparación se observada in vivo, sobre el parásito T.cruzi, utilizando diversos agentes que atacan al DNA, como radiación gamma y el tratamiento con el citotóxico daunorubicina. Posteriormente es analizada la fidelidad de la enzima con actividad RT del elemento L1Tc, siendo esta la primera descripción de la fidelidad de una enzima RT procede de un elemento móvil de tipo LINE. Los resultados obtenidos muestran que si bien la enzima RT del citado elemento LINE L1Tc posee una similar tasa de fidelidad a otras RT de origen retroviral, muestra una tendencia al intercambio de molde (template switching) durante el proceso de polimerización, no observada con la RT control utilizada de origen retroviral. Otra actividad enzimática analizada se corresponde con la actividad Rnasa H. En los resultados presentados se muestra la existencia de dicha actividad asociada al elemento LINE L1Tc, siendo igualmente la primera descripción de la presencia de una actividad enzimática de este tipo, asociada a un elemento de tipo LINE. La caracterización de esta actividad muestra que a diferencia de la enzima retroviral NIV-1 utilizada, la actividad Rnasa H codificada por el elemento L1Tc muestra se activa sobre secuencias de RNA ricas en purinas, presentando además un significativo mayor rango de actividad respecto al valor de pH y temperatura de la reacción RNasa H. La descripción de esta actividad asociada a un elemento LINE refuerza el concepto de autonomía de estos elementos, ya que esta actividad es requerida y participa en el mecanimos de retrotransposición del elemento L1Tc, y por extensión en el proceso de movilidad de los elementos LINE. La segunda parte de la tesis analiza, por un lado la funcionalidad de una secuencia de tipo autocatalítica 2A presente en el elemento L1Tc, así como la retrocompetencia de este elemento en células eucariotas superiores. Los resultados obtenidos muestran que la secuencia 2A es funcional en el parásito T.cruzi, al menos en el estadio epimastigote analizado, induciendo la producción de dos productos proteicos independientes desde regiones codificantes organizadas en una única fase de lectura, indicándose además su posible papel en la regulación de la retrotransposición del citado elemento. Los resultados que analizan la retrotransposición de novo de L1Tc en células eucariotas superiores muestran que el citado elemento es retrocompetente. Además, se muestra el necesario reconocimiento durante el proceso de su integración de novo en el genoma, de la región 3' del mensajero del elemento por la RT del elemento. Por último, se postula que la falta de retrotransposición de L1Tc en algunas de las células eucariotas analizadas, es debida al hecho de que la endonucleasa del elemento L1Tc no es accesible a dicho DNA altamente organizado, probablemente por su adaptación al reconocimiento del DNA cromosómico de T.cruzi, de estructura laxa.

Autor: OTERO MARCOS ANA ROSA.
Año: 2002.
Universidad: LEON.
Centro de lectura: VETERINARIA .
Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA.

