GENETICA BIOQUIMICA

Autor: LOPEZ MARQUES ROSA LAURA.
Año: 2003.
Universidad: SEVILLA.
Centro de lectura: CENTRO DE INVESTIGACIONES CIENTIFICAS .
Centro de realización: INSTITUTO DE BIOQUIMICA VEGETAL Y FOTOSINTESIS.

Resumen: INTRODUCCIÓN El pirofosfato (PPi) es una sencilla molécula inorgánica, que posee un enlace P-O-P, denominado enlace pirofosfato, caracterizado por su elevada energía libre de hidrólisis. Esta molécula se genera como subproducto en un gran número de reacciones anabólicas. Hasta hace poco, se pensaba que el PPi era hidrolizado únicamente por las pirofosfatasas solubles (sPPasas), liberándose la energía del enlace pirofosfato en forma de calor [Lahti y col. 1988]. Se han descubierto además proteínas integrales de membrana que son capaces de acoplar la hidrólisis del PPi a la generación de un gradiente de protones a través de una membrana, reciclando así parte de la energía contenida en el enlace pirofosfato [Baltscheffsky y Baltscheffsky 1992]. Estudios recientes indican que estas proteínas -denominadas pirofosfatasas inorgánicas translocadoras de protón (H+-PPasas o V-PPasas)- se encuentran presentes en diferentes organismos de muy diversos orígenes filogenéticos, como eubacterias, arqueas, plantas superiores y diversos protistas fotosintéticos y no fotosintéticos, entre ellos, algunos parásitos de humanos [Rea y Poole 1993, Baltscheffsky y col. 1999, Maeshima 2000, Pérez-Castiñeira y col. 2001a, McIntosh y Vaidya 2002]. Por su parte, no se han descrito proteínas de este tipo en células animales y hongos. Existen dos grandes grupos de H+-PPasas según requieran o no K+ para desarrollar su actividad máxima: las independientes y las estimuladas por K+. En organismos procarióticos, la H+-PPasa mejor estudiada es la de la bacteria púrpura no sulfurosa Rhodospirillum rubrum. Esta H+-PPasa se encuentra asociada a invaginaciones de la membrana plasmática, denominadas cromatóforos, donde se localiza también la maquinaria fotosintética y, como la de la mayoría de los organismos procarióticos, es independiente de K+ [Nyrén y col. 1984]. Se ha propuesto que la H+-PPasa podría hidrolizar PPi, contribuyendo al gradiente de protón en el interior del cromatóforo en condiciones de bajo nivel energético, por ejemplo, de baja luz, en las que el bombeo de este ión por parte de la cadena fotosintética no fuese eficiente. Esto permitiría obtener ATP mediante la relajación de este gradiente a través de la F0F1-ATP sintasa. En condiciones favorables -por ejemplo, alta luz- el gradiente de protón sería suficiente para sintetizar ATP y para dirigir la síntesis de PPi a través de la H+-PPasa, regenerándose así la reserva de PPi celular [Nyrén y Strid 1991]. En organismos eucarióticos, las H+-PPasas más estudiadas han sido las de plantas. Durante muchos años se consideró que estas proteínas eran estrictamente dependientes de K+ [Rea y Poole 1993, Maeshima 2000], hasta que, muy recientemente, se ha descrito una isoforma en Arabidopsis thaliana cuya actividad es independiente de la presencia de este cation [Drozdowicz y col. 2000]. La mayoría de estas proteínas se encuentran asociadas a la membrana vacuolar (V-PPasas), pero se han descrito también en la membrana plasmática y en el aparato de Golgi [Maeshima 2000, Mitsuda y col. 2001]. En el tonoplasto, esta enzima contribuye, junto con la V-ATPasa, a mantener la acidificación vacuolar necesaria para procesos de transporte y detoxificatión. Bajo condiciones de estrés, se han descrito circunstancias que inactivan la V-ATPasa total o parcialmente, y producen, al mismo tiempo, una inducción o una activación de la V-PPasa. El papel de estas proteínas eucarióticas en la membrana plasmática o el Golgi no ha sido estudiado hasta el momento. RESULTADOS Durante el transcurso de esta Tesis Doctoral, se han llevado a cabo estudios sobre la pirofosfatasa translocadora de protones. Los resultados se dividieron en 5 apartados independientes, que se resumen a continuación: Mecanismo de regulación transcripcional de la H+-PPasa de R. rubrum.- Rhodospirillum rubrum es una bacteria muy versátil, que puede crecer tanto en condiciones heterotróficas (fuente de carbono reducido, aerobiosis) y fototróficas (luz, anaerobiosis) [Oelze 1976], como en condiciones fermentativas (fructosa, oscuridad, anaerobiosis) o de respiración anaeróbica (agente oxidante, p.e. DMSO, oscuridad, fructosa, anaerobiosis) [Schultz y Weaver 1982]. Los estudios fisiológicos con este organismo, han permitido demostrar la existencia de una regulación coordinada y muy estricta de las dos enzimas que hidrolizan PPi en esta bacteria y que estarían compitiendo por el sustrato, la sPPasa y la H+-PPasa. Además, la enzima de membrana se encuentra presente en cultivos sometidos a anaerobiosis (fotosíntesis, fermentación y respiración anaeróbica), mientras que se encuentra ausente en condiciones aeróbicas. La transferencia de los cultivos aeróbicos a condiciones fotosintéticas produce una inducción clara de la V-PPasa doce horas después del cambio. Sin embargo, el oxígeno no parece ser estrictamente necesario para la represión transcripcional, dado que cultivos aeróbicos sometidos a estrés salino severo también presentan una inducción de la H+-PPasa. Tras clonar un fragmento de DNA genómico que contenía las secuencias promotoras del gen vpp de la H+-PPasa de membrana, se han determinado los puntos de inicio de la transcripción en las distintas condiciones de crecimiento, identificándose un promotores en tandem comunes a todas las condiciones anaeróbicas ensayadas y dependientes de los factores transcripcionales FNR y Reg A, y este último, además, del factor s54, y otros dos diferentes específicos de estrés salino. Esto ha permitido, además, realizar un análisis de dichas secuencias promotoras, que ha llevado a identificar putativos sitios de unión para distintos factores de transcripción, demostrando una vez más, que esta enzima se haya sujeta a un sistema muy complejo de regulación a nivel transcripcional. Los intentos de obtención de un mutante insercional carente de H+-PPasa, tanto por transformación directa como por conjugación, no han dado resultados positivos. Obtención de un mutante condicional de la sPPasa de Saccharomyces cerevisiae y complementación por H+-PPasas de membrana.- Aunque todas las H+-PPasas que se han estudiado hasta el momento presentan actividad de hidrólisis de PPi in vitro, existe cierta controversia acerca de su función fisiológica in vivo, debido a que diversos grupos han demostrado la capacidad de esta enzima para sintetizar PPi a expensas de un gradiente de protón previamente generado a través de la membrana [Maeshima 2000]. Por su parte, la levadura Saccharomyces cerevisiae posee dos sPPasas (citosólica y mitocondrial), pero carece de una H+-PPasa en su vacuola, al igual que ocurre en todas las células de hongos y animales estudiadas hasta la fecha. La obtención de un mutante absolutamente carente de sPPasa en cualquier condición ya había sido abordada previamente sin éxito, lo que indicaba que esa enzima debe ser esencial para la levadura [Lundin y col. 1991]. Uno de los objetivos que se plantearon durante la realización de este trabajo de Tesis Doctoral fue la obtención de un mutante de S. cerevisiae que expresara condicionalmente la sPPasa citosólica, con el fin de realizar estudios de complementación con H+-PPasas, que permitieran demostrar la hidrólisis de PPi in vivo por parte de estas enzimas. De esta forma, además, se alteraría la bioenergética del PPi en el mutante complementado de la levadura, que se asemejaría en este aspecto a una célula vegetal. Para ello, se obtuvieron plásmidos de expresión que contenían el gen de la sPPasa (IPP1) bajo el control de un promotor de galactosa, de tal modo que la proteína sólo se expresaría en presencia del azúcar mencionado. Tras transformar la levadura (estirpe w303) con este plásmido, se interrumpió la copia de IPP1 del cromosoma, mediante la transformación de las células con un plásmido integrativo que contenía dos fragmentos del gen, separados entre sí por una casete que permite el crecimiento de la levadura en ausencia de histidina en el medio de cultivo. Finalmente, dado que la ausencia total de actividad pirofosfatasa es letal para las células, se seleccionaron aquellas colonias de levadura que crecían sólo en presencia de galactosa y no en presencia de glucosa. Este mutante se caracterizó bioquímica y molecularmente, mediante técnicas de Northern Blot, Southern Blot, PCR, Western Blot y medidas de actividad sPPasa. Una vez comprobada la ausencia de PPasa en glucosa, se obtuvieron construcciones en plásmido que contenían genes de H+-PPasas de membrana, tanto de plantas como de bacterias, bajo el control de un promotor constitutivo y, por lo tanto, activo en presencia de glucosa. De este modo, se consiguió complementar funcionalmente el mutante de sPPasa, que recupera su capacidad de crecimiento en glucosa cuando la hidrólisis del PPi, producido en el citoplasma por las reacciones anabólicas, es llevada a cabo por las H+-PPasas heterólogas. Mediante el uso de gradientes de sacarosa y experimentos de inmunolocalización, se realizó un estudio de la localización intracelular de las enzimas heterólogas, encontrándose que se encuentran asociadas fundamentalmente a sistemas de membranas (cisternas) perinucleares. Purificación de la H+-PPasa de Thermotoga maritima.