BIOQUIMICA MOLECULAR, 9

Autor: GÓMEZ VILLAFUERTES M. ROSA.
Año: 2002.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA.

Resumen: Las terminaciones nerviosas de cerebro medio poseen receptores ionotrópicos P2X y de dinucleótidos que permiten la entrada de calcio al interior del terminal. Los receptores P2X son activados por ATP y su perfil farmacológico indica que están constituidos mayoritariamente por subunidades P2X3. En cuanto a las propiedades farmacológicas del receptor de dinucleótidos, parece que la longitud de la cadena de grupos fosfato y, especialmente, la estructura del anillo de purina son determinantes en el efecto de los polifosfatos sobre su receptor específico, mientras que modificaciones en la estructura del azúcar no parecen desempeñar un papel fundamental en dicho efecto. Tras analizar la interacción existente entre el sistema GABAérgico y el sistema purinérgico a nivel presináptico, se observó que la activación de los receptores metabotrópicos GABAB potencia tanto la máxima entrada de calcio a través de los receptores nucleotídicos como la afinidad de éstos por sus agonistas. Esta potenciación se debe a la inhibición de la adenilato ciclasa por activación de los receptores GABAB. Como consecuencia, se reduce la actividad PKA del terminal sináptico, favoreciendo así el estado defosforilado de los receptores nucleotídicos. La activación de los receptores P2X y de dinucleótidos induce la liberación exocitótica de GABA.

Autor: CAMPOS GONZÁLEZ YOLANDA.
Año: 2002.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: C. INVESTIGACIÓN HOSPITAL 12 DE OCTUBRE DE MADRID.

Resumen: Este estudio presentado como memoria de la tesis doctoral "Estudio del ADN mitocondrial en miopatías mitocondriales" es un reflejo del trabajo realizado en una unidad de referencia para el estudio de las enfermedades mitocondriales en España, e incluye todos los casos diagnosticados que se han remetido al Hospital 12 de Octubre en los últimos años. El 25% de los pacientes de nuestra serie mostraron alguna alteración genética en el ADN mitocondrial. Las mutaciones más frecuentes fueron los reagrupamientos, que incluyen las deleciones únicas y múltiples. El fenotipo clínico predominante en los pacientes con deleción única fue el Síndrome de Kearns-Sayre y en aquellos con deleciones múltiples la miopatía ocular. La mutación puntual A3243G y en menor medida la A8644G también se hallaron en un número significativo de pacientes, asociadas mayoritariamente a encefalomiopatías tipo MELAS y MERRF respectivamente. No obstante, se ha demostrado que existe un cierto grado de heterogeneidad clínica y respectivamente. No obstante, se ha demostrado que existe un cierto grado de heterogeneidad clínica y genética. También se documentan en el presente trabajo las frecuencias de otras mutaciones conocidas en el ADNmt como las ligadas a la enfermedad de Leber y a los síndromes NARP/Leigh de herencia materna. Las frecuencias de todas estas mutaciones se incrementaron notablemente cuando se buscaron sólo en los pacientes que presentaron signos de proliferación mitocondrial en la biopsia muscular (i.e., fibras rojo-rasgadas). En este trabajo también se documenta que el tRNALeu (UUR) es la región del ADNmt con más alta probabilidad de mutación. Así mismo se describen 5 nuevas mutaciones presumiblemente patogénicas según los criterios canónicos establecidos. En 4 de ellas (T3258C, T3273C, A3280G, G7896A), se demuestra su patogenicidad por medio de PCR en fibra muscular aislada. Los estudios de proteínas mitocondriales muestran que otra mutación, la T3308C no tiene significado patogénico, y establecen el posible mecanismo molecular del déficit del complejo IV de la cadena respiratoria en el paciente con la mutación G7896A. En una familia en la que se demuestra la coexistencia de dos mutaciones previamente descritas en el tRNALys, G8363A y A8296G, se desarrollan cíbridos transmitocondriales a fin de establecer la relativa contribución de ambas al fenotipo clínico. Los estudios en cíbridos demuestran que la mutación G8363A es inequívocamente patogénica porque su respiración es deficitaria, producen altas tasas de lactato y muestran déficits combinados de los complejos de la cadena respiratoria dependientes de ADNmt. Por el contrario la mutación A8296G tiene un comportamiento similar a los controles.

Autor: GONZÁLEZ BARDERAS M. EUGENIA.
Año: 2002.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: UCM. F. CC. BIOLÓGICAS.

Resumen: La búsqueda de sistemas alternativos a los costosos y complejos métodos de expresión de proteínas recombinantes se ha convertido en un objeto de estudio de gran cantidad de laboratorios de investigación. A esto debemos añadir la cuestión de la seguridad biológica no asegurada con el empleo de sueros de animales y células de mamífero, capaces ambos de transmitir patógenos a hombres y animales. La presente Tesis Doctoral pretende dar solución a estas cuestiones al introducir por primera vez en España una tecnología poco difundida y no puesta a punto previamente en nuestro país, la utilización combinada de baculovirus recombinantes y larvas de Trichoplusia ni como biofactorías. Este sistema, de larvas de insecto, ofrece una mejor alternativa, debido principalmente, al bajo coste en el que se desarrolla la producción a gran escala comparado con los cultivos celulares (Praskash K.Jha y col., 1992; Medin y col., 1990) y porque se producen proteínas recombinantes en un orden de 50-500 veces más cantidad en larvas que en líneas celulares (Gunne H., y col., 1990).

Autor: ZANNA INES.
Año: 2002.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: SERVICIO DE BIOLOGÍA TUMORAL, HOSPITAL CLÍNICO SAN CARLOS MADRID.

Resumen: OBJETIVO El carcinoma escamoso de laringe o LSCC (Laryngeal Squamous Cell Carcinoma) representa más del 95% de las neoplasias de laringe. El objetivo de este trabajo es el estudio de los factores biológicos implicados en el carcinoma escamoso de laringe: actividad proliferativa (SPF), contendio celular de DNA y la determinación de posibles alteraciones genéticas en el gen supresor p16, pérdida de heterocigosidad en el locus 9p21(LOH), metilación del promotor y mutaciones puntuales. PACIENTES Y MÉTODO Este estudio se realizó en 64 pacientes intervenidos quirúrgicamente de cáncer de laringe. Se realizó la evaluación de la ploidía y de la SPF mediante citometría de flujo. Para la valoración de la LOH en el gen p16 se realizó extracción de DNA, PCR del marcador D9S1747 en la región 9p21 y electroferesis en un gel de pliacrilamida al 8% y tinción con nitrato de plata. Para la valoración del estado de metilación se hizo una MSP (Methylation Specific PCR) de la región promotora del gen p16 después del tratamiento con bisulfito. Las mutaciones en el gen p16 fueron detectadas mediante análisis SSCP después de la amplificación mediante PCR de los exones 1 y 2. RESULTADOS Se detectó aneuploidía en el 66% de los pacientes y de ellos el 10% presentaban multiclonalidad. Se detectó una elevada actividad proliferativa en el 48% de los pacientes analizados. En nuestra serie de pacientes, el 25% presentaba LOH en la región 9p21 (locus D9S1747) y el 9% tenía metilación del promotor.

