ENZIMOLOGIA, 4

Autor: FRAIZ ALVAREZ FRANCISCO JOSE.
Año: 1998.
Universidad: EXTREMADURA.
Centro de lectura: CIENCIAS.

Resumen: Se han identificado en hígado de rata una liasa (ciclante) que actúa sobre flavina adenina dinucleótido (FAD) y forma AMP y riboflavina 4', 5' -fosfato cíclico (4',5'-cFMN). Este producto fue identificado por cromatografía de líquidos de alta eficacia (HPLC), análisis enzimático, descomposición en ácido y espectroscopía ultravioletavisible y de resonancia magnética nuclear. La enzima fue purificada y caracterizada parcialmente. Mostró un requerimiento estricto de Mn2+o Co2+ como catión activador y no funcionó con Mg2+. El valor de Km para FAD fue de 6 muM con Mn2+ y de 50muM con Co2+, ambos a pH 7,5. Por lo que se refiere a la formación de nucleótidos cíclicos, la enzima es específica. No mostró actividades de FAD pirofosfatasa, adenilato-, guanilato- o citidilato-ciclasa, fosfodiesterasa formadora de nucleótidos 2',3'-cíclicos, FAD sintetasa, nide rotura de otros dinucleótidos distintos del FAD. Sin embargo, sí rompió algunos nucleósido-difosfoazúcares (NDP-azúcar). A este respecto, la actividad sobre NDP-azúcares mostró un patrón de especificidad bien definido, pues, por ejemplo, ADP-glucosa fue sustrato de la enzima pero ADP-manosa y dTDP-glucosa no lo fueron. De entre 28 compuestos estudiados, sólo 10 fueron atacados por la enzima, y de ellos, el mejor sustrato fue el FAD. Se propone para esta enzima la denominación FAD AMP/liasa (ciclante) o FMN ciclasa. Se detectó también en hígado una fosfodiesterasa de 4',5'-cFMN. Ambas enzimas perfilan una nueva vía para el recambio de nucleótidos de flavina en mamíferos. inanciado por CICYT, Junta de Extremadura y Fondo Social Europeo).

Autor: ALCALDE GALEOTE MIGUEL.
Año: 1998.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGIA.

Resumen: Con el objeto de profundizar en el binomio estructura-función de la glicosil transferasas se han aplicado metodologias de modificación quimica e inmovilización sobre dos enzimas con estrechas relaciones: la cgtasa y la dextransacarasa. Con el primer sistema enzimatico se han practicado modificaciones sobre los grupos carboxilos y aminos de la enzima para intentar variar la selectividad de producción de ciclodextrinas. Con la dextransacarasa se ha optimizado la reacción de aceptor mediante el empleo de soportes variados de inmovilización y la utilización de medios no convencionales. Los productos obtenidos con ambas enzimas tiene importantes aplicaciones alimentarias y farmaceuticas.

Autor: PEREZ POMARES FRANCISCO.
Año: 1998.
Universidad: ALICANTE.
Centro de lectura: CIENCIAS.

Resumen: La NAD-GDH del Archaea H.salinarum, ve regulada su actividad por aminoácidos, (activadores) y por compuestos mono y dicarboxílicos (inhibidores). Los activadores son moléculas con alto momento dipolar, mientras que los inhibidores presentan momentos dipolares bajos. Los valores de HOMO (orbital molecular más alto ocupado) y Lumo (orbital molecular mas bajo no ocupado) muestran que los activadores son compuestos aceptores de electrones y los inhibidores compuestos dadores de electrones. El comportamiento de los activadores también depende de la hidrofobicidad de la cadena lateral (activadores con un mayor carácter hidrofóbico son más efectivos). A partir de la dependencia de los parámetros cinéticos de la reacción con el pH, en presencia de un activador y de un inhibidor competitivo, a distintas temperaturas, junto con estudios de modificación química, los residuos catalíticos encontrados son: lisina, histidina y tirosina. La modificación con DEPC muestra residuos de histidina, con un pK 6.6. La modificación con etilacetamida muestra un residuo de lisina, con un pK de 8.36. La modificación con TNM muestra dos residuos con un pK 9.0. El mecanismo propuesto en el estudio para la NAD-glutamato deshidrogenasa de H.salinarum es: 1 ) Unión del coenzima NAD+ con un residuo de histidina. 2 ) Unión de los grupos carboxilo del L-glutamato a dos tirosinas. 3 ) Interacción entre el alfa-hidrógeno del L-glutamato y la lisina desprotonada e interacción entre la histidina desprotonada y un hidrógeno del grupo amino del L-glutamato. 4 ) Transferencia del alfa-hidrógeno como ion hidruro al coenzima. 5 ) Ataque nucleofilico del agua. 6 ) Formación de la alfa-carbinolamina, que se descompondría en el alfa-cetoácido correspondiente, y liberando el amonio.#

Autor: SAHAGUN CASANOVA NURIA.
Año: 1998.
Universidad: ALICANTE.
Centro de lectura: CIENCIAS.