- La H+-PPasa de la bacteria hipertermofílica Thermotoga maritima, fue caracterizada en nuestro grupo durante el desarrollo de esta beca por expresión heteróloga en membranas de levadura, siendo la primera H+-PPasa bacteriana descrita cuya actividad era dependiente de K+ [Pérez-Castiñeira y col. 2001b]. Esta proteína presenta, además de su resistencia a altas temperaturas, la característica de ser resistente al ataque de proteasas. De este modo, se consideró que podría ser una buena candidata para purificación, en comparación con otras V-PPasas normofílicas (plantas, protistas), muy lábiles. Para dicha purificación, mediante técnicas de PCR, se insertó una secuencia de seis histidinas en el extremo 5'-terminal del gen que, tras expresión heteróloga en levadura, permitiría la unión de la H+-PPasa a columnas de afinidad de ion-quelante cargadas con níquel u otro catión divalente. El primer paso de la purificación, dado que la proteína es intrínseca de membrana, consistió en su solubilización en presencia de detergente dodecilmaltósido (DDM). Para ello, se probaron distintas relaciones cantidad de proteína total:cantidad de detergente, llegándose a un óptimo de 1:3. A continuación, usando las características termofílicas de la enzima se sometió la misma a un choque térmico (75ºC, 30 min.), separándose así de la mayor parte de las proteínas no deseadas. Finalmente, se combinaron los dos pasos en uno, de modo que la solubilización se realizó calentando la muestra en presencia del detergente en presencia de Mg2+, K+ y PPi. Además, se estudió el efecto de distintos tratamientos en la efectividad de la purificación: lavado previo de las membranas con distintas disoluciones salinas, variación de las concentraciones de iones (Mg2+, K+, PPi), aumento de la temperatura de solubilización. Una vez solubilizada y libre de la mayor parte de proteínas contaminantes, se sometió la preparación a cromatografía en columnas de ion-quelante (Ni2+), obteniéndose una fracción prácticamente pura de la proteína de T. maritima. Este trabajo se llevó a cabo en el laboratorio del Prof. Michael G. Palmgren de la Royal Veterinary and Agricultural University de Copenhague (Dinamarca). Una vez de vuelta en España, el protocolo optimizado se usó para el aislamiento de cantidad de proteína suficiente para la obtención de un anticuerpo policlonal monoespecífico por inmunización de un conejo, capaz de reconocer V-PPasas de distintos organismos. La proteína se someterá en un futuro a una caracterización estructural exhaustiva (Análisis de Partícula Simple, Fuerza Atómica, obtención de cristales bidimensionales en monocapas lipídicas o tridimensionales), dado que no existen datos sobre la estructura tridimensional o el estado oligomérico de este tipo de bombas de protón (Cooperación con Francia-Dinamarca). Expresión de la V-PPasa en microalgas eucarióticas sometidas a distintas condiciones nutricionales o de estrés: obtención de mutantes de Chlamydomonas reinhardtii sobreexpresores o deficientes en V-PPasa.- Para este estudio, se usaron dos microalgas, Chlamydomonas reinhardtii y Chlorella fusca (Scenedesmus vacuolatus), muy distintas en su respuesta a las situaciones de estrés iónico y osmótico. Cultivos de ambas microalgas se sometieron a estrés de tipo salino y osmótico. De este modo, se demostró que el transcrito de la V-PPasa se induce, en el caso de C. fusca, en todas las condiciones de estrés probadas (15 mM LiCl, 150 mM KCl, 150 mM NaCl y 300 mM sorbitol), sin que se produzca ningún efecto significativo sobre el crecimiento. Sin embargo, para C. reinhardtii no se observó ninguna inducción en presencia de sorbitol, mientras que las sales afectaron a la expresión del gen de manera muy diversa, siendo la inducción máxima en presencia de K+ y mínima en presencia de Li+. Los cultivos de esta alga en presencia de K+ al cabo de 30 horas, mientras que los sometidos a otros iones sufren un retardo en su crecimiento con respecto a los controles. Para los cultivos con sorbitol no se observa ningún tipo de efecto sobre la densidad celular. Además, se ha estudiado el efecto de las condiciones nutricionales en la expresión de la V-PPasa en C. fusca. Para ello, las células se crecieron en autotrofía (luz), mixotrofía (luz, glucosa), y heterotrofía (oscuridad, glucosa). Los estudios de Northern Blot permitieron observar una represión de la expresión del gen en presencia de glucosa y ausencia de luz (condiciones heterotróficas), donde las células presentan un balance energético más favorable. Con el fin de caracterizar en mayor profundidad el uso de la V-PPasa en la respuesta a sales de C. reinhardtii, se planteó como objetivo la obtención de mutantes de este organismo carentes de V-PPasa o que sobreexpresaran el gen para dicha enzima. Este proyecto conllevó la obtención de construcciones de DNA que contuvieran o bien el fragmento de DNA genómico del gen en cuestión, o bien el fragmento de cDNA correspondiente colocado en antisentido, bajo el control de un promotor inducible fuerte. El fragmento de DNA genómico se clonó mediante PCR sobre DNA total de la microalga, con oligonucleótidos estrictos para los extremos 5' y 3' de la V-PPasa. Para la obtención del fragmento de cDNA, se utilizaron clones de ESTs al Kasuza Research Institute en Japón, sobre los que se hizo, una vez más, una reacción de PCR usando los mismos oligonucleótidos. Para las construcciones definitivas, se usaron las secuencias promotoras y terminadoras del gen que codifica la nitrato reductasa de C. reinhardtii, cuya expresión se induce en presencia de nitrato y se reprime totalmente en presencia de amonio. Tras transformar cultivos de la microalga con estas construcciones, los clones obtenidos se cultivaron en presencia de amonio y nitrato y se sometieron a análisis por Northern y Southern Blot, identificándose varios transformantes, que se encuentran, en el momento actual, en la fase final de su caracterización. Asimismo, se están llevando a cabo estudios adicionales sobre otras condiciones de estrés nutricional, oxidativo y de temperatura, que puedan afectar a la expresión de la V-PPasa en C. reinhardtii. Estudios sobre la distribución de V-PPasas en microalgas eucarióticas de diversos grupos taxonómicos.- Al inicio de esta beca, se conocía la existencia de las V-PPasas en plantas, y en algunos parásitos y bacterias fotosintéticas. En nuestro grupo, se han obtenido evidencias de la presencia de V-PPasas en un amplio número de protistas heterótrofos (parásitos y de vida libre) y de la posible existencia de más de una isoforma de esta proteína en estos organismos (habitualmente con distinta dependencia del K+ para su actividad máxima) [Pérez-Castiñeira y col. 2001a, Pérez-Castiñeira y col. 2002]. Una vez comenzado este trabajo, se publicó la existencia en Arabidopsis thaliana de una isoforma de la V-PPasa independiente de K+ (AVP2), además de la isoforma AVP1 (estimulada por K+), que ya era bien conocida. Por todo ello, se planteó como objetivo la búsqueda de genes de V-PPasas en microalgas eucarióticas de distintos grupos filogenéticos, con el fin de encontrar alguna evidencia sobre el origen evolutivo de los dos grandes grupos de V-PPasas, a saber K+-dependientes e independientes. Con este fin, se obtuvieron células de distintas microalgas provenientes del Servicio de Cultivos Biológicos del Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis en el que se ha realizado esta Tesis, además de otras provenientes del Instituto de Ciencias Marinas del CSIC (Cádiz) y de distintos laboratorios americanos y europeos. En total se analizaron cerca de 40 organismos mediante técnicas de PCR, obteniéndose un total de 25 fragmentos de DNA, la mayor parte de DNA genómico, correspondientes a genes putativos de V-PPasas. Para la reacción de PCR, se utilizaron parejas de oligonucleótidos degenerados, obtenidos por comparación de distintas H+-PPasas de plantas y de la bacteria Rhodospirillum rubrum, y que amplifican un fragmento de 570-700 bp (25-30% de la longitud total de la zona codificante), cerca del extremo 3' del gen y que se encuentra muy conservado [Pérez-Castiñeira y col. 2002]. El análisis de esta secuencia permite además realizar predicciones sobre la dependencia o independencia de K+ de la proteína y ha permitido la localización de intrones en algunas isoformas. Además, con el fin de completar el estudio, se llevó a cabo la misma estrategia sobre cDNAs y DNA genómico de algunos protistas ancestros evolutivos de las células animales, con resultados positivos. Una vez localizadas las bandas de V-PPasas, se realizaron experimentos de Southern Blot con DNA genómico de las microalgas más relevantes, para asegurar la