Resumen: La ADN topoisomerasa I cataliza la relajación de ADN superenrollado mediante un mecanismo de corte transitotio en una hebra y la formación de un enlace fosfodiéster entre el extremo del ADN y la tirosina del centro activo. Una característica común a las ADN topoisomerasas I eucariotas es la presencia de un centro activo TSK-NY con la tirosina como aminoácido catalítico. La camptotecina (CPT) es un veneno específico de ADN topoisomerasas I que estabiliza de manera reversible el intermediario covalente enzima-ADN inhibiendo el religado del ADN. Aunque la estabilización del intermediario covalente no es citotóxica per se, la letalidad de la CPT se explica durante la fase S del ciclo celular, por su interferencia con el avance de la horquilla de replicación, lo que provoca la conversión del corte de una única cadena del ADN en un corte de la doble cadena del ADN potencialmente letal. Todo ello produce la interrupción del ciclo celular en fase G2 y posteriormente muerte celular. Los promastigotes de Leishmania infantum mostraron sensibilidad frente a CPT, con una EC50 menor de 0,5 uM, prueba de la existencia de una ADN topoisomerasa I en este parásito. En primer lugar se clonó el gen codificante de la subunidad A (TOP1A) que presentó gran homología con distintas ADN topoisomerasas eucariotas pero que carecía del grupo conservado TSK-NY, dando lugar a distintas teorías sobre la reconstrución de una topoisomerasa activa en este parásito para posteriormente clonar u nuevo gen, TOP 1B, que contiene el grupo TSKINY. Así pues, L.infantum posee una ADN topoisomerasa I heterodimétrica, constituída por dos subunidades estructurales diferentes. La subunidad A porta los sitios de unión al ADN (dominio "core") y la subunidad B el centro catalítico (dominio C-terminal). En un sistema de expresión en levaduras, los lisados procedentes de la sobreexpresión de los genes TOP1A y TOP1B por separado no condujeron a la producción de una proteína activa, ni sensible a CPT. Tampoco reconstituyó actividad de relajación la combinación de ambos extractos en diferentes proporciones. Únicamente se obtuvo una proteína activa y sensible a CPT cuando ambos genes se sobreexpresaron conjuntamente. La ADN topoisomerasa I de Leishmania es sensible a CPT (tanto en ensayos in vitro como in vivo), con una estructura del centro activo que permite la unión con el extremo 3' de la hebra cortada y cuya actividad de relajación es independiente de cofactores metálicos y varía con la concentración de KCl. No obstante, para evidenciar la sensibilidad frente a CPT in vivo en un sistema de expresión de levaduras fue necesaria la utilización de una cepa defectiva en la reparación por recombinación de los cortes de la doble cadena del ADN. La síntesis de proteínas quiméricas apoyó la constitución dimérica de la topoisomerasa I de Leishmania ya que se obtuvieron proteínas activas y sensibles a CPT cuando dentro del mismo marco de lectura se unían el gen codificante del "core" de Leishmania (TOP1A) y un centro catalítico de la enzima de humana o de levadura. La topoisomerasa I de Leishmania y la quimera Li635H, modelizadas por homología con la topoisomerasa I humana, son proteínas bilobulares que se cierran alrededor del ADN y presentan un túnel cargado positivamente donde se sitúa el ADN y un exterior negativo que las hace solubles. En la constitución del centro activo de Leishmania intervienen aminoácidos del monómero A (Arg-314, Arg-440 e His-453) y del B (Tyr-222).

Autor: GARCÍA ESTRADA CARLOS.
Año: 2002.
Universidad: LEON.
Centro de lectura: VETERINARIA.
Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA.