Resumen: Se ha estudiado el mecanismo cinético de la L-Ala DH (L-Alanina: NAD+- oxidorreductasa EC.1.4.1.1) de Halobacterium salinarum (Archaea halófilo extremo). Tras la purificación de la Ala DH, se buscaron las condiciones apropiadas para la realización de los ensayos de aminación y desaminación: tampón Tris-HC1 0,1 M, pH 9,0, con KCL 3,6 M y t =40 C. Se procedió a investigar el mecanismo cinético mediante los métodos de velocidades iniciales, inhibición por producto, inhibición por análogos estructurales de los productos y empleo de sustratos alternativos. Los resultados obtenidos son consistentes con un mecanismo secuencial ordenado en el que los sustratos se unen a la enzima en el siguiente orden: NADH, Pyr y NH4+, y los productos se liberan: L-Alanina y NAD+-. El mecanismo supone un sistema de estado estacionario pero con una etapa de equilibrio rápido en la unión del Pyr, que queda confirmada por el método de inhibición por producto al producirse un complejo abortivo ("dead-end").#

Autor: LAVADO PAREJO EVA M..
Año: 1998.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: EDIF. DEPARTAMENTAL.

Resumen: El cerebro del recién nacido aunque no el del adulto, es capaz de captar específicamente albúmina de la sangre sólo durante el período postnatal, coincidiendo con el estado de máximo desarrollo del cerebro. El objetivo de este trabajo fue estudiar el efecto de esta proteína sobre el desarrollo neuronal. Para ello, empleamos cultivos primarios de astrocitos, neuronas y oligodendrocitos de rata. En este trabajo se muestra que la albumina estimula la síntesis de ácido oleico por los astrocitos a partir de los sustratos metabólicos disponibles durante el desarrollo del cerebro, esto es glucosa, lactato y cuerpos cetónicos. El ácido oleico es liberado por los astrocitos, muy probablemente como complejo ácido graso-albúmina y es utilizado por las neuronas para la síntesis de fosfolípidos, principalmente fosfatidilcolina y fosfatidiletanolamina. El ácido oleico se incorpora específicamente en las bases de las neuritas y su presencia promueve la expresión de la proteína asociada al crecimiento(GAP-43) y el agrupamiento de las neuronas por sus cuerpos celulares resultando en conjunto la diferenciación neuronal. En resumen, durante el período postnatal la albúmina puede colaborar en la diferenciación neuronal debido a la inducción de la síntesis del ácido oleico en astrocitos.

Autor: GIL GIRÓ CARLES.
Año: 1998.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: MEDICINA .
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: La Toxina tetánica (TeTx) forma parte de un conjunto de proteínas con acción tóxica, llamadas neurotoxinas clostridiales, sintetizadas por bacterias del género Clostridium. Las neurotoxinas clostridiales tienen una elevada especifidad por diversas porteínas de membrana responsables de la fusión de membranas, impidiendo de esta manera la liberación de neurotransmisores contenidos en las vesículas sinápticas. Se asume que esta actividad es la base de su acción tóxica, aunque se han descrito otras actividades de la TeTx, como la inducción de la activación y posterior proteólisis (down-regulation) de la porteína quinasa C (PKC) de la que existen diferentes isoformas. El objetivo de esta tesis ha sido la determinación del efecto de la TeTx sobre diferentes isoformas OKC, su acción sobre vías de transducción de señales en que esta participa y la comparación con el efecto del TPA y del NGF (Factor de crecimiento nervioso). El tratamiento de cultivos primarios de neuronas corticales fetales de rata con TPA (12-orto-tetradecanoil forbol-13-acetato) o con TeTx induce la translocación de la PKC a la fracción de membrana, fenómeno que se asocia con su activación. Utilizando anticuerpos específicos contra seis isoformas PKC (-----) se demuestra que el TPA induce la translocación de todas las isoformas excepto las e y Ç. La TeTx induce translocación de la PKCb, mientras que induce down-regulation de las isoformas a, y,- y e. No presenta ningún efecto sobre la PKCÇ. Esta activación de la PKCb se correlaciona con la estimulación de fosfolipasas de tipo C por la TeTx. En una segunda parte se han utilizado sinaptosomas como sistema de trabajo. El tratamiento de estos con TPA induce down-regulation de las isoformas a, b y y, así como de la PKCe, mientras que la PKC8 experimenta translocación sostenida a altas concentraciones de TPA. El NGF induce translocación de las PKC y y8, y induce down-regulation de las PKC a, b y e. La isoforma Ç muestra translocación atípica de la membrana al citoplasma. Estos efectos se comparan con el producido por al TeTx. Esta induce la translocación de las PKC b yy. La TeTx en forma de endotoxina monocatenaria afecta las PKC a, b y y presentes en la fracción particulada, mientras que el fragmento Hc induce la translocación de la PKCb y translocación ligera de la PKCa. Tanto el NGF como la TeTx activan fosfolipasas de tipo C. La detección de la actividad de las proteínas quinasas ERK1 y ERK2 revela que la toxina tetánica induce su actividad. La detección con anticuerpos con las ERK fosforiladas, situación en que se encuentran activas, revela que la toxina tetánica induce la fosforilación del a ERK1 y de la ERK2. En resumen se puede decir que la TeTx induce la translocación de isoformas clásicas de la familia PKC, fenómeno que se da a través de la activación de fosfolipasas de tipo C, indicando que la acciónde TeTx se podría dar a través de la su interacción con un receptor de membrana. Esta conclusión es apoyada por el hecho que la TeTx estimula a las quinasas ERK.