presencia de las distintas isoformas encontradas en el genoma de los organismos correspondientes. También se realizaron análisis de Southern heterólogo para intentar identificar V-PPasas en algunos protistas fotosintéticos para los cuales la estrategia de PCR no dio ningún resultado positivo. Para algunos de estos protistas, el análisis de membranas totales por Western Blot, usando un anticuerpo policlonal generado contra la secuencia de aminoácidos del putativo sitio de unión de PPi de AVP1 [Kim y col. 1994], permitió observar bandas de masa molecular esperada, sugiriendo la expresión de V-PPasas en estos organismos. DISCUSIÓN En esta Tesis Doctoral, se han llevado a cabo estudios encaminados a conocer distintos aspectos, muy poco estudiados o todavía no clarificados, acerca de las H+-PPasas de membrana, que han supuesto un importante avance en el conocimiento de estas proteínas y des u distribución, localización celular y función en organismos fotosintéticos, tanto procarióticos como eucarióticos. El trabajo realizado con la H+-PPasa de R. rubrum en distintas condiciones nutricionales y de estrés, ha permitido demostrar la existencia de una regulación coordinada muy estricta entre la sPPasa citosólica y la H+-PPasa de los cromatóforos, que permitiría a las células evitar la competencia de ambas proteínas por su sustrato. Además, la H+-PPasa está sometida a una regulación exhaustiva, como se ha puesto de manifiesto con la clonación de las regiones promotoras del gen, la identificación de los puntos de inicio de la transcripción y el análisis de las secuencias de los promotores identificados, que ha permitido proponer la existencia de sitios de unión para distintos factores transcripcionales, algunos de ellos específicos de condiciones fisiológicas de crecimiento concretas. Hasta el momento, no se ha descrito en la bibliografía ningún caso de regulación a nivel molecular de una H+-PPasa procariótica, de modo que este trabajo tiene un carácter claramente innovador en su campo y aporta datos útiles para la clarificación de la función fisiológica de estas proteínas. La regulación de estas bombas de protón en microalgas eucarióticas tampoco había sido estudiada previamente. El capítulo dedicado a ella ha permitido encontrar una relación entre el estrés salino u osmótico y la inducción transcripcional del gen en dos microalgas muy distintas. Por una parte, C. fusca posee grandes vacuolas y una pared rígida de celulosa, siendo en este sentido parecida a las células de plantas. La existencia de esta pared de celulosa permitiría una gran expansión de la vacuola, que podría llegar a ocupar la mayor parte del volumen celular y donde podrían acumularse grandes cantidades de sustancias tóxicas o de reserva. La respuesta a la presencia de sales u osmolitos en este organismo consiste en la sobreexpresión de la V-PPasa, lo que incrementaría el gradiente de protón en la vacuola, permitiendo la entrada de la sustancia tóxica en la misma a una mayor velocidad. Esto explicaría que no existiera ningún efecto sobre el crecimiento de los cultivos en presencia de estrés. Por otra parte, C. reinhardtii presenta pequeñas vacuolas, algunas de las cuales se encuentran asociadas a sus flagelos, y una membrana proteinácea relativamente flexible. Este hecho explicaría el efecto sobre el crecimiento de los cultivos observado en el caso de las sales, ya que no les permitiría acumular grandes cantidades de iones tóxicos provenientes del citoplasma, produciéndose la inviabilidad celular. En el caso del K+, el efecto sería más marcado que para el ion Na+, debido a que a lo largo de la evolución los organismos se han adaptado a vivir en ambientes con exceso de Na+ y han desarrollado sistemas que les permiten controlar la entrada y forzar la salida de este ion a través de la pared celular. Sin embargo, este no es el caso para el K+, que probablemente se acumula en el citoplasma en una mayor concentración. La no existencia de un efecto del sorbitol sobre la V-PPasa se debería únicamente al uso de la síntesis de osmolitos para el control de la presión osmótica en esta microalga. La obtención de mutantes de C. reinhardtii y el estudio de otros tipos de estrés para este organismo permitirá confirmar la implicación de la V-PPasa en la respuesta de este organismo a condiciones no favorables del entorno. El análisis de la presencia de V-PPasas en el genoma de distintas microalgas unicelulares, ha permitido identificar la existencia de más de una isoforma en algunas de ellas. En casos como el de Phaeodactylum tricornutum o Porphyra purpurea, han llegado a encontrarse hasta tres isoformas distintas, una de las cuales presenta un intrón dentro del fragmento amplificado. La posición de estos intrones en las distintas microalgas parece estar bastante conservado, lo que podría implicar la existencia de un gen ancestral común. Además, se ha encontrado una putativa H+-PPasa en organismos de la línea evolutiva de animales. Las células animales no presentan este tipo de enzima, de modo que este resultado podría dar información sobre el punto de la cadena evolutiva donde se produjo la pérdida de este gen. El análisis de las situaciones fisiológicas a las que han tenido que enfrentarse los distintos organismos estudiados a lo largo de la evolución, puede dar una idea de la necesidad de la existencia de dos tipos de pirofosfatasa con distinta dependencia de K+, del origen evolutivo de ambas -provenientes de un único gen que sufrió una evolución divergente o de dos genes distintos que acabaron evolucionando hacia una función común- y, por supuesto, de las relaciones filogenéticas que existen entre los distintos microorganismos estudiados. El trabajo de obtención de un mutante de S. cerevisiae carente de sPPasa en determinadas condiciones y su complementación por H+- y V-PPasas, de plantas y bacterias, estimuladas e independientes de K+, ha permitido demostrar por vez primera la implicación de esta enzima en la hidrólisis de PPi in vivo, tanto en bacterias (Chloroflexus aurantiacus), como en plantas (Arabidopsis thaliana). El mutante ha sido ampliamente caracterizado tanto a nivel molecular como bioquímico. La complementación funcional del mutante con las H+-PPasas ha permitido llevar a cabo estudios de localización celular, que han demostrado la acumulación de las H+-PPasas expresadas heterólogamente en cisternas perinuleares. Por último, la purificación de la H+-PPasa de la bacteria hipertermofílica Thermotoga marítima mediante un protocolo muy simple, se ha usado para la obtención de un anticuerpo contra H+-PPasas, mediante la inmunización de un conejo. La obtención de grandes cantidades de proteína permitirá realizar estudios estructurales sobre la misma, clarificando, al menos parcialmente, el mecanismo de acción de estas enzimas, mediante la determinación de su estado oligomérico y su estructura bi- y tri-dimensional. Hasta el momento, debido a la labilidad de estas proteínas y la dificultad para obtenerlas puras en una forma activa y en grandes cantidades, no se tienen datos estructurales de ningún tipo y la información sobre el estado oligomérico de las mismas es muy confusa [Maeshima 2000]. Todos los resultados expuestos en este informe se verán plasmados en una Tesis Doctoral, actualmente en periodo de redacción. La mayor parte de esos resultados han sido comunicados a Congresos nacionales e internacionales y/o publicados en revistas científicas de reconocido prestigio, como se recoge en el curriculum vitae adjunto. BIBLIOGRAFIA 1. Baltscheffsky M and Baltscheffsky H. 1992. Inorganic pyrophosphate and inorganic pyrophosphatases. En: L. Ernster (Ed.), Molecular Mechanisms in Bioenergetics, Elsevier Science Publishers B.V., pp 331-348. 2. Baltscheffscky M, Schultz A y Baltscheffsky H. 1999. H+-PPases: a tightly membrane-bound family. FEBS Lett 457, 527-533. 3. Drozdowicz Y, Kissinger JC y Rea PA. 2000. AVP2, a sequence-divergent, K+-insensitive H+-translocating inorganic pyrophosphatase from Arabidopsis. Plant Physiol 123, 353-362. 4.. Kim EJ, Zhen R-G y Rea PA. 1994. Heterologous expression of plant vacuolar pyrophosphatase in yeast demonstrates sufficiency of the substrate-binding subunit for proton transport. Proc Natl Acad Sci USA 91, 6128-6132. 5. Lahti R, Pitkäranta T, Valve E, Ilta I, Kukko-kalske E y Heinonen J. 1988. Cloning and characterization of the gene encoding inorganic pyrophosphatase of Escherichia coli K-12. J Bacteriol 170, 5901-5907. 6. Lundin M, Baltscheffsky H y Ronne H. 1991. J Biol Chem 266, 12168-12172. 7. Maeshima M. 2000. Vacuolar H+-pyrophosphatase. Biochim Biophys Acta 1465, 37-51. 8. McIntosh MT y Vaidya AB. 2002. Vacuolar type H+ pumping pyrophosphatases of parasitic protozoa. Int J Parasitol 31, 1343-1353. 9. Mitsuda N, Enami K, Nakata M, Takeyasu K y Sato MH. 2001. 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Autor: PAREDES GARCIA M. VANESSA.
Año: 2003.
Universidad: MURCIA.
Centro de lectura: FACULTAD DE BIOLOGA UNIVERSIDAD DE MURCIA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGIA.