Resumen: En este trabajo se ha caracterizado el locus en el que se encuentra el gen MAT2 que codifica para la metionina adenosiltransferasa (MAT) en el protozoo parásito Leishmania infantum. Al contrario que la MAT de mamíferos, en este microorganismo esta proteína está codificada por dos copias génicas idénticas de 1179 pb dispuestas en tándem cabeza-cola y separadas por una región espaciadora de 3953 pb. El análisis de la secuencia de la región del genoma que contiene el gen MAT2, reveló la existencia de un ORF de 1113 pb precediendo a cada una de las copias de dicho gen. Mediante análisis de Northen se comprobó que el ORF se trataba de un nuevo gen, a cuya secuencia teórica de aminoácidos se le denominó de Northern se comprobó que el ORF se trataba de un nuevo gen, a cuya secuencia teórica de aminoácidos se le denominó LORIEN (Leishmania Open Readingframe Intergenic Expresed Newprotein). La agrupación de genes LORIENI MAT2 se localizó en un cromosoma de 1,5 Mb mdiante la realización de electroforesis en campo pulsado. El origen de transcripción de dicho "cluster" se identificó a través del empleo de ensayos de "run-on" nuclear, en la región situada entre las posiciones -2135/-1446 respecto al codón de inicio de la primera copia del gen LORIEN. Los genes MAT2 y LORIEN se expresan de un modo constituido en promastigotes de L.inantum, existiendo dos transcritos para el primero de ellos (2,3 y 2,6 kb) y un único ARNm para el segundo (2,2 kb). A través de experimentos de Western se comprobó que el ARNm de los genes MAT2 y LORIEN se traducían a una proteína de 49 y 47 kDa, respectivamente. Estos tamaños resultaron ligeramente superiores a los estimados teóricamente a partir de sus respectivas secuencias. A pesar de la poca homología que mostró la proteína LORIEN con el resto de las proteínas de las bases de datos, se vio que contenía un dominio conservado consistente en un dedo de zinc de tipo SP-RING/Miz característico de las proteínas PIAS/Siz1 de eucariotas superiores, que han sido recientemente identificadas como E3 SUMOligasas en el proceso de modificación post-traduccional de proteínas integrado por el complejo SUMO. La localización celular de las proteínas MAT y LORIEN se llevó a cabo a través de experimentos de inmunofluorescencia, observándose que la proteína MAT se encuentra en el citoplasma y la proteína LORIEN asociada a la cara interna de la membrana del parásito. A pesar de su diferente localización, ambas proteínas se comportaron como fuertes antígenos durante la infección, dando lugar a una prominiente respuesta inmunológica. Experimentos de Northern y "run-on" nuclear permitieron comprobar que la estabilidad de los transcritos de los genes MAT2 y LORIEN se encontraba regulada a nivel post-transcripcional por factores proteicos responsables de su degradación durante la fase logarítmica de crecimiento. Sin embargo, en fase estacionaria los niveles relativos de los mensajeros de estos genes se regularon por otros mecanismos diferentes que también condujeron a su degradación, indicando que existe una regulación dependiente de la fase de crecimiento. Con el fin de caracterizar las regiones flanqueantes de estos genes, así como identificar la presencia de supuestos elementos reguladores, se realizaron transfecciones transitorias en promastigotes de L.infantum con plásmidos que contenían el gen de la luciferasa como reportero flanqueado por las regiones 5' y 3' de nuestros genes. Los resultados indicaron que existen elementos reguladores positivos y negativos en dichas regiones, que está implicados en la regulación del procesado, estabilidad y traducción de los transcritos de los genes MAT2 y LORIEN.

Autor: SANTAMARTA HERNÁNDEZ IRENE.
Año: 2002.
Universidad: LEON.
Centro de lectura: BIOLOGÍA .
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGÍA.

Resumen: El gen ccaR se ha descrito como regulador positivo de la biosíntesis de cefamicina C y ácido clavulánico en Streptomyces clavuligerus (Pérez-Llarena y col., 1997). Perteneciente a la familia de proteínas SARP, que controlan la biosíntesis de antibióticos en varias especies del mismo género, la proteína CcaR codificada en este gen, presenta homología con reguladores específicos de la biosíntesis de antibióticos en otras especies de estreptomicetos, los cuales realizan su función activadora mediante uniones específicas a regiones promotoras de las agrupaciones biosintéticas correspondientes (Arias y col., 1999; Stutzman-Engwall y col., 1992). El trabajo realizado supone la caracterización de esta actividad reguladora, a través de la purificación de la proteína CcaR y siguientes estudios in vitro e in vivo. En los estudios in vitro, se han llevado a cabo experimentos de unión ADN-proteínas y posterior resolución en geles no desnaturalizantes (técnicas EMSA) determinándose la unión de la proteína a dos regiones promotoras de la agrupación génica de biosíntesis de cefamicina C: el propio promotor génico de ccaR y una región de actividad promotora bidireccional situada entre los genes biosintéticos cefD y cmcI. No se han podido detectar uniones con las regiones promotoras analizadas pertenecientes a la agrupación de biosíntesis de ácido clavulánico, lo que no descarta una regulación directa de CcaR sobre esta ruta biosintética, aunque también podría ejercer su regulación a través de un factor transcripciona adicional. El carácter activador de las uniones detectadas entre CcaR y las regiones promotoras de ccaR y cefD-cmcI, se ha determinado a través de los ensayos in vivo realizados mediante fusiones transcripcionales de los promotores analizados al gen testigo xylE. A través de estos ensayos se concreta una autorregulación positiva ejercida por CcaR sobre la transcripción del gen que la codifica, así como una activación de pasos tempranos, intermedios y tardíos de la ruta biosintética de cefamicina C.