Autor: BLANDINO GARRIDO ANA M..
Año: 1998.
Universidad: CADIZ.
Centro de lectura: CIENCIAS .

Resumen: El objetivo primordial del trabajo presentado en la memoria, es el estudio y modelado del comportamiento cinético de las enzimas glucosa oxidasa y catalasa co-inmovilizadas en cápsulas de alginato cálcico. La primera de estas enzimas, cataliza la oxidación de la glucosa a ácido glucónico; sin embargo, presenta el inconveniente de que es desactivada irreversiblemente por el otro producto formado en la reacción: el peróxido de hidrógeno. De ahí, que se haya recurrido a la introducción de la enzima CAT, que actúa descomponiendo el peróxido de hidrógeno formado, protegiendo a la enzima principal GOD. El sistema enzimático GOD/CAT tiene numerosas aplicaciones industriales en todos aquellos procesos en los cuales resulta beneficioso la eliminación de la glucosa, o bien la formación de ácido glucónico. Generalmente, todos estos procesos implican una previa inmovilización de las enzimas en un soporte adecuado. La inmovilización efectiva del biocatalizador puede conseguirse mediante el empleo de diversas técnicas; sin embargo, una de las más utilizadas es la encapsulación en una matriz del gel, que consiste en cofinar la enzima en solución dentro de una cápsula constituida por una membrana semipermeable. Básicamente las principales ventajas de este método de inmovilización son dos: permitir un contacto adecuado con el sustrato, dado que la enzima se encuentra en solución, y posibilitar la inmovilización de varias enzimas en un solo paso. No obstante, pese a estas innegables ventajas, la productividad de la enzima inmovilizada es generalmente menor que la de la enzima en solución. A ello contribuyen una serie de factores, siendo el más importante de éstos, la resistencia a la transferencia de materia impuesta por la matriz de gel para los sustratos y productos; de entre los otros factores distintos de los puramente difusionales, puede destacarse: los posibles cambios conformacionales que se producen durante el proceso de inmovilización, las interacciones entre la matriz del soporte y la enzima, o los impedimentos estéricos, que alteran la cinética del proceso. Por todo ello, se hace entonces necesario el estudio de la cinética de la enzima, tanto en suspensión, como inmovilizada.

Autor: FELIU GIL JORDI XAVIER.
Año: 1998.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.

Resumen: En este trabajo se presenta el uso de la B-galactosidasa d´Escherichia coli como proteina portadora de péptidos con actividad biologica. Con esta finalidad, se ha utilizado el lazo entre las hojas beta G y H de la proteina VP1 del virus de la fiebre aftsa como peptido funcional. Se han identificado asi 4 sitios permisivos (entre los aminoacidos 249-250,581-582,772-773 y 795-796), junto con la fusion al extremo C-terminal, y se ha comprobado al mimo tiempo que la B-galactosidasa puede tolerar hasta 3 copias del peptido por monomero. La presencia del péptido tiene un efecto directo sobre las propiedades de la B-galactosidasa. En la mayoria de las quimeras construidas se observa una reducción en la actividad especifica, debido a cambios tanto en la afinidad or el substrato (KM) como en la velocidad de hidrólisis (Kcat). Tamben se aprecian claras disminuciones en los valores de AG(H2O), excepto en la fusión en el extremo C-terminal. A partir de los estudios de estabilidad se ha podido determinar el proceso de desplegamiento de la B-galactosidasa, en el que se puede apreciar la presencia de un intermediario estable, pero inactivo. Las propiedades del peptido virico tambien se han visto afectadas dependiendo del lugar en donde se han realizado la inserción. Asi, se obtienen marcadas diferencias en los valores de IC50 en el reconocimiento de los epitopos presentes en el peptido por parte de anticuerpos dirigidos contra esa zona. Por otra lado, la capacidad de unión a celulas de mamiferos a traves de un motivo RGD presente en el peptido, tambien varia depediendo del lugar de insercion y del numero de copias. Finalmente, se ha observado que la union de anticuerpos al peptido virico puede incrementar la actividad de los enzimas hasta mas de un 300%, aunque tan solo aquellos que han visto reducida su actividad debido a la inserción pueden ser modulados. Esta mejora es debida tanto a una mejor afinidad por el substrato como a una mayor velocidad de hidrólisis.