Autor: FERNÁNDEZ MORENO CARMEN.
Año: 2002.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: El IGF-I (Insulin-Like growth factor I) y la citoquina LIF (Leukemia inhibitory factor) son factores de ación paracrina/endocrina multifuncionales que, dependiendo del contexto celular, regulan la supervivencia, la proliferación o la diferenciación celular y la expresión génica. Ambos están expresados y modulados durante el desarrollo tardío en el sistema nervioso, pulmón, músculo y otros tejidos. LIF actúa a través de un receptor dimérico (LIFR-gp 130) que se asocia con quinasas JAK citoplásmicas, las cuales activan proteínas STAT. Existe una convergencia de este sistema con el sistema de señalización de las proteínas IRS, sustratos del receptor de IGF-I. Estudios previos habían demostrado la regulación de IGF-I por LIF en nervio periférico. Una aproximación global para estudiar las interaciones funcionales in vivo entre LIF e IGF-I ha sido la generación de ratones doble mutantes. Tras los cruces entre dobles heterocigotos para los genes LIF eIGF-I, todos los ratones mutantes para ambos factores murieron al nacimiento, sugiriendo una sinergia entre LIF e IGF-I para funciones vitales. En embriones de 18.5 días (E18.5), la falta de LIF agravó el retraso en el crecimiento y las anomalías de músculo y pulmón presentes en los ratones mutantes para IGF-I. En SNC, una estructura conocida que requiere IGF-I para mantener postnatalmente un número normal de neuronas, es el bulbo olfatorio. La ausencia de IGF-I disminuye notablemente el número de neuronas mitrales en E18.5 y la deficiencia podría depender de la acción de LIF. El crecimiento postnatal de los supervivientes muestra dimorfismo sexual, siendo las hembras LIF-1- IGF-I+/- las más retrasadas. Estos dos factores de crecimiento/citoquinas forman parte, por tanto, de una red de señalización esencial en el desarrollo normal, prenatal y postnatal.

Autor: VÁZQUEZ PÉREZ PATRICIA.
Año: 2002.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FARMACIA.

Resumen: El péptido relacionado con el glucagón de tipo 1 (GLP-1), está implicado en muchas funciones biológicas, como son el aumento de al secreción de insulina dependiente de glucosa, así como la estimación de la presión arterial y producción de surfactante pulmonar. A nivel central el GLP-1(7-36)amida estimula la liberación selectiva de neurotransmisores y participa en la regulación de procesos tales como la ingesta de alimentos y agua, la temperatura corporal y el control de ciertas funciones cardiovasculares. Su posible utilidad terapeútica requiere un conocimiento detallado del funcionamiento y mecanismo de respuesta de este péptido tras su unión con su receptor. El receptor del GLP-1(7-36)amida, pertenece a la familia de receptores acoplados a proteínas G. En esta tesis se ha estudiado la implicación del dominio carboxilo terminal del receptor de GLP-1(7-36)amida en los procesos de unión al agonista, transducción de señales y endocitosis, mediante mutaciones puntuales o delecciones de este dominio citoplasmático del receptor. De este trabajo se deduce que las mutaciones realizadas en el extremo carboxilo terminal no alteraron la afinidad del ligando por los receptores modificados. Este dominio interviene en la regulación de la transducción de señales generadas desde el receptor, tanto la estimulación de la adenilato ciclasa como la fosforilación de miembros de la ruta de las MAPK. Además regiones concretas del extremo carboxi-terminal controlan los procesos endocíticos y regulan de manera positiva o negativa la internación del receptor. La mayoría de los receptores acoplados a proteínas G sufren modificaciones postraduccionales, la palmitoilación de residuos de cisteína una de las más frecuentes. La sustitución de una cisteína del extremo carboxilo terminal del receptor de GLP-1, que al igual que se describió para otros miembros de esta familia de receptores, podría sufrir procesos de plamitoilación, alteró la transducción de señales, disminuyendo drásticamente la producciónd e AMPc, aunque no modificó su tasa de endocitosis. Por todo ello se deduce que el dominio carboxi-terminal es fundamental en la señalización del receptor de GLP-1.

Autor: HERRERA GONZÁLEZ BLANCA.
Año: 2002.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA - UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID.

Resumen: El TGF-beta es una proteína multifuncional que ha sido implicada en el control de diferentes procesos celulares como proliferación, diferenciación y apoptosis. En este trabajo se han estudiado los mecanismos por los que el TGF-beta induce apoptosis en hepatocitos fetales en cultivo primario. El TGF-beta produce muerte en este modelo celular por un mecanismo dependiente de la producción de radicales libres de oxígeno (ROS) y caracterizado por la participación de la mitocondria. Los ROS son responsables de la caída en el potencial de membrana mitocondrial, de la salida de citocromo c de este orgánulo al citosol, de la activación de caspasas (cisteín-proteasas) y la caída en los niveles de Bcl-xL (una proteían antiapoptótica de la familia Bcl-2). Las caspasas forman parte de un mecanismo de amplificación del proceso de muerte, ya que su activación provoca la caída del potencial de membrana mitocondrila, la liberación tardía y masiva del citocromo c y la proteolisis de Bcl-xL, Bid y cIAP-1. Tanto JNK como p38MAPK son activadas por el TGF-beta. Sin embargo, la activación de JNK no está relacionada ni con el estrés oxidativo ni con la apoptosis inducidas por este factor. Los ROS son responsables de la activación de p38MAPK, pero ésta no está implicada en el mecanismo de muerte disparado por el TGF-beta. Así mismo, se han estudiado dos modelos de rsistencia a la apoptosis inducida por el TGF-beta. Por un lado, hemos comprobado que los hepatocitos regenerantes en cultivo primario presentan altos niveles de proteínas antiapoptóticas Bcl-xL, cIAP-1 y cIAP-2. Por otro lado, el EGF bloquea el estrés oxidativo inducido por el TGF-beta y es capaz, por un mecanismo dependiente de PI 3-K, de impedir los eventos mitocondriales, la caída en los niveles de Bcl-xL, la activación de caspasas y la muerte inducidas por el TGF-beta en hepatocitos fetales.