Autor: FLORES DELGADO FRANCISCO JOSÉ.
Año: 2002.
Universidad: LEON.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGÍA.

Resumen: Las proteínas de la familia IdeR, específicas de los microorganismos Gram+, actúan como reguladores negativos en el metabolismo del hierro. Estas proteínas reconocen secuencias operadoras en la región reguladora de los genes, uniéndose a estas secuencias, e impidiendo su transcripción. El modo de acción de estas proteínas es en forma dimérica y unidas a iones de Fe2+. Esta regulación del metabolismo del hierro es muy importante para las bacterias ya que el hierro es un nutriente mineral esencial para la mayoría de los microorganismos. Además, los niveles intracelulares de hierro deben estar finamente controlados ya que un exceso de hierro podrían ser tóxicos para la célula. En este trabajo se han caracterizado las proteínas DmdR1 y DmdR2 de Streptomyces coelicolor, que se engloban dentro de la familia de proteínas IdeR. Se ha comprobado que ambas proteínas reconocen las secuencias operadoras del gen tox de Corynebacterium diphtheriae y del gen desA de Streptomyces pilosus, aunque difieren en afinidad por las mismas y modo de acción. La proteína DmdR2 presenta aproximadamente el doble de afinidad por ambas secuencias operadoras que la proteína DmdR1. No obstante, la afinidad de cada una de ellas por las secuencias operadoras es muy similar, a pesar de que la secuencia del gen desA proviene de otro Streptomyces y presenta una mayor identidad con la secuencia consenso de unión de este tipo de proteínas. Además ambas proteínas difieren en el modo de acción, actuando en forma dimérica la proteína DmdR1, y en forma tetramérica la DmdR2. La proteína DmdR1 es el regulador principal del metabolismo del hierro en Streptomyces coelicolor, ya que en condiciones normales de crecimiento la proteína DmdR2 no se expresa. Además la proteína DmdR1 está regulando negativamente la expresión de DmdR2, probablemente de manera indirecta, ya que mutantes con el gen dmdR1 interrumpido expresaban la proteína DmdR2. También se ha cracterizado el promotor desA de Streptomyces pilosus. Este promotor se regula en función de la disponibilidad de hierro en el medio, y presenta unos niveles de expresión relativamente elevados. Este promotor podría servir, como base de partida, para el diseño de promotores que permitan niveles de expresión de proteínas de interés muy altos y, además, modular esos niveles de expresión mediante los niveles de hierro disponibles en el medio de cultivo. Se han identificado en el genoma de Streptomyces coelicolor 10 secuencias operadoras, similares a la secuencia operadora del gen desA de Streptomyces pilosus, corriente arriba de diferentes genes. Algunos de estos genes están implicados en la síntesis de hipotéticos sideróforos como la coeliquelina y las desferrioxaminas. Esto parece indicar que las proteínas DmdR2 de S.coelicolor están implicadas en los sistemas de regulación del metabolismo del hierro.

Autor: CAMPOY GARCÍA SONIA.
Año: 2002.
Universidad: LEON.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGÍA.