Autor: SÁNCHEZ FERRER ANTONIO .
Año: 1998.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: ESCUELA SUPERIOR DE INGENIERIA.

Resumen: Se ha desarrollado un sistema en continuo para la resolución de compuestos de interes farmaceutico como ibuprofeno, trans-2-fenil-ciclohexanol utilizando como biocatalizador lipasas producidas por fermentación de candida rugosa en los laboratorios del departament d'enginyeria química de la universitat autónoma de barcelona.

Autor: VILADOT PETIT JOSEP LLUÍS.
Año: 1998.
Universidad: RAMON LLULL.
Centro de lectura: INSTITUTO QUÍMICO DE SARRIA.
Centro de realización: ESCOLA TÉCNICA SUPERIOR IQS.

Resumen: Se han estudiado los determinantes de la catálisis y la especificidad por substrato de (1,3), (1,4)-glucanasas bacterianas a nivel molecular, para establecer los principios que definen el reconocimiento enzima-carbohidratos. El papel de los dos residuos catalíticos se ha identificado por recate químico de la actividad con nucleófilos exógenos a partir de los mutantes a alanina. El rescate químico opera de diferente forma según quien es el aminoácido esencial eliminando, con formación de productos de estereoquímica de incorporación del nucleófilo en la parte glicónica opuesta, y proporciona una prueba inequívoca del papel funcional del residuo mutado. En la reactivación con formato del mutante del nucleófilo se detecta una transiente de larga vida, que constituye el primer caso descrito en glicosidasas de mímico del intermedio covalente glicosil-enzima obtenido a partir de un azúcar no modificado. Como otras glicosidasas, las (1,3), (1,4)-glucanasas presentan actividad transglicosidasa, catalizando la transferencia de aceptores glicosídicos a dadores fluoruros de glicosilo 3-O-substituídos por formación de un enlace--(1,4). Esta vía constituye una nueva estrategia general que se ha aplicado en la síntesis de nuevas familias de substratos de estos enzimas. A partir del análisis cinético de (1,3), (1,4)-glucanasas salvajes con series de substratos y inhibidores sintéticos se plantea un modelo de centro activo formado por seis subsitios de unión de unidades de Glcp (-IV a +II). Se evaluá la preferencia en cada subsitio por una unidad de Glcp --(1,3)- vs--(1,4)-substituida a partir de ciclos termodinámicos con familias ligandos convenientemente diseñados, y se da una interpretación de la especificidad a nivel molecular. El desarrollo y la aplicación de manera sistemática de una nueva metodología de análisis cinético de una colección de mutantes de (1,3), (1,4)--glucanasas utilizando una familia de oligosacáridos cromofóricos sintéticos permite extraer conclusiones sobre el tipo de interacción que establece cada residuo del centro activo con el ligando y evaluar su magnitud y el subsitio al cual pertenece. La interpretación de los datos obtenidos en base a modelos moleculares y estructuras cristalográficas permite configurar un mapa completo de interacciones proteína-carbohidrato, entender las razones de la especificidad y aventurar posibles cambios para su modulación.

Autor: ALARCON LOPEZ FRANCISCO JAVIER.
Año: 1997.
Universidad: ALMERIA.
Centro de lectura: CIENCIAS EXPERIMENTALES.
Centro de realización: DEPARTAMENTO: BIOLOGIA APLICADA PROGRAMA DE DOCTORADO: INGENIERIA BIOQUIMICA.