Resumen: En la levadura con fisión Schizosaccharomyces pombe la ruta de MAP kinasas activable por estrés , homóloga a la ruta SAPK de eucariotas superiores juega un papel importante en la transmisión de señales extracelulares al nucleo celular, provocando cambios significativos en los patrones de expresión génica. El elemento central de la ruta es la MAP Kinasa Sty1p que es activable en respuesta a múltiples condiciones de estrés, fosforilándose y asociándose in vivo al factor transcripcional Atf1p. En las levaduras, la respuesta frente a cambios medioambientales provoca un aumento en la síntesis de trehalosa un disacárido no reductor que actúa como carbohidrato de reserva y como metabolito de estrés. En S. pombe la expresión de los genes ntp1+ y tps1+ que codifican, respectivamente los enzimas trehalasa y la trehalosa 6P sintetasa, implicados en la síntesis y degradación de la trehalosa se inducen transcripcionalemente en respuesta a múltiples estreses de manera preferente a través de la ruta SAPK y de dos de sus efectores, Atf1p y Pap1p. En condiciones de choque térmico y osmótico, la MAP kinasa Sty1p regula parcialmente la activación transcripcional por medio de Atf1p, mientras que Atf1p y Pa1p son los responsables de la inducción en condiciones de estrés oxidativo de dosis alta. La MAPK Sty1p regula, de manera independiente a Atf1p y/o Pap1p, la activación post-traduccional de la trehalasa neutra y la síntesis de trehalosa en condiciones de estrés osmótico y oxidativo, pero no durante estrés térmico. La ruta SAPK es epistática sobre Pka1p, proteína kinasa que activa por fosforilación a la trehalasa neutra, en la activación transcripcional de ntp1+ y tps1+ mediada por estrés , aunque Pka1p reprime los niveles basales de expresión de ambos genes en presencia de glucosa. El factor transcripcional Rst2p no es responsable de la represión de los niveles basales de expresión de ntp1+ debida a Pka1p. La unión de Atf1p a un elemento CRE (secuencia -CTACGTCA-) presente en el Pntp1+ en posición -568 a -561 es crítica para la inducción de ntp1+ en condiciones de estrés. Atf1p no se une in vivo a este elemento cuando S. pombe se crece en presencia de glucosa, pero sí lo hace al menos en condiciones de desrepresión o de estrés oxidativo. El motivo y-AP1 (sitio potencial de unión de Pap1p al Pntp1+) localizado en la posición -558 a -552 no es especialmente relevante para la inducción por estrés de ntp1+. El Pntp1+ posee dos elementos HSE (elementos de choque térmico) implicados en la activación transcripcional de ntp1+ en respuesta a elevadas temperaturas, siendo Atf1p epistático sobre HSF (factor de choque térmico) en la activación transcripcional en dichas condiciones.