Resumen: Monascus es en hongo ascomiceto ampliamente utilizado en Oriente para la fabricación de alimentos tales como el arroz rojo y que fue conocido en Occidente como contaminante de los cereales almacenados en silos. Los hongos del género Monascus producen 6 pigmentos mayoritarios que desde un punto de vista químico pertenecen al grupo de las azafilonas. Dichos pigmentos se agrupan en 3 parejas: Monascina y ankaflavina (color amarillo), monascorubrina y rubropunctatina (color naranja) y rubropunctamina y monascorubramina (color rojo). La cepa Moascus IB1, obtenida mediante mutagénesis clásica con nitrosoguanidina de un aislado natural del arroz rojo, ha sido caracterizada como Monascus purpureus IB1 mediante estudios morfológicos y mediante la técnica RAPD. Se ha desarrollado un procedimiento de transformación de M.purpureus IB1 utilizando iones calcio y altas concentraciones de polietilenglicol, que permite la obtención de 43 transformantes/ugADN. En éste, el ADN plasmídico se integra al azar en el genoma de M.purpureus IB1, pudiendo dirigirse dicha integración hacia sitios específicos en presencia de cantidades considerables de enzimas de restricción (REMI). De igual forma se ha obtenido un procedimiento de transferencia de ADN a M.purpureus IB1 mediada por Agrobacterium tumefaciens que permite la obtención de hasta 123 transformatnes por ensayo de transformación. La producción y excreción de los 6 pigmentos clásicos tipo azafilona depende de las condiciones de cultivo especialmente de la fuente de carbono y de nitrógeno, habiéndose encontrado una producción óptima en medio con maltosa y glutamato como fuentes de carbono y nitrógeno, respectivamente. La adición de ácidos hexanoico o decanoico a cultivos de M.purpureus IB1, disminuye los niveles extracelulares de los pigmentos azafilona clásicos manteniendo normales los niveles intracelulares. Los ácidos grasos favorecen la producción y secreción de nuevos pigmentos hidrofilicos; por ello, se han purificado, de cultivos suplementados con ácido hexanoico 5 nuevos pigmentos polares: dos de color amarillo, uno de color naranja y dos de color rojo, habiéndose determinado la estructura de dos de ellos mediante espectrometría de masas y resonancia magnética nuclear. Además, se ha purificado del sobrenadante de cultivo de M. Purpureus IB1, un complejo anaranjado glicoproteína-cromóforo de 315 kDa que origina dos bandas glicoproteicas de 62 y 72 kDa en SDS-PAGE que pueden corresponder a la misma proteína con diferente grado de glicosilación. Se han obtenido mutantes de M.purpureus IB1, de baja producción debidos a la disminución sumultanea de todos los pigmentos tipo azafilona clásicos, determinándose de su estudio que el color de dichos mutantes es función de pigmentos adicionales, además de los pigmentos clásicos. Mediante la técnica REMI se han obtenido transformantes apigmentados sugiriendo que la integración de éstos se produce en un paso inicial común de la biosíntesis de los pigmentos.

Autor: ANTONIO PÉREZ M. CARMEN DE.
Año: 2002.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGÍA .
Centro de realización: UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID.

Resumen: La alfa-sarcina es una citotxina secretada por Aspergillus giganteus que contiene dos triptófanos conservados en las posiciones 4 y 51. Se han preparado dos mutantes individuales, sustituyendo cada residuo por uan Phe. Los dos mutantes individuales, y el doble, se han producido, aislado y purificado. Además, se han caracterizado estructural y enzimáticamente, y se ha estudiado su capacidad para interaccionar con vesículas de fosfolípidos. De acuerdo con los resultados, ninguno de los dos triptófanos es necesario para que la enzima tenga su actividad ribonucleolítica específica frente a los ribosomas. La resonancia magnética nuclear de protón revela que la estructura global de la enzima se mantiene tras las mutaciones. Ello ha permitido evaluar la contribución individual de cada uno de los Trp a los espectros de dicroísmo circular y de emisión de fluorescencia de la proteína. La termoestabilidad de los mutantes, por el contrario, sí es menor. En cuanto al estudio de la interacción con los lípidos, se ha puesto de manifiesto que al unirse a las membranas se destabiliza la proteína. Sin embargo, no cambia su patrón de interacción con vesículas modelo compuestas por fosfolípidos ácidos, en términos de agregación de las mismas, mezcla de lípidos o pérdida de contenidos acuosos. Todos estos estudios han permitido definir, tras la interacción de los mutantes purificados con vesículas lipídicas en las que se había incorporado antraceno, que el Trp-51 se incorpora a la región hidrofóbica de la bicapa. Este resultado indica que la región que rodea a este residuo se localiza en el nucleo hidrofóbico de la proteína que es responsable de su capacidad para atravesar membranas.