Resumen: El objetivo principal del presente trabajo ha sido la puesta a punto y evaluación de la utilidad de una serie de técnicas "in vitro" orientadas hacia la evaluación de la digestibilidad del componente proteico del alimento en dos especies de peces marinos (fundamentalmente dorada y también dentón), tanto en su etapa larvaria microcápsulas), como de engorde (piensos peletizados). El paso previo para desarrollar un sistema de digestibilidad "in vitro" es un conocimiento detallado del equipamiento digestivo de la/s especie/s estudiada/s. Por lo tanto, se ha partido de la caracterización de las enzimas presentes en el digestivo, evaluando su presencia, grado de actividad, condiciones óptimas para el desarrollo de la misma y sensibilidad frente a inhibidores, información que resulta básica para posteriormente diseñar el sistema de digestión. El segundo objetivo del presente trabajo ha sido la optimización y adaptación de una técnica normalmente utilizada en la industria alimentaria para evaluar el grado de hidrólisis de una proteína la determinación del grado de hidrólisis de la proteína mediante pH-stat, con objeto de emplearla para evaluar la susceptibilidad a la degradación de distintas proteínas por acción de las enzimas del pez. En este sentido se pretendió establecer las condiciones óptimas para el ensayo, así como la influencia de distintos factores (tipo de enzima utilizada, relación E:S, presencia de inhibidores, etc,...) sobre los resultados finales. El tercer objetivo, una vez establecidas las condiciones optimas de ensayo, era utilizar la técnica para evaluar distintas materias primas y piensos y correlacionar la información obtenida con los datos procedentes de experimentos realizados "in vivo". El último objetivo de la serie de experimentos que constituyen la presente Tesis, ha sido el profundizar en el estudio de la hidrólisis proteica, analizando los productos resultantes del proceso digestivo llevado a cabo bajo condiciones controladas, valiéndose para ello de la combinación de pH-stat, electroforesis y técnicas de análisis de imagen. Se pretendió con ello obtener información que, desde un punto de vista comparado, orientase en la selección de materias primas y ayudase a comprender mejor la forma en que la fracción proteica de un ingrediente concreto es hidrolizada por las proteasas. Como resumen se podría decir que el presente trabajo ha pretendido aportar a la comunidad científica, concretamente a aquellos investigadores implicados en la nutrición de organismos acuáticos, la evaluación de una serie de herramientas que, sin pretender por el momento sustituir a los experimentos de digestibilidad in vivo, pueden complementar la información obtenida en estos y ayudar en el futuro a una mejor formulación de los alimentos para peces marinos.

Autor: AOULAD EL HADJ BEN OMAR M'HAMMED.
Año: 1997.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: DEPARTAMENTO: INGENIERIA QUIMICA PROGRAMA DE DOCTORADO: TECNOLOGIA BIOQUIMICA Y AGROALIMENTARIA.

Resumen: La hidrólisis enzimática de celulosa mediante celulasas es un proceso heterogéneo, dada su estructura insoluble, en el que las endo y exoglucanasas se adsorben sobre la superficie de la celulosa y reaccionan liberando glucosa celobiosa y cadenas más cortas de celulosa mientras que las beta-1,4-glucosidasas hidrolizan en fase homogénea la celobiosa a glucosa. Para profundizar en el mecanismo de este proceso se puede utilizar celobiosa y carboximetilcelulosa (CMC) como sustratos, por ser ambos de naturaleza conocida y para evitar las complejidades de los sistemas heterogéneos. La hidrólisis enzimática de celobiosa con Novozym preparado líquido comercial de beta-1,4-glucosidasas procedentes de A.niger se ha estudiado tras comprobar, realizando experimentos en los que la disolución de enzima se mantenía un tiempo previo a la temperatura del experimento, que por debajo de 70 C no se producía desactivación térmica apreciable de la enzima, mediante series experimentales programadas para analizar la influencia de la concentración inicial de celobiosa, entre 0.5 y 150 mM, del pH, entre 3.65 y 5.5, y de la temperatura, entre 40 y 70 C. Se ha comprobado que además de inhibición de sustrato existe inhibición mixta de producto, y para establecer la influencia del pH y de la temperatura sobre la conversión de celobiosa a glucosa con Novozym se ha efectuado una simulación en base a los parámetros cinéticos obtenidos, deduciéndose que el pH más favorable es el de 4.3, seguido del de 4.9, y que la temperatura más favorable es la de 60 C, valores que resultan concordantes con lo señalado en bibliografía. El estudio experimental de la hidrólisis de CMC con Celluclast, preparado líquido comercial de celulasas procedentes de T.reesei, y con mezcla de Celluclast y Novozym se ha llevado a cabo mediante la determinación de las concentraciones de glucosa y de azúcares reductores, esta última permite obtener la de celobiosa. El estudio sobre la influencia de la intensidad de tratamiento ha puesto de manifiesto que el posible efecto sinergístico entre las endo y las exoglucanasas resulta prácticamente despreciable. De los resultados obtenidos para la productividad en glucosa en la hidrólisis de CMC a 50 C y pH igual a 4.9 con Celluclast y con mezclas de Celluclast y Novozym se deduce que la producción a partir de CMC de las endoglucanasas es muy significativa y superior a la correspondiente a la hidrólisis de celobiosa por las beta-1,4-glucosidasas de Celluclast. De los resultados obtenidos para la productividad global, xp, se deduce que prácticamente toda la producción de celobiosa a partir de CMC es atribuible a las exoglucanasas y que la correspondiente velocidad, expresada como la variación de xp con la intensidad de tratamiento, no se puede ajustar a una ecuación simple de Michaelis-Menten, siendo necesario considerar la existencia de inhibición competitiva de producto.