Autor: MUR PÉREZ CECILIA.
Año: 2002.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: La insulina y el IGF-I son dos señales biológicas implicadas en proliferación, diferenciación y supervivencia. Para llevar a cabo sus acciones deben interaccionar con los receptores de membrana específicos que pertenecen a la familia de los receptores tirosina quinasa. La unión del lignado a su receptor pone en marcha una cascada de fosforilaciones que activa dos vías fundamentales: la ruta de la PI3-quinasa y la ruta de las MAPK. Si bien las acciones finales de IGF-I e insulina no son las mismas, hasta el momento no se han detectado diferencias sustanciales en la cascada de transducción de señales entre ambas molécular. Los adipocitos marrones presentan de forma fisiológica un elevado número de receptores tanto de IGF-I como de insulina. La falta del receptor de IGF-I en los adipocitos marrones durante el desarrollo origina cambios profundos en dichas células, produciéndose una alteración en la ruta de transducción de señales de la insulina. Los adipocitos marrones experimentan un aumento de la sensibilidad a la insulina, que se traduce en la mayor estimulación de la cascada de las MAPK y de la PI-3 quinasa. El origen de esta ganancia de función parece encontrarse en la pérdida de actividad de la fosfatasa PTP1B, encargada en las células salvajes de la defosforilación del receptor de insulina y del IRS-1. Como consecuencia se produce una mayor respuesta proliferativa de la insulina de los adipocitos marrones sin receptor de IGF-I. Sin embargo, la sobreactivación de la cascada de la PI3K/Akt no es suficiente para compensar la falta del receptor de IGF-I en la diferenciación de los adipocitos marrones. En estas células la insulina no es capaz de inducir adecuadamente los factores de transcripción involucrados en diferenciación adipogénica y termogénica. Otros parámetros metabólicos como la incorporación de glucosa al interior celular no se encuentran alterados. Por otra parte, la falta de receptor de IGF-I durante el desarrollo predispone a las células a la apoptosis, aumentado los niveles de proteínas propapotóticas como Bim y disminuyendo la expresión de proteínas antiapoptóticas como Bcl-2 y Bcl-xL, además de favorecer una activación más rápida del factor de transcripción FKHR, implicado en muerte celular. A pesar de la falta del receptor de IGF-I la insulina es capaz de recatar a los adipocitos marrones de la muerte celular inducida por retirada de suero, estando potenciada en estas células la vía de rescate a través de MAPK.

Autor: RIVEIRO CRUZ MANUEL ALBERTO.
Año: 2002.
Universidad: SANTIAGO DE COMPOSTELA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGÍA.

Resumen: Las diferencias interindividuales en la capacidad metabólica para convertir procarcinógenos en carcinógenos, o para inactivar sustancias carcinógenas, podrían tener un papel en el riesgo relativo de padecer cáncer. Donde acontece un polimorfismo funcional, la existencia de dos o más fenotipos puede tner un efecto profundo en la disponibilidad, y así en los efectos biológicos, de los substratos. En un número limitado de estos casos, el substrato, o uno o más de sus metabolitos, es cancerígeno y, por tanto, el polimorfismo tiene el potencial de determinar, en parte, la "dosis" de carcinógeno reactivo que alcanza la célula diana sensible, o que se forma dentro de ella. La hipótesis que se plantea es que las diferencias interindividuales en la susceptibilidad al desarrollo de broncocarcinoma están determinadas, en parte, por el perfil genético individual, más concretamente, por las variantes alélicas que expresa el individuo para los loci relacionados con el metabolismo de xenobióticos. De acuerdo con esta hipótesis, los objetivos que nos planteamos se desglosan en los siguientes términos: 1,- Establecer la relación existente entre las variantes alélicas para cada uno de los locus considerados y el desarrollo de cáncer de pulmón, mediante la estima del riesgo relativo. 2,- Valorar las relaciones existentes entre las diferentes combinaciones alélicas de los loci considerados y el riesgo de broncocarcinoma. 3,- Investigar posibles interacciones entre uno o varios de los marcadores genéticos analizados y factores constitucionales (edad, sexo) o ambientales (hábitos de tabaquismo, residencia). El presente estudio fue diseñado siguiendo un modelo general de casos y controles. Los individuos incluidos fueron reclutados entre 1995 y 1998 en las áreas sanitarias de A Coruña y Santiago de Compostela. Se incluyeron en el estudio 131 pacientes (124 hombres y 7 mujeres) diagnosticados de broncocarcinoma primario (74 carcinomas de células escamosas, 29 carcinomas de células pequeñas, 14 adenocarcinomas, 5 carcinomas de células grandes y 9 otros diagnósticos). De acuerdo con los criterios de inclusión y exclusión, fueron seleccionados como sujetos control. 208 individuos (154 hombres y 54 mujeres). Se analizaron los siguientes polimorfismos genéticos: CYP1A1 Ile462Val; Genotipo nulo GSTM1; EPHX1 His139Arg; NAT2* T341C, C481T, G590A, A803G y G857A. Los fenotipos moleculares fueron caracterizados mediante estrategias basadas en la reacción en cadena de la polimerasa. La distribución de frecuencias fenotípicas de los loci aquí considerados se ajusta a un modelo panmíctico de la población perfilando valores de frecuencias alélicas que se enmarcan en el rango de otras poblaciones europeas analizadas. Cuando consideramos globalmente el cuadro de broncocarcinoma sin diferenciar el tipo histológico, no exite evidencia estadística de que, individualmente, ninguno de los marcadores genéticos analizados constituya un factor de riesgo singnificativo en el desarrollo de broncocarcinoma. El riesgo asociado con la variabilidad genética en las enzimas metabolizadoras de xenobióticos varía en función del tipo de broncocarcinoma y de la exposición individual al tabaco. Así, el genotipo nulo GSTM1 incrementa el riesgo de desarrollar un carcinoma de células escamosas entre aquello individuos fumadores ligeros-moderados (OR=2,80 IC95%=1,08-7,27; p=0,04), pero no entre grandes fumadores (OR=1,30 IC95%=0,49-3,48; p=0,60). Por su parte, los homogocigotos para el alelo EPHX1 462 Val tienen mayor riesgo de presentar un cuadro de carcinoma de células pequeñas entre los individuos con historial de tabaquismo ligero-moderado (OR=9,49 IC95%=1,13-78,81; p=0,04). Sin embargo, no hay evidencia estadística que permitia establecer una asociación entre este genotipo y el riesgo de carcinoma de células pequeñas entre grandes fumadores. (p>0,999). Asimismo, se observa un incremento significativo del riesgo de carcinoma de células escamosas entre aquellos individuos fumadores ligeros-moderados con la combinación del genotipo nulo GSTM1 y el genotipo CP1A1 Ile/Val (OR=5,31 IC95%=1,16-24,39; p=0,03).

Autor: BUGÍA VÁZQUEZ M. BEGOÑA.
Año: 2002.
Universidad: SANTIAGO DE COMPOSTELA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTADE DE BIOLOXÍA.