Autor: RODRÍGUEZ FERNÁNDEZ YOEL.
Año: 2002.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: QUÍMICA.
Centro de realización: FACULTAD CC. QUÍMICAS.

Resumen: Se estudia, desde un punto de vista teórico, la transmisión de oscilaciones de concentración de metabolitos a través de rutas metabólicas con cinéticas tipo Michaelis-Menten. En una primera aproximación se examinan los sistemas secuenciales y ramificados que convergen a un punto con dinámicas lineales. De aquí resultan expresiones analíticas de la relación entre las amplitudes de salida y entrada (amortiguamiento) y de los desfases de las velocidades de cada peso de reacción con el flujo de entrada y entre sí. Se muestra que a efectos de la transmisión de señales sinusoidales las enzimas michaelianas presentan aproximadamente un comportamiento lineal alrededor del fujo medio de entrada, con independencia de la amplitud de la onda. Por ello, es posible predecir las propiedades de dicha transmisión a partir de sus correspondientes sistemas lineales siempre que se conozcan las constantes de velocidad de primer orden efectivas. De la misma forma, se ha demostrado que los sistemas ramificados enzimáticos con enzimas cinéticamente diferentes (a efectos de la transmisión de las señales sinuosidales) se pueden reducir a rutas secuenciales para un conjunto dado de actividades enzimáticas. Además, se ha concluido que las enzimas que mejor transmitirán una señal oscilatoria sinusoidal, serán aquellas que trabajen a baja saturación e irreversiblemente. Por otra parte, con el objetivo de caracterizar temporalmente a los sistemas biológicos, se ha propuesto la definición de una magnitud llamada Tiempo Característico, Tc, que permiten el cálculo del tiempo promedio que tardan las transiciones que involucran dinámicas tipo nodo, foco y ciclo límite estables. Asimismo, a partir de esta nueva magnitud (Tc) se introduce una variable promedio que mide el tiempo que tardan las transiciones que impliquen, en el estado inicial o final o ambos, comportamientos oscilatorios. Finalmente, se ha propuesto un método de cálculo, basado en estudios de mecánica estadística, para determinar los tiempos de tránsito de rutas metabólicas que contengan intermediarios que se escindan. De la misma manera, se ha sugerido la posibilidad de obtener el número de especies que conforman un sistema sin necesidad de conocer sus cinética y mecanismo, siempre que se conozca la densidad de probabilidad del tiempo de tránsito.

Autor: LEDO GÓMEZ FRANCISCO.
Año: 2002.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGÍA.

Resumen: Estudio de un factor de transcripción denominado DREAM (Carrión y cols., 1999), clonado durante la caracterización del promotor del gen de prodinorfina humana. La capacidad de DREAM de unirse a una región específica de ADN (DRE - Elemento Regulador Downstream - posterior a la caja TATA) está controlada de manera directa por calcio o por la interacción con elementos de la vía de señalización del AMPc. De esta manera DREAM no sólo se convierte en punto de convergencia entre las vías de calcio de AMPc sino que también es el primer factor de transcripción regulado directamente por calcio sin mediar procesos fosforilativos. Tras su clonaje en nuestro laboratorio, se abrió ante nosotros la posibilidad de estudiar sus dominios funcionales así como sus principales funciones en el control de la transcripción de determinados genes diana