Autor: BUESO MERINO JORGE.
Año: 1997.
Universidad: VALENCIA .
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: DEPARTAMENTO: BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR PROGRAMA DE DOCTORADO: BIOQUIMICA CLINICA Y MEDICA (030B).

Resumen: Utilizando marcado de fotoafinidad con efectores, proteólisis limitada o exhaustiva, técnicas cromatográficas y de secuenciación N-terminal, y mutagénesis dirigida, se ha caracterizado el dominio regulador y se han localizado lugares para efectores en la carbamilfosfato sintetasa de Escherichia coli. Se ha demostrado que el inhibidor UMP se entrecruza a la lisina 992, y que el activador IMP se une también al dominio C-terminal de 20 kDa de la subunidad mayor, fotomarcando la histidina 994. La sustitución de esta histidina por alanina previene el fotomarcado por IMP pero no por UMP, y afecta selectivamente a la regulación del enzima por ambos efectores. También se ha insertado en la región reguladora del enzima de E.coli un lugar de fosforilación para proteína quinasa A, que se encuentra en la carbamilfosfato sintetasa II, pero este cambio no ha resultado en la fosforilación por la quinasa del enzima de E.coli modificado así, ni ha afectado sus propiedades reguladoras. Sobre la base de estos resultados y del alineamiento de secuencias de las carbamilfosfato sintetasas, se propone una zona de la secuencia como lugar de unión de los efectores, determinando los cambios en dicha región la selectividad reguladora de cada carbamilfosfato sintetasa.

Autor: DIEGO PUENTE TERESA DE.
Año: 1997.
Universidad: MURCIA.
Centro de lectura: QUIMICA .
Centro de realización: DEPARTAMENTO: BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR B E INMUNOLOGIA PROGRAMA DE DOCTORADO: BIOMEDICINA Y BIOCATALISIS.

Resumen: El objeto de la presente tesis doctoral consiste en el análisis de la actividad y estabilidad de la a-quimotripsina inmovilizada en la síntesis de la endorfina kyotorfina (Tyr-Arg), utilizando disolventes orgánicos como medio de reacción. Se desarrolla una revisión general de la síntesis enzimática de péptidos, que pone de manifiesto el interés de dichos compuestos, así como la importancia de las estrategias de reacción empleadas. Se analiza el mecanismo cinético de desactivación y desnaturalización de la enzima, estableciéndose una relación cuantitativa entre ambos procesos, y proponiéndose un modelo cinético en dos etapas con un intermedio activo. Se estudia la síntesis de kyotorfina en presencia de cinco disolventes orgánicos, estableciéndose una correlación directa entre la actividad sintética y las características del medio, a saber, log Pi, Aw y contenido en agua del derivado. Se analizan los efectos de dichos disolventes sobre la actividad sintética de la enzima soluble y su relación sobre la desnaturalización enzimática mediante medidas de fluorescencia, concluyéndose que el incremento de la hidrofobicidad del medio incrementa la selectividad de la reacción. Se estudia la estabilidad de la enzima inmovilizada y la influencia de los disolventes miscibles con agua, que estuvo en relación directa a la hidrofobicidad de los mismos. Se optimizan las condiciones de síntesis de kyotorfina en un sistema anhidro hexano:etanol y se analiza la influencia del sorbitol como aditivo estabilizante, obteniéndose los mejores niveles de actividad y estabilidad.

Autor: LOPEZ GOMEZ JUAN MANUEL.
Año: 1997.
Universidad: EXTREMADURA.
Centro de lectura: MEDICINA .
Centro de realización: DEPARTAMENTO: BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR Y GENETICA PROGRAMA DE DOCTORADO: BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR.

Resumen: (A) Empleando ATP como sustrato se ha demostrado la catálisis, por la nucleótido-pirofosfatasa (NPP) de hígado de rata, de reacciones alcoholíticas con diversos alcoholes R-CH sub 2 OH, que dan lugar a AMP-O-alquilos. La eficacia de los alcoholes como agentes solvolíticos se relaciona con su acidez y su competencia con el agua es favorecida por el grupo metileno (CH sub 2). Los resultados se interpretan como consecuencia de la intervención de catálisis general básica para facilitar el ataque nucleofílico por el alcohol y una interacción favorable del grupo CH sub 2 en el centro activo de la enzima. (B) Se ha demostrado que en suero y en fracciones celulares de sangre humana existe también actividad alcoholítica con metanol y etanol, que puede deberse a la presencia de NPP. Ello abre la posibilidad de que puedan formarse AMP-O-alquilos como consecuencia del consumo humano de alcohol. (C) Se ha reinvestigado la inhibición de la NPP de hígado de rata por una preparación comercial de factor de crecimiento acídico de fibroblastos (FGF-1), empleando p-nitrofenil-dTMP como sustrato. Se ha demostrado que la inhibición es producida por EDTA contaminante, identificado y cuantificado por RMN. La inhibición por EDTA es dependiente del tiempo de preincubación, potenciada por glicina y bloqueada por el sustrato. Ello se interpreta como consecuencia de un lento intercambio de cationes divalentes entre la NPP y el EDTA, impedido por el sustrato y favorecido por glicina a través de un efecto conformacional. Trabajo financiado por CICYT (SAF94-0194 y SAF97-0209) y la Consejería de Educación y Juventud, Junta de Extremadura, Fondo Social Europeo (EIA94-09 y PRI97C145).