Autor: Cebolla Beatriz.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: Instituto de Investigaciones Biomédicas.
Centro de realización: Facultad de Mediciana.

Resumen: Durante el desarrollo del SNC, la generación de los astrocitos a partir de precursores neurales tiene lugar hacia el final del periodo de gestación en respuesta a determinados factores neurotróficos. Estudios recientes llevadoa a cabo en nuestro laboratorio han puesto de manifiesto que PACAP promueve la diferenciación de astrocitos a través de la activación de la activación de la ruta de señalización dependiente de AMPc. Esta respuesta va está acompañada de la activación transcripcional del gen de la proteína ácida fibrilar de la glía (GFAP). En este trabajo hemos identificado y caracterizado elementos de control en el ADN que regulan la expresión de GFAP en respuesta a PACAP/AMPc. Estos elementos se encuentran localizados en una localizados en una región del promotor situada entre los nucleótidos -384 y -35. Uno de ellos es reconocido por el factor Sp1 fundamentalmente en los periodos del desarrollo previos a la gliogénesis. Experimentos de inmunoprecipitación de cromatina y de retardos de la movilidad electroforética en gel indican que la unión de Sp1 al promotor de GFAP sugieren que Sp1 puede intervenir en los mecanismos que previenen la expresión prematura de GFAP en precursores neurales. Otro factor de transcripción identificado en este trabajo es NF1, que se une a un elemento del promotor de GFAP localizado en la vecinidad del reconocido por Sp1. El estudio de los complejos ADN-proteína sobre elementos indica que NF1 ocupa el promotor de GFAP tanto antes como después de la inducción de la gliogénesis por PACAP. Ensayos de transfección en células precursoras de la corteza fetal mantenidas en cultivos primarios indican que NF1 es importante para la expresión de niveles apropiados de GFAP tanto en condiciones basales como tras la inducción de la astrogliogénesis. Finalmente, hemos determinado que el promotor de GFAP contiene al menos dos elementos reguladores reconocidos por el factor de transcripción DREAM. La integridad de estos elementos es esencial para la actividad tanto basal como inducida del promotor. experimentos de inmunoprecipitación de cromatina demuestran que DREAM ocupa el promotor de gen de GFAP antes y después de la diferenciación de astrocitos inducida por PACAP en células precursoras de la corteza cerebral. Además nuestros han puesto de manifiesto un mecanismo por el cual DREAM estimula la transcripción del gen de GFAP desencadenada por PACAP. Este mecanismo requiere un incremento de la concentración intracelular de calcio que es dependiente de la síntesis de AMPc. Por lo tanto nuestros estudios identifican a DREAM como un activador transcripcional dependiente de AMPc y calcio, que participa en los mecanismos moleculares de diferenciación de astrocitos inducida por PACAP.