Resumen: Protimosina alfa (Pro Talfa) es una proteína altamente acídica con una estructura primaria carente de residuos aromáticos y azufrados, aislada inicialmente de timo de rata por Haritos y colaboradores en el año 1984. En un principio, se pensó que Pro Talfa era secretada al medio extracelular, con la consecuente existencia de un receptor en la superficie de la membrana plasmática. Sin embargo, la ausencia de una región hidrófóbica que permitiese una asociación a membranas celulares para así alcanzar el medio extracelular, ha creado diferentes opiniones en el mundo científico. De esta forma algunos la relegan a un ambiente exclusivamente nuclear, mientras otros postulan un ambiente citoplasmático con la posibilidad de su secreción al medio extracelular, ya que hoy día es conocido que alguna proteínas son secretadas sin seguir la vía clásica. El hecho central que hace que postulemos la existencia de un receptor en la superficie celular, es consecuencia del papel inmunorregulador que desempeña Pro Talfa. Los efectos y respuestas desencadenados por esta proteína son cuantiosos, tanto que hoy en día ha provocado que se lleven a cabo una serie de estudios que centran el papel inmunorregulador de Pro Talfa como una posible vía terapéutica en procesos tumorales. Los péptidos tímicos poseen una gran cantidad de efectos de tipo inmunorregulador. Sin embargo, el estudio de las posibles moléculas receptoras que medien estos efectos son muy escasos, reduciéndose a estudios de tipo cinético y de competencias, y a ensayos llevados a cabo por microscoía, no existiendo datos por el momento que revelen la identidad ni composición de estos sitios de unión. A mediados de los años noventa, estudios realizados por nuestro grupo de investigación, pusieron de manifiesto la existencia de receptores celulares para Pro Talfa. El descubrimiento de lugares de unión en la superficie de células linfoides ha dado lugar al inicio de un exhaustivo trabajo en la búsqueda del receptor o receptores para esta proteína. En este trabajo nos hemos propuesto poner apunto un método que permita purificar los receptores o lugares de unión específicos de Pro Talfa en la superficie de linfoblastos humanos, e identificar estas proteínas mediante espectrometría de masas y diferentes tratamientos bioinformáticos. La metodología empleada para conseguir estos objetivos se basó principalmente, en plantear una cromatografía de afinidad en la que el ligando a la matriz fuese Pro Talfa y como material fuente de receptores celulares la membrana plasmática de linfoblastos humanos. Al principio los rendimientos proteicos obtenidos en nuestros experimentos eran limitantes, (aunque este suceso era de esperar puesto que los receptores de superficie celular representan menos del 0,1% de la masa total de la proteína de la membrana plasmática) obteniendo bandas en geles de poliacrilamida-SDS de 31, 29 y 19 kDa. Sin embargo, el momento central de nuestra investigación se alcanzó cuando decidimos utilizar fracción raft de linfoblastos humanos como fuente de receptores, una vez demostrado por el grupo de investigación mediante experimentos de crosslinking con Pro Talfa biontinilada a la superficie de linfoblastos, que el receptor de Pro Talfa parecía hallarse con zona raft. De esta forma, purificando este microdominio de membrana y realizando una cromatografía de afinidad seguida de un análisis electroforético y tinción con nitrato de plata, conseguimos aislar e identificar por espectrometría de masas bandas de una Mr de 45, 43, 31, 29 y 27 kDa atribuibles a la actina, Ubiquinol citocromo c reductasa, Adenina nucleótido translocasa 2, Calmodulina y una subunidad de 24 kDa de la NADH ubiqinona oxido-reductasas, respectivamente. En este trabajo hemos realizado una valoración sobre el método de purificación de zona raft, así como el planteamiento de una hipótesis justificada que permite dar una explicación a la presencia de estas especies en el eluido cormoatográfico, fruto de su interacción específica directa e indirecta con Pro Talfa. Por último encontramos una banda de una Mr aproximada de 35-32 kDa que, mediante su análisis por MALDI-TOF y secuenciación manuel por nESI-IT MS/MS no obtuvo identificación conocida en las bases de datos bioinformáticas, presentándose como una firme candidata a ser receptor o parte del receptor de fracción raft de membrana para Pro Talfa.

Autor: LEAL CORTIJO ISABEL.
Año: 2002.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: CIENCIAS .
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: Plasmodium falciparum es un parásito protozoo apicomplexo causante de la malaria, una enfermedad que afecta a 300-500 millones de personas y a la que unos 2400 millones están expuestas. La gran versatilida, tanto biológica como bioquímica del parásito le permite desarrollar mecanismos de resistencia con una rapidez tal, que supera el tiempo necesario para el desarrollo de nuevos fármacos o una vacuna, por lo que es necesario la caracterización de nuevas enzimas blanco de acción de fármacos. En este trabajo de Tesis Doctoral se estudia la desoxiuridina 5'-trifosfato nucleótido hidrolasa (dUTPasa) como potencial blanco de acción de fármacos. La enzima cataliza la hidrólisis de dUTP a dUMP y pirofosfato, desempeñando una papel biológico esencial en el control de los niveles intracelulares de dUTP e impidiendo una incorporación tóxica de uracilo al DNA. Se ha identificado y clonado el gen que codifica la dUTPasa a partir del clon 3D7 de P.falciparum. El gen que codifica para la enzima presenta una alta similitud con las secuencias de dUTPasa triméricas descritas en otros organismos y posee los cinco motivos consenso característicos de esta familia. Sin embargo presenta una inserción rica en lisina y aspártico entre el primero y el segundo motivo que es exclusiva de especies de Plasmodium. Se ha llevado a cabo la sobreexpresión de la proteína recombinante en E.coli utilizando el sistema de expresión pET. La proteína recombinante se purifició y se llevó a cabo una caracterización cinética exhaustiva, así como la determinación de ciertas características físico-químicas. Se determinó que la unidad funcional de la enzima es un trímero con unos parámetros cinéticos semejantes a los encontrados en otras dUTPasas en cuanto a hidrólisis del dUTP y especificidad de sustrato. En otra parte del trabajo realizado se ha estudiado la localización intracelular de la enzima en las formas intraeritrocíticas del parásito y se ha observado que tanto su localización como los niveles de expresión son estadío-dependientes. También se ha realizado un modelo estructural de la enzima a partir de la estructura de la enzima humana formando un complejo con dUP, que revela que la inserción característica de Plasmodium se sitúa en las proximidades del centro activo y podría tener implicaciones en el proceso de unión de inhibidores análogos del dUTP frente a la enzima de P.falciparum y la humana y los diferentes perfiles de inhibición obtenidos sugieren que es posible la inhibición selectiva de la enzima protozoaria. El estudio de mutantes de la enzima en los que se eliminaron parcial y totalmente aminoácidos procedentes de la inserción revelaron que dicha región es importante en el mantenimiento de la estructura terciaría y actividad catalítica de la enzima ya que la eliminación total o parcial de la misma da lugar a proteínas con variaciones drásticas en los parámetros cinéticos respecto a la proteína nativa.

Autor: GODOY ALBA PATRICIA.
Año: 2002.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: ESTACIÓN EXPERIMENTAL DEL ZAIDÍN (C.S.I.C).