Autor: MARINA MORENO ALBERTO.
Año: 1997.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: DEPARTAMENTO: BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR PROGRAMA DE DOCTORADO: BIOQUIMICA CLINICA Y MEDICA.

Resumen: El trabajo de tesis describe la purificación de la enzima carmato quinasa producida por Enterococcus faecium, el clonado y secuenciación del gen que codifica para esta proteína en Enterococcus faecium y Enterococcus faecalis, su subclonado en Escherichia coli, la expresión y purificación de dicha enzima producida a partir de estos clones de E. coli, la cristalización de la carbamato quinasa natural o, recombinante, y la determinación de la estructura tridimensional de esta enzima a 2.8 A de resolución utilizando técnicas de difracción de rayos X. La carbamato quinasa es un dímero, constituido por monómeros de 310 aminoácidos, cuyo elemento estructural principal es una hoja beta abierta de 8 elementos en su mayoría paralelos, rodeada por ambas caras de alfa hélices. En esta hoja beta se observa una gran oquedad, donde se ha localizado un ión sulfato, y que se propone como centro activo de la enzima. También se describe la purificación y cristalización de la carbamilfosfato sintetasa I de Rana catesbeiana y la caracterización de estos cristales usando técnicas de rayos X.

Autor: MERCAPIDE MUGUERZA JAVIER.
Año: 1997.
Universidad: NAVARRA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: DEPARTAMENTO: BIOQUIMICA PROGRAMA DE DOCTORADO: BIOLOGIA CELULAR.

Resumen: La acción vasorrelajante de muchos reguladores del tono muscular de los vasos sanguíneos, tiene lugar a través de cambios en la concentración de GMPC en este tejido, como por ejemplo los nitrocompuestos muy empleados en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares. La vasodilatación inducida por GMPC termina con su hidrólisis por fosfodiesterasas. El objetivo de este trabajo ha sido determinar si la inhibición selectiva de fosfodiesterasas de GMPc puede potenciar la cantidad de GMPC obtenida tras estimulación con nitrocompuestos. Para ello se aislaron las fosfodiesterasas de aorta de cerdo encontrándose que la fosfodiesterasa estimulable con calcio-calmodulina (PDE I) y la fosfodiesterasa específica de GMPc (PDE V) son fuertemente expresadas en este tejido. La degradación de GMPc tiene lugar activamente cuando la concentración intracelular de GMPC aumenta en respuesta a agentes que estimulan su síntesis, como el nitroprusiato sódico (NPS) o el factor natriurético atrial (ENA). Nuestros resultados sugieren que tanto PDE I como PDE V hidrolizan el GMPc sintetizado tras la activación con ambos agentes, y la inhibición selectiva de cualquiera de ellas es necesaria pero no suficiente para potenciar la respuesta.

Autor: MONTERO PRIETO ESTHER.
Año: 1997.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: DEPARTAMENTO: QUIMICA ORGANICA Y FARMACEUTICA PROGRAMA DE DOCTORADO: EL FARMACO: DISEÑO, OBTENCION Y ANALISIS.

Resumen: Las glicosidasas o glicosil hidrolasas son un grupo de enzimas cuya función en la célula es la degradación de oligosacáridos mediante la ruptura de enlaces glicosídicos. Las deficiencias hereditarias de estas enzimas se encuentran entre los síndromes genéticos más frecuentes en el hombre, por lo que actualmente se dedica un gran esfuerzo al estudio de las mismas. Por otra parte, la capacidad de muchas glicosidasas de formar enlaces glicosídicos por transglicosidación, hace que el interés por estas enzimas se extienda también a la síntesis de carbohidratos. El trabajo que se presenta en esta Tesis está orientado al estudio de las glicosidasas desde dos puntos de vista. Por un lado, se ha estudiado la aplicación de algunas b-gluco y b-galactosidasas a la síntesis regio y estereoespecífica de disacáridos del tipo b-D-galactosil-xilopiranósidos. Estos compuestos son análogos de sustrato de la Lactasa intestinal, y son potencialmente útiles en el diagnóstico de la enfermedad resultante de la deficiencia de esta enzima. Por otro lado, mediante la aplicación de técnicas de RMN y cálculos de mecánica molecular se ha estudiado la conformación que adoptan diversos inhibidores y sustratos en el centro activo de algunas glicosidasas. La información obtenida de estos estudios es útil para conocer el mecanismo catalítico de estas enzimas y para el diseño de inhibidores y análogos de sustrato con diferentes objetivos terapeúticos.