Autor: MARCO FERRERES RAQUEL.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA-UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID.

Resumen: La diferenciación de los distintos músculos de un organismo requiere de la ejecución coordinada de programas reguladores que van a determinar la expresión diferencial de genes y la producción de isoformas específicas. Uno de los mecanismos mejor conocidos implicado en la generación de diversidad muscular es la regulación de la transcripción. El gen paramiosina/miniparamiosina de Drosophila codifica dos proteínas del filamento grueso de invertebrados: la Paramiosina (PM) y la Miniparamiosina (mPM) que se transcriben a partir de dos promotores distintos. La expresión de la PM está regulada por un activador muscular distal de 900pb, localizado a 1.4 kb del inicio de la transcripción, qu es esencial para activar la expresión en todos los músculos de Drosophila, excepto en los músculos indirectos de vuelo. Esta región contiene tres sitios de unión para el factor MEF2 conservados. Sin embargo, para la correcta expresión de la proteína se requiere también la presencia de otros elementos localizados en posición 3' de este activador (región moduladora proximal) que contribuyen a modular los niveles de expresión. Por otro lado, la expresión de la mPM, está regulada por dos activadores: AB y TX, y un modulador: BF. AB es responsable de la expresión en los músculos indirectos de vuelo mientras que TX la activa en el resto de la musculatura. BF es responsable de modular los niveles de expresión de la mPM en los músculos torácicos de la mosca. Este elemento une el factor de transcripción PDP1, que parece ser esencial en la expresión de la mPM. Las proteínas musculares se acumulan en cantidades diferentes en los distintos músculos pero manteniendo siempre una estequiometría muy precisa. En este trabajo demostramos que el aumento de los niveles de expresión en los músculos indirectos de vuelo de Drosophila de un componente del filamento fino: la Troponina T, produce una disminución de su síntesis y de la del resto de componentes del filamento fino. Este fenómeno interfiere con la formación de los sarcómeros provocando graves alteraciones en la estructura y función de estos músculos. Estos resultados sugieren que la Troponina T es un componente clave en un mecanismo de regulación feedback que controla la expresión de las proteínas del filamento fino.

Autor: RECALDE MAESTRE SERGIO.
Año: 2003.
Universidad: NAVARRA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE NAVARRA.