Resumen: Pseudomonas putida DOT-T1E es una cepa altamente tolerante a disolventes orgánicos como el tolueno, una característica que la hace sumamente atractiva en el campo de las biotransformaciones en sistemas de dobel fase. Un ejemplo concreto lo constituye la síntesis de p-hidroxibenzoato (PHBA), un compuesto de alto valor añadido en la industria, a partir de tolueno. Puesto que la tolerancia de DOT-T1E a PHBA y otros compuestos hidroxilados estaba inexplorada, en este trabajo se emprendió la caracterización fisiológica de la tolerancia de DOT-T1E a estos compuestos y la elucidación de las bases moleculares implicadas en la misma. Con el objetivo de encontrar aquellos genes que estuviesen implicados en la tolerancia y/o sensibilidad a este aromático, se generaron mutantes de DOT-T1E con el transposón mini-Tn5'phoAKm para así seleccionar aquellos clones que presentaran un incremento en la tolerancia o por el contrario fueran más sensibles a PHBA. Se aisló un mutante que presentó un notable descenso en la tolerancia a PHBA, denominado PhoA5. El análisis de la mutación indicó que el minitransposón se insertó en el gen exbD, perteneciente al sistema exbBDtonB, que está implicado en el transporte de ferrisideróforos y vitamina B12 al interior de las células. Asimismo, para desvelar la implicación de cada uno de los componentes del sistema ExbBDTonB en la tolerancia a PHBA, se construyeron mutantes dirigidos en cada uno de los genes del sistema por reemplazamiento génico y se analizó su fenotipo. Todos los mutantes, incluido el mutante por transposición PhoA5, necesitaron un suplemento extra de hierro para su crecimiento óptimo, y resultaron más sensibles a PHBA y tolueno que la cepa silvestre. Estos resultados pusieron de manifiesto la importancia del sistema ExbBDTonB en la tolerancia a PHBA y tolueno que presenta la cepa DOT-T1E, probablemente a través de la energetización de las bombas de eflujo.

Autor: SÁEZ LARA M. JOSÉ.
Año: 2002.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: FARMACIA .
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: Durante los últimos cinco años, nuestro grupo de investigación ha estudiado los efectos de la adición de nucleósidos al medio de tres sistemas distintos de cultivo de células: cultivos de hepatocitos primarios de ratas adultas, cultivos de una línea de células estelares hepáticas y, finalmente, un co-cultivo de ambos tipos de células. Los resultados de estos trabajos indican que los nucelósidos son captados por las células, produciendo modificaciones de las concentraciones intracelulares de nucleótidos, lo cual, a su vez, repercute en cambios en la expresión de los componentes de matriz extracelular. Del mismo modo, los nucleósidos aumentaron la funcionalidad celular. En ninguno de los modelos, sin embargo, los nucleósidos modificaron la proliferación celular. Para investigar la hipótesis de que los nucleósidos exógenos son capaces de modular la proliferación de las células hepáticas, en el presente trabajo de investigación hemos utilizado como modelo el cultivo de hepatocitos fetales de rata. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de los nucleósidos adicionados al medio de cultivo de hepatocitos fetales de rata sobre parámetros de viabilidad, proliferación y funcionalidad celular, así como sobre la expresión de genes de proliferación, funcionalidad y apoptosis. Los resultados del trabajo indican que: 1,- Los nucleósidos adicionados al medio de cultivo fueron captados de manera selectiva por los hepatocitos fetales de rata. 2,- Los nucleósidos exógenos aumentaron el contenido intracelular de nucleótidos solubles. 3,- Los nucleósidos exógenos no producen efectos tóxicos en el cultivo de hepatocitos fetales de rata en un rango de concentración 10-100 uM. 4,- La adición de nucleósidos estimuló la proliferación de los hepatocitos fetales. 5,- Los nucleósidos exógenos aumentaron la funcionalidad, contribuyendo al mantenimiento del estado desdiferenciado de los hepatocitos fetales.

Autor: JIMÉNEZ JIMÉNEZ M. CARMEN.
Año: 2002.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: INSTITUTO DE PARASITOLOGÍA Y BIOMEDICINA "LÓPEZ-NEYRA" (C.S.I.C.).

Resumen: El protozoo parásito Leishmania major es el agente causal de una de las enfermedades infecciosas que afectan a mayor número de personas a nivel mundial. Actualmente existen alrededor de 350 millones de individuos expuestos a la enfermedad, de los cuales cerca de 12 millones de manifiestan, apareciendo 1.5-2 millones de casos nuevos al año. Hoy en día la asociación de leishmaniasis visceral con el SIDA se considera una enfermedad emergente. Teniendo en cuenta que no existe ninguna terapia totalmente efectiva frente a la infección, que los fármacos utilizados son muy tóxicos y la aparición de resistencias a ellos por parte del parásito, hace necesario buscar nuevas estrategias para combatir la enfermedad. La biosíntesis de esteroles es una de las rutas más complejas en células eucariotas, en la que intervienen numerosas enzimas que participan en reacciones altamente específicas. Existen numerosas inhibidores específicos que bloquean distintas enzimas de la ruta, que han demostrado su actividad antiproliferativa frente a Leishmania. En tripanosomátidos, el principal esterol sintetizado es el ergosterol, que difere del colesterol, mayoritario en mamíferos, en la presencia de un grupo metilo en la posición 24 del núcleo esteroide. La reacción de metilación es catalizada por la enzima A24,(25) -esterol metiltransferasa (SMT), que está ausente en mamíferos. La escasa información existente en la literatura sobre esta eznima, así como su potencial como posible diana farmacólogica en el tratamiento de enfermedades producidas por Leishmania, motivaron el establecimiento de los objetivos de este trabajo. Se ha aislado el gen estructural que codifica la proteína SMT de L.major. Se trata de un gen de copia única, que se transcribe dando lugar a un mRNA de 4.4 kb y se encuentra localizado en un cromosoma de un tamaño mayor de 2.2 kb. Presenta una pauta abierta de lectura de 1059 nucleótidos que codifica una proteína de 353 aminoácidos, la cual tiene elevada identidad con SMTs de otros organismos. La proteína recombinante se expresa de forma soluble en un sistema heterólogo fusionada a una cola de 6 histidinas en su extremo amino. Intentos de truncación del extremo carboxilo de la proteína, altamente hidrofóbico, con el fin de aumentar la solubilidad, dan lugar a una pérdida de actividad enzimática, indicando que el extremo carboxilo desempeña un papel esencial en la función de la SMT. Se ha caracterizado cinéticamente la proteína recombinante de fusión (His-LmSMT), mediante la determinación de los valores de Km y Vmax, resultando ser del mismo orden que los descritos para la enzima de S.cerevisiae. La proteína de Leishmania presenta mayor afinidad por el sustrato desmosterol que por el lanosterol, que está trimetilado. Los ensayos de inhibición realizados con extractos de E.coli que sobreexpresan la enzima muestran que el 22,26-azasterol la inhibe de forma efectiva, con una IC50 de 0,78 uM. Se han obtenido mutantes de L.major que sobreexpresan la proteína SMT. Los estudios de inhibición del crecimiento de mutantes que sobreexpresan la proteína SMT no muestran un fenotipo de resistencia al 22,26-azasterol. Sin embargo, al combinar concentraciones subletales de ketoconazol y dicho azasterol se produce un efecto sinérgico y se observa una revisión del fenotipo de sensibilidad en los transfectantes que sobreexpresan la proteína, lo que pone de manifiesto un mecanismo de acción específico de SMT de este compuesto utilizado a bajas concentraciones. Estudios de modulación de la SMT en promastigotes salvajes tratados con 22,26-azasterol muestran una disminución de la expresión de la proteína frente a parásitos no tratados, indicando la existencia de una regulación negativa de los niveles de enzima mediada por este compuesto. Experimentos de inmunocitoquímica y microscopía electrónica realizados con promastigotes salvajes, mutantes control y mutantes que sobrexpresan la SMT, ponen de manifiesto que la proteína se localiza en la membrana de acidocalcisomas. Estudios de inmunofluorescencia realizados con promastigotes salvajes confirman esta localización. Por último, con el objetivo de estudiar la importancia biológica de la enzima SMT para el parásito, se han realizado experimentos de silenciaminto génico mediados por la producción de RNA "antisentido". Se ha visto que se produce una disminución de la expresión de la proteína SMT que no conlleva una pérdida de la viabilidad celular, lo que sugiere que la SMT no controla un proceso esencial para la supervivencia de L.major. Sin embargo, no se puede descartar que los niveles remanentes de proteína, que son considerables, sean suficientes para asegurar una correcta proliferación celular.