Autor: NUÑEZ DELICADO ESTRELLA.
Año: 1997.
Universidad: MURCIA.
Centro de lectura: BIOLOGIA .
Centro de realización: DEPARTAMENTO: BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR-A PROGRAMA DE DOCTORADO: BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR.

Resumen: El objetivo de este trabajo ha sido caracterizar la actividad hidoperoxidasa de lipoxigenasa mediante la oxidación de compuestos fenólicos de interés fisiológico. Los substratos utilizados para caracterizar esta actividad han sido: un difenol (isoproterenol), tres monofenoles análogos de la vitamina E(Trolox C, MDL 73,404 y PMC) y un bisfenol (dietilstilbestrol). El estudio de la oxidación del difenol isoproterenol y el monofenol Trolox C nos ha permitido proponer un modelo para la oxidación de mono- y difenoles por lipoxigenasa. En el caso de difenoles, la presencia de tres etapas lentas para la obtención de la forma catalíticamente activa de la enzima, presentes en el ciclo catalítico sólo antes de alcanzarse el estado estacionario, nos permite explicar el periodo de retardo presente en la acumulación de su producto de oxidación. Mientras que en el caso de monofenoles, estas tres etapas lentas siempre estan presentes en el ciclo catalítico de la enzima, incluso en el estado estacionario, explicando así la ausencia de periodo de retardo en la acumulación de su producto de oxidación. Por otra parte, el estudio de la oxidación del MDL 73,404 nos ha permitido ver que es un mal substrato para lipoxigenasa, debido a la presencia de un grupo amonio cuaternario, y un substrato anómalo para peroxidasa, mostrando una respuesta lenta con el tiempo, respuesta que es eliminada por la presencia de un activador cinético como es el PCA. El estudio de la oxidación de PMC por lipoxigenasa, nos ha permitido estudiar el efecto sinérgico entre este compuesto fenólico y el ácido ascórbico. Además, este efecto antioxidante puede ser potenciado por la presencia de ciclodextrinas en el medio de reacción, actuando estas como antioxidantes secundarios. Por último, la oxidación del bisfenol dietilstilbestrol es llevada a cabo por lipoxigenasa en presencia de concentraciones bajísimas de H2O2, lo que indica que esta podría ser una de las enzimas implicadas en su metabolismo oxidativo, y por lo tanto una de las responsables de la actividad carcinogénica de este compuesto.

Autor: PUENTE NOVOA JOSE MANUEL.
Año: 1997.
Universidad: SANTIAGO DE COMPOSTELA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: DEPARTAMENTO: BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR PROGRAMA DE DOCTORADO: BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR.

Resumen: En este trabajo, se ha aislado una actividad proteín quinasa C a partir de bazo de rodaballo mediante tres pasos cromatográficos: DEAE, fenil-sefarosa y treonín-sefarosa. La actividad era calcio-fosfolípido dependiente, se inhibía por H7 y en western blot se obtenían dos bandas, una de 80 y otra de 100 kDa. con el monoclonal MC5. Las concentraciones óptimas de activadores para su plena actividad eran 0.1 mM calcio, 20 microg/ml fosfatidilserina y 2 microg/ml diacilglicerol. La PKC purificada fosforiló con alta eficiencia dos sustratos específicos: MARCKS151-175 y EGFR651-658, y fue inhibida específicamente por dos péptidos pseudosustrato: PKC19-36 y PKC19-31. Por western blot, se demostró que la actividad purificada contenía seis isoformas: alfa, beta, delta, epsilon, zeta y lambda, mientras que en extracto crudo de bazo se detectaron las seis anteriores, mu y theta. Alfa presentaba dos formas de distinto peso molecular, una de 80 y otra de 100 kDa. Cargando la actividad purificada en una Mono Q, se obtuvieron dos picos de actividad, en uno de los cuales están presentes delta y lambda. El análisis de la expresión de isoformas de PKC en diferentes tejidos de rodaballo: hígado, gónada, músculo, corazón, cerebro, intestino, aleta caudal y riñón; demostró que las isoformas alfa (con una masa de 100 kDa.), beta, delta, epsilon, lambda y mu, están presentes en todos los tejidos. Zeta se detectó en todos salvo en músculo, mientras que gamma y theta están presentes en cerebro y en músculo y cerebro, respectivamente.