Resumen: La familia de los intercambiadores de aniones independientes de sodio está constituida por cuatro miembros (Ae1, Ae2, Ae3 y Ae4) que median el intercambio de C1-/HCO3- en la membrana celular, participando en la regulación del pHi y volumen celular y en el flujo transepitelial de iones. El gen Ae2 (Slc4a2) es el miembro de esta familia que presenta una expresión más generalizada habiéndose descrito en la mayoría de los tejidos. Para estudiar el papel que la proteína Ae2 desempeña en los diferentes tejidos se ha generado un modelo de ratón con el gen Ae2 parcialmente delecionado (ratones Ae2-/-). Estos ratones son viables aunque dependiendo la cepa utilizada, presentan una mortandad perinatal relativamente elevada. Se ha observado que los ratones machos Ae2-/- son infértiles mientras que las hembras sí llegan a ser fértiles. El análisis histopatológico de los testículos de los ratones Ae2-/- muestra azoospermia debida a una interrupción de las espermiogénesis en el estadio VII. Además se observó un aumento del número de cuerpos apoptóticos en los túbulos semíniferos y en el epididimo. Por otra parte, el epitelio epididimal presenta alteraciones compatibles con una metaplasia escamosa. Estudios en el estómago demostraron que la función y morfología gástricas están severamente alteradas presentando hipoclorhídria, hiperplasia de células G e hipergastrinemia, incremento de la división celular de la mucosa y un aumento de la degeneración de las células oxínticas. Por último, se ha observado que los ratones Ae2-/- presentan un insuficiente control renal del equilibrio ácido/base, así como alteraciones en el proceso de formación y resorción del sistema óseo.

Autor: VAZ MENDES MARTA.
Año: 2002.
Universidad: LEON.
Centro de lectura: BIOLOGÍA .
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS.

Resumen: La primaricina es una molécula prototipo de los macrólidos polienos utilizada en la industria alimentaria y en oftalmología en la prevención de infecciones fúngicas. La agrupación génica responsable de la biosíntesis de este antibiótico en S.natalensis ATCC 27448 ha sido secuenciada. La secuencia ha desvelado la presencia de cinco genes que codifican para la sintasa de la pimaricina (PIMS), pimSO- pimS4, y 13 genes adicionales posiblemente relacionados con la modificación, regulación y secreción de la pimaricina. En esta tesis, se realiza un estudio funcional de los genes de pimD, pimK y pimE. El gen pimD codifica para una citocromo P-450 monooxifenasa funcional implicada en la epoxidación en C4-C5 de la pimaricina. La inactivación génica de pimD resultó en la obtención del mutante S.natalensis 6D41. La caracterización de este mutante mostró que producía 4,5- desepoxipimaricina retiene cierta actividad biológica aunque siete veces inferior que la de la pimaricina. La purificación de la proteína codificada por pimD, PimD. El gen pimK codifica para una glucosiltransferasa responsable de la introducción del residuo de micosamina en el anillo macrocíclico de la pimaricinolida. La inactivación de pimK resultó en la obtención del mutante S.natalensis 1D62 que produce 15-desmicosamina-4,5-desepoxipimaricina. Este nuevo compuesto, un precursor de la pimaricina, no presentó actividad biológica. Al contrario de algunos polienos, el residuo de micosamina resulta ser esencial para la actividad de la pimaricina. Los resultados obtenidos han permitido concluir que los últimos pasos de la ruta biosintética de la pimaricina, se realizan de una forma secuencial actuando PimD después de PimK. El gen pimE codifica para una proteína precursora de una colesterol oxidasa funcional. La inactivación de este gen originó la cepa no productora de pimaricina, S.natalensis 1D31.

Autor: ADREANI RIZO PATRICIA.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y DE FORMACIÓN CONTINUADA.

Resumen: Las Quimiocinas constituyen un pequeño grupo de moléculas estructuralmente relacionadas, que se caracterizan por regular el tráfico de varios tipos de leucocitos en condiciones fisiológicas y patológicas. En general las quimiocinas se han clasificado en cuatro grupos, en función de los residuos de cisteína que se encuentran en el extremo N-terminal de la proteína madura. Los cuatro grupos son: Las XC quimiocinas ó alfa-quimiocina, las CC quimiocina só beta-quimiocinas, las C quimiocinas ó gamma-quimitocina y finalmente la CX3C quimiocina ó *-quimiocina. Dentro del grupo de las beta-quimiocinas, se encuentran MIP-1alfa y MIP-1beta, que se localizan en el cromosoma 17q 11.2. Las quimiocinas ejercen sus efectos biológicos, a través de la unión con sus receptores que se encuentran expresados en la superficie de diversos grupos leucocitarios. Se ha descrito la utilización de tres receptores para MIB-1beta: CCR5, CCR8 y CCR9, siendo el CCR5 el que le otorga propiedades antiviriales, ya que este representa uno de los correceptores del VIH-1. Se ha descrito que MIB-1beta ésta codificada por dos loci, el Locus A y el locus B; y que éste último define un polimorfismo en la quimiocina. Esta forma polimórfica se caracteriza por la deleción de 15 pb en el exón 3, que se origina a partir de un cambio de base (A260 - G), provocando que se sintetice una proteína con 5 aminoácidos menos. Para determinar la incidencia de este polimorfismo dentro de la población sana, se estudió la distribución alélica en 200 individuos sanos a través de la técnica de PCR-SSP, confirmadas posteriormente por las técnicas de PCR-SSO post-hibridación y secuenciación; revelando que la frecuencia del alelo canónico representa un 83,5, mientras que la frecuencia del alelo polimórfico representa un 16,5%. Así mismo el estudio fue realizado en una población de pacientes con enfermedades tiroideas autoinmunes, pacientes diabéticos, pacientes con hepatitis C, observando que existe una correlación entre la frecuencia genómica y la frecuencia alélica de estos pacientes respecto a la población normal. Sin embargo, en los pacientes con VIH se observaron diferencias claras y estadísticamente significativas respecto a los individuos sanos. Para estudiar los niveles de expresión de MIP-1alfa y de MIP-1beta, utilizamos un protocolo que, aprovechando pequeñas diferencias a nivel de la secuencia nucleotídica, combina RT-PCR y restricción con MspI para estimar semicuantitativamente los nivles de ARNm de los loci codificantes para cada una de las dos quimiocinas. El aspecto más relevante de esta técnica, es el uso de un fragmento de ADN recombinante, que actúa de Estándar Interno, tanto para MIP-1alfa como para MIP-beta, a la vez que contiene un lugar de restricción para MspI. De esta manera actúa como control de la amplificación y de la digestión. Esta metodología se aplicó para determinar las posibles diferencias que pudieran existir en los niveles de expresión de los loci A y B de MIP-1beta, en la línea celular U-937 tras su estimulación con PMA, LPS e ionomicina, así como también entre individuos sanos y pacientes VIH+ (de diferentes genotipos) en PBMCs y linfocitos T CD8+, estimulados con PHA e IL-2. El estudio mostró que los loci A y B se regulan de manera diferente en las células U-937 y las cinéticas de expresión de mRNA son equivalentes en PBMCs y linfocitos T CD8 de pacientes VIH+ y en controles. En términos generales el locus B contribuye de manera minoritaria a la síntsis de mRNA de MIP-1beta y la cinética de inducción del mRNA de los linfocitos T CD8, se ve retrasada y heterocigotos y homocigotos (bb). Por otro lado, los niveles de expresión del receptor CCR5 en linfocitos T CD4+ son diferentes a los que prsentan los controles. Finalmente, podemos concluir que MIP-1beta ejerce un efecto diferencial sobre sus células diana debido a las distintas iso- y alo-formas que presenta.