Autor: GONZÁLEZ REY ELENA.
Año: 2002.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: INSTITUTO DE PARASITOLOGÍA Y BIOMEDICINA.

Resumen: Las enfermedades causadas por protozoos parásitos representan uno de los mayores retos de la ciencia médica actual, ya que afectan a cientos de millones de personas, y producen millones de muertes cada años (TDR, 2002). Los géneros Trypanosoma, Leishmania y Plasmodium son, entre los protozoos parásitos, aquellos cuyo impacto sobre la calidad de vida es má notorio, tanto por la mortandad que causan como por la morbilidad de las enfermedades de las que son responsables. A pesar de su impacto sanitario, los conocimientos que se poseen acerca del tratamiento o prevención de estas enfermedades son escasos. La comprensión de los complejos mecanismos moleculares y celulares subyacentes a las relaciones parásito-huésped es indispensable para hacer frente a las enfermedades que provocan. La invasión de las células hospedadoras por Trypanosoma cruzi es un proceso complejo que implica bastante acontecimientos que no se conocen con profundidad. Uno de los momentos clave durante la infección se presenta cuando el parásito entra en contacto con la célula hospedadora, originando la reorganización de los lisosomas y su fusión a la membrana plasmática, y dando lugar a la formación de una vacuola que rodea al parásito en el punto de contacto con la membrana. Para completar su ciclo de vida, los parásitos deben escapar de esta vacuola para lo que se ha propuesto la intervención de proteínas que parecen ser funcionalmente parecidas a la porina del complemento (Andrews y col., 1990). Estas proteínas, activas a pH ácido, producirán poros en la membrana de la vacuola, quedando los parásitos libres en el citosol. Aunque la maquinaria celular implicada en el proceso es conocida, pocas moléculas del parásito han sido identificadas. De hecho, hasta la fecha solo tres proteínas parasitarias, TcTOX, oligopeptidasa B y TcMIP, se han mostrado de forma convincente en el proceso de invasión. Una nueva molécula implicada en el ciclo de vida de T.cruzi se identificó en nuestro laboratorio. El gen LYT1 fue clonado a partir de una librería de expresión de amastigotes gracias a la reactividad cruzada que presenta con anticuerpos específicos frente al componente C9 de la cascada del complemento. Basándose en el hecho de que TcTOX y LYT1 son similares en tamaño y presentan reacción cruzada con anticuerpos dirigidos frente a C9, se pensó en una posible relación funcional entre estas proteínas, conociendo que TcTOX tiene actividad formadora de poros a pH ácidos y que podría intervenir en el escape del parásito de la vacuola parasitófora al citosol. Utilizando mutantes nulos para el gen LYT1 se realizaron ensayos de infección y hemolíticos que mostraron que la deficiencia en LYT1 producía una disminución significativa en la actividad lítica del parásito y, posiblemente debido a esto, en su infectividad (Cortés, 1998). Con estos resultados previos se ha realizado la investigación que comprende esta tesis doctoral, en la que se describe la implicación de LYT1 no sólo en acontecimientos relacionados con la infección de células susceptibles sino además con el propio desarrollo del parásito. En el trabajo de investigación de esta tesis se han podido ampliar y caracterizar los diversos fenotipos que producen los mutantes nulos para el gen LYT1 como son el desarrollo de infecciones deficientes, cambio de estadío acelerado in vitro, y una disminuida actividad hemolítica a pH ácido cuando se comparan con la cepa salvaje. LYT1 interviene en procesos biológicos tan distintos a través de dos formas de la proteína producidas por un procesamiento alternativo. Una de estas formas lleva una secuencia de anclaje a membrana en el extremo amino. Otra de las formas pierde esta secuencia como consecuencia de la reacción de trans-splicing dentro de la secuencia codificante de la proteína, lo que conduce a trasladar el sitio de inicio de la transcripción al codon ATG en la posición +85. Como secuencia del procesamiento del gen se originan una forma completa y una forma truncada de LYT1. El trabajo presentado demuestra que los parásitos deficientes en el gen LYT1 muestran alteraciones en el proceso de cambio de estadío y en la infectividad. La reconstitución diferencial ha permitido asociar de manera independiente esos fenotipos con cada una de las dos proteínas derivadas del gen a través del trans-splicing alternativo. La forma completa de LYT1, localizada en la membrana plasmática, está implicada en la ruta lítica, interviniendo en la capacidad infectiva de los parásitos. Hay observaciones que sugieren que LYT1 y TcTOX, la hemolisina de T.cruzi descrita por Andrews y Whitlow en 1989, podrían ser la misma proteína o al menos que podrían estar implicadas en la misma vía lítica. Las evidencias se basan en que las dos proteínas tienen un tamaño similar y muestran reactividad cruzada con anticuerpos específicos frente a C9. Además, los parásitos deficientes en LYT1 pierden la actividad hemolítica expresada en amastigotes que se había atribuido a TcTOX. Sin embargo, no existe información acerca de la implicación de TcTOX en la infección o en el desarrollo del parásito, donde LYT1 sí está implicada por lo que no se puede considerar que se trate de la misma proteína con las evidencias disponibles. Además, mientras que TcTOX es una proteína secretada, LYT1 se encuentra anclada a la membrana plasmática. Por lo tanto y en función de los datos conocidos, se considera que se trata de dos proteínas distintas que están implicadas en la misma ruta lítica. En este sentido, los resultados indican que LYT1 pdorían actuar sobre la membrana de la vacuola, permitiendo una alteración de la permeabilidad y posterior ruptura. Por otro lado, en su ciclo biológico T.cruzi sufre una serie de cambios morfogenéticos que determinan los distintos estadíos del parásito. Éstos ocurren dependiendo de las condiciones en los distintos ambientes con los que se enfrentan: insecto vector, interior de la vacuola fagolisosómica, citosolo ambiente extracelular en el hospedador vertebrado. La forma de la proteína que no presenta los primeros 28 aminoácidos del extremo aminoterminal de la forma completa se localiza intracelularmente. Esta forma está relacionada con los procesos que intervienen en el cambio de estadío, posiblemente regulando la expresión o represión de genes implicados, directamente o a través de su intervención en alguna vía de transducción de señales. Ambas formas de la proteína presentan básicamente la misma secuencia proteica, y se producen en todos los estadíos. Sin embargo, existe una elección mayoritaria de una u otra forma dependiendo del estadío del parásito, es decir, de las condiciones ambientales con las que se enfrenta en cada momento. Si se trata de epimastigotes, presentes en el insecto, predomina la forma truncada de localización nuclear. En los estadíos tripomastigote, amastigote o tripomastigote metacíclico, la forma completa de LYT1 localizada en la membrana plasmática es la mayoritaria. La expresión de una u otra forma parece depender de factores que afectan al cambio de estadío como la temperatura del medio en el que se desarrolla el parásito. Por otro lado, todo indica que el pH del medio podría explicar la activación de una u otra forma en un momento dado. Por último considerar que, aunque la proteína LYT1 por sí sola pueda ser responsable de la actividad hemolítica, no se puede descartar una posible implicación de un complejo multiproteico que condujera a la actividad lítica. También es posible que el papel de LYT1 en el desarrollo implique interacciones con proteínas no identificadas aún. Como perspectivas futuras se plantea necesario integrar la actividad de ambas formas de LYT1 en rutas concretas de actuación en el ciclo de vida del parásito. Por lo tanto, identificar proteínas con las que LYT1 pueda estar interaccionando sería de gran interés e importancia.

Autor: GONZÁLEZ SÁNCHEZ JOSÉ LUIS.
Año: 2002.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID .
Centro de lectura: FARMACIA.

Resumen: OBJETIVOS 1,- Estudiar polimorfismos en genes candidatos de componentes del Síndrome Metabólico (SM) en individuos de la población general Española: A,- Polimorfismo Gln27Glu del gen del receptor beta2-Adrenérgico. B,- Polimorfismo Trp64Arg del gen del receptor beta3-Adrenérgico. C,- Polimorfismo -3826A-G del gen de la proteína desacoplante de la termogénesis UCPl. D,- Polimorfismo Pro12Ala del gen del receptor activado por proliferadores de peroxisomas PPARgamma. E,- Polimorfismo L121Q del gen de la glicoproteína plasmática PC-1. 2,- Determinar las frecuencias genotípicas de dichos polimorfismos. 3,- Estudiar su asociación con parámetros antropométricos y bioquímicos relacionados con obesidad y otras alteraciones del SM. 4,- Analizar su relación con la resistencia a la insulina Rl). MATERIAL Y MÉTODOS Individuos de la población general Española. Estudio I: n=666 individuos. Estudio II: n=332. Estudio III: n=464. Estudio IV: n)293. A.- Parámetros antropométricos: Indice de Masa Corporal (IMC), Diámetro Sagital Abdominal (DSA) y Cocintura Cociente/Cadera (Ci/Ca). B,- Presiones arteriales sistólica y diastólica. C,- Determinaciones Biológicas: Glucemia basal y a las 2 horas, Insulina basal y a las 2 horas. Proinsulina basal y a las 2 horas. Leptina basal y a las 2 horas. Colesterol total. Colesterol-HDL y LDL y Triglicéridos. La RI se estimó por el método HOMA. RESULTADOS A,- Estudio I: El polimorfismo Gln27Glu del receptor beta2-Adrenérgico estuvo asociado con un mayor IMC y DSA en varones obesos y con una mayor prevalencia de diabetes mellitus tipo 2. B,- Estudio II: El polimorfismo Trp64Arg del receptor beta3-Adrenérgico estuvo asociado con mayores niveles de leptina, siendo los portadores de alelo Arg los que presentaron incrementados los niveles de leptina después de ajustar por sexo, edad, IMC y Ci/Ca. C,- El polimorfismo -3826A-G está asociado con obesidad en las mujeres de nuestra población de estudio, pero no en varones. D,- Estudio III: El alelo Ala12 del gen PPARgamma estuvo asociado con menores niveles de insulina en ayunas y una mejor sensibilidad a la insulina. E,- Estudio IV: Los portadores del alelo Q121 del gen de la PC-1 presentaron mayores niveles de leptina y de trigliceridos que los individuos con genotipos K121K. CONCLUSIONES A,- El alelo Glu27 del receptor beta2-Adrenérgico favorece la acumulación de grasa visceral y podría aumentar el riesgo de intolerancia a la glucosa y diabetes mellitus tipo 2 en varones pero no en mujeres. B,- El polimorfismo Trpa64Arg del receptor beta3-Adrenérgico podría estar implicado en los mecanismos que regulan los niveles plasmáticos de leptina. C,- El alelo -3826G del gen de la UCP1 está asociado con obesidad en la población estudiada. D,- El alelo Ala12 del gen PPARgamma está asociado a una mayor sensibilidad a la insulina y a un mejor perfil lipídico en mujeres. E,- El polimorfismo K12Q de la PC-1 podría favorecer la aparición de hiperleptinemia e hipertrigliceridemia como una manifestación temprana del SM. F,- Cada uno de estos polimorfismos mantienen una asociación significativa con uno o varios parámetros de los componentes del SM o (K12Q de PC-1) pueden predisponer a hiperleptinemia como posible precedente del futuro desarrollo del SM con R1.

Autor: CASTILLA BARBA MANUELA.
Año: 2002.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTAD QUÍMICA.

Resumen: El objetivo de este trabajo ha sido caracterizar el efecto directo de ciclosporina sobre el túbulo proximal, a fin de establecer el mecanismo lesional y su posible relación con el mecanismo establecido de su acción inmunosupresora. Ciclosporina inhibe la proliferación celular del epitelio en fase de crecimiento exponencial. Es asimismo capaz de inducir muerte celular sobre la célula tubular sometida a inhibición por contacto. Para una dosis determinada, unas células sobreviven adaptándose y otras entran en apoptosis. Las células adaptadas o precondicionadas son más resistentes a la lesión por cilosporina. El mecanismo por el cual ciclosporina induce apoptosis tiene que ver con su interacción directa con la ciclofilina D mitocondrial impidiendo la normal formación y funcionamiento del poro de transición mitocondrial, y la entrada de agua y fosfato a la mitocondria, con una reducción de la maoniogénesis en la fosforilación oxidativa y una reducción del control respiratorio mitocondrial. Hay acúmulo progresivo de calcio libre intramitocondrial que desacopla a la respiración y aumenta la producción de radicales libres de oxígeno y peroxinitrito, provocando una apertura tardía e irreversible de la permeabilidad mitocondrial, pérdida de su potencial de membrana, salida de citocromo c mitocondrial. Activación de caspasa 3 e inicio de la cascada apoptótica. Hemos estudiado así mismo el mecanismo por el que actúa el único fármaco descrito con potencialidad para reducir la nefrotoxicidad de ciclosporina, reduciendo su acumulación en la fracción de membrana y en la fracción mitocondrial de la misma. Disminuye la inducción de apoptosis inducida por ciclosporina, se restaura total o parcialmente la dinámica de crecimiento epitelial y se recuperan las características morfológicas y funcionales del epitelio polarizado.

Autor: TABARÉS RODRÍGUEZ ENRIQUE.
Año: 2002.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS.

Resumen: Cryptosporidium parvum es un protozoo parástio capaz de infectar a un gran número de mamíferos entre los que se encuentra el hombre, siendo una de las principales causas de diarrea de origen parasitario. Las ventajas en el diagnóstico del a utilización de la serología radican en su alta sensibilidad y especificidad y en la posibilidad de trabajar con antígenos indicadores de infecciones recientes o pasadas. El estudio de los principales antígenos de C.parvum útiles para el serodiagnóstico de la infección en los rumiantes, se realizó utilizando como modelo una especia -la ovina- y estudiando, mediante "Western blot", los antígenos del ooquiste de C.parvum reconocidos por las IgG específicas de diversos grupos poblacionales. La fracción antigénica de 15 kDa se muestra como un candidato ideal para investigar la presencia de primoinfecciones al ser reconocida por ovinos infectados de diferentes edades y razas y no tener interferencia con los anticuerpos calostrales, ni presentar reacciones cruzada con Eimeria spp. Para la identificación de las proteínas contenidas en la fracción de 15 kDa se desarrollaron genotecas de expresión a partir de cDNA de esporozoítos de C.parvum. El cribado se realizó utilizando un suero policlonal obtenido tras la inoculación de un conejo con la fracción proteica de 15 kDa. Se aislaron trece clones, de los cuales ocho, presentaban secuencias homólogas desde su extremo 3'. Se tomó para su estudio el clon que había sido un mayor número de veces, realizado la expresión in vivo e in vitro del fragmento de menor tamaño obtenido. El suero policlona anti-Cp15 reconoció las proteínas expresadas por este clon tanto vivo. Estos resultados hacen de este clon un buen candidato para la valoración de sus proteínas de expresión en técnicas inmunodiagnósticas de la cryptosporidiosis en los rumiantes domésticos.

Autor: RODRÍGUEZ RODRÍGUEZ JOSÉ MANUEL.
Año: 2002.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: QUÍMICA.
Centro de realización: FACULTAD DE QUÍMICAS.

Resumen: En esta tesis se estudian las bases moleculares de la deficiencias de metabolismo de leucina que aún permanecían sin caracterizar. Para lo cual se utilizó el hongo Aspergillus nidulans como modelo metabólico. Este trabajo ha permitido la caracterización de las bases moleculares de la metilcrotonilglicinuria humana y la caracterización del gen que codifica la proteína con actividad 3-metilglutaconil hidratasa en A.nidulans. Con él, este moho se convierte en el primer organismo donde se ha completado la caracterización de todos los genes implicados directamente en la ruta catabólica de leucina. Además, la utilización de A.nidulans como modelo de metilcrotonilglicinuria ha servido para demostrar la implicación de la enzima MCC en el metabolismo del mevalonato, siendo ésta la primera evidencia experimental in vivo que se obtiene de la existencia de una relación entre el catabolismo de leucina y el metabolismo del mevalonato, a través del llamado "shunt" del mevalonato. Además la obtención de un modelo de aciduria 3-metilglutacónica fúngica ha contribuido a restringir a únicamente dos genes humanos como posibles candidatos a codificar una proteína con actividad 3-metilglutaconil-CoA hidratasa, cuyo déficit ocasiona la aciduria 3-metilglutacónica de tipo I. De tal forma que se completaría la caracterización molecular de todas las metabolopatías humanas del catabolismo de leucina.

Autor: LASTRES BECKER ISABEL.
Año: 2002.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: QUÍMICA.
Centro de realización: UNIVERSIDAD COMPLUTENSE.

Resumen: Esta tesis doctoral se ha centrado en el estudio de la implicación del sistema cannabionoide endógeno en dos enfermedades neurodegenerativas que afectan al movimiento, la enfermedad de Huntington y la enfermedad de Parkinson. Para ello, en un primer lugar se ha analizado el estado del sistema endocannabionoide en humanos y modelos animales de estas enfermedades. En la enfermedad de Huntington se ha observado un descenso de actividad endocannabinoide en los ganglios basales, tanto al nivel del receptor como de los ligandos endógenos. Al contrario que en esta enfermedad, en la enfermedad de Parkinson, existe un aumento de la actividad endocannabinoide, en especial al nivel de los receptores. El análisis del estado de este sistema, sirvió de base para el diseño de estrategias farmacológicas frente a la sintomatología de la enfermedad de Huntington. Los resultados que se obtuvieron al respecto muestran que los compuestos con mayor eficacia frente a la hiperactividad característica de esta enfermedad, son los que se unen tanto al receptor cannabionoide como al receptor vanilloides. Los receptores vanilloides se encuentran en las mismas áreas cerebrales que el receptor CB1, y parece que estos dos sistemas están íntimamente relacionados al nivel de los ganglios basales. Debido a que estudios previos han observado un efecto neuroprotector de los cannabionoides en distintos modelos degenerativos, nos planteamos analizar dicho efecto en las dos enfermedades. Para ello, realizamos un tratamiento con *9-tetrahidrocannabinol. Este compuesto parece retrasar o enlentecer las lesiones que se producen tanto en la enfermedad de Huntington como en la enfermedad de Parkinson. Pero parece ser, que este efecto no es mediado por el receptor CB1, pudiendo estar implicado el carácter antioxidativo de esta molécula. Para finalizar esta tesis doctoral, nos planteamos estudiar el papel de la activación glial en la neurodegeneración, y la implicación de los cannabinoides en procesos anti-inflamatorios. Así, lo que observamos fue que los cannabinoides pueden proteger frente al daño neuronal producido por diversas toxinas utilizadas para generar estas enfermedades. Más interesante aún, fue el que el tratamiento de la glia con cannabinoides parecen minimizar las lesiones neuronales que se producen en estas dos enfermedades. Por lo tanto, podemos concluir, que el sistema endocannabinoide está directamente implicado en las enfermedades neurodegenerativas del movimiento, siendo, susceptible de aplicación a escala clínica para el alivio de los síntomas y/o por su capacidad de reducir la degeneración.