Autor: TARRÚS DE VEHÍ MARC .
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y DE FORMACIÓN CONTINUADA.

Resumen: El estudio de los procesos moleculares implicados en la regulación de la osteogénesis se ha realizado en base a dos enfermedades humanas diferentes, las cuales están caracterizada por la formación ectópica de hueso de naturaleza distinta: la FOP (la fibrodisplásia osificadora progresiva) con formación de hueso endocondral y la POH (la heteroplásia ósea progresiva) con formación de hueso de origen intramenbranoso. Uno de los enigmas por resolver en la biología del esqueleto hace referencia a las señales moleculares que son necesarios y suficientes para inducir una adecuada formación del esqueleto. Aunque no se ha identificado del gen que causa la FOP, los resultados obtenidos, pueden, de hecho, ayudar a identificar el gen mutado mediante una atención central a porciones del camino de transducción de senyal de las BMPs. Aquí es donde el gen responsable de la FOP tiene mas posibilidades de encontrarse ya que nuestros resultados indican de la existencia de un defecto en la señalización entre el estimulo de BMP-4 y sus cognados antagonistas noggin y gremlin, es muy probable que la mutación responsable de la FOP se ubique en uno de los genes codificadores de proteínas mediadoras o reguladoras del camino de señalización de BMP-4. En el estudio relacionado con la POH, se ha demostrado que existen múltiples formas del gen GNAS1/gnas que se expresan en células preosteoblásticas MC3T3-E1 de ratón y también en LCLs humanas. Cuando las células se orientan hacia un linaje osteogénico se observan notables diferencias en la expresión de los transcritos de gnas. La inhibición de las isoformas Nesp55 y de la nueva forma de Gsalfa y una activación progresiva de las isoformas Xlalpha, antisentido y Gsalfa con el exon 3 excluido, en conjunto, puede proporcionar un mecanismo coordinado que involucre la unidad transcripcional de gnas en el proceso de diferenciación osteogénica de las células pluripotentes, sugiriendo la predisposición de las hMCS a dirigirse a linajes osteogénicos o adipogénicos está gobernada por múltiples interacciones entre los diferentes transcritos de gnas. Además, nuestros resultados indican que niveles reducidos hasta la mitad de los transcritos GNAS1 en individuos FOP podrían influir en los procesos "downstream" que conducen hacia un fenotipo osteogénico compotente. Este trabajo de investigación ha permitido situar en un mismo plano de estudio procesos de osteogénesis de naturaleza distinta, los cuales se desencadenan por caminos de transducción de señal alternativos. Las rutas de transducción de señal de factores TGF-beta (BMP-4) y proteínas G se entrecruzan las unas con las otras (Cross-talking). Mutaciones en los genes codificadores de proteínas mediadoras o reguladoras del camino de señalización de BMP-4 y defectos en las rutas de señalización de receptores acoplados a proteínas G pueden contribuir directa o indirectamente a la patogénesis de muchas enfermedades con formación heterotópica de hueso.

Autor: FERNÁNDEZ SÁNCHEZ VICTORIA EUGENIA .
Año: 2001.
Universidad: MALAGA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA UNIVERSIDAD DE MÁLAGA.

Resumen: INTRODUCCION La esclerosis múltiple EM han sido asociada con el haplotipo HLA de clase II, DR2 (DRBI*501, DQA1*0102, DQB1*0602) en todas las poblaciones estudiadas excepto en la población de Cerdeña donde la EM se encuentra asociada exclusivamente con DR4. Otras poblaciones (Turquía, Islas Canarias) muestran una asociación secundaria con DR4 (DRB1*04 DQA1*03 DQB1*0302). Las asociaciones de los genes HLA con las manifestaciones clínicas de la enfermedad permanece controvertido. Además,la EM presenta una recurrencia familiar del 10-20%. La posibilidad de que la EM familiar tenga rasgos clínicos distintivos es objeto de controversia. Existen escasos datos sobre la prevalencia y las características clínicas de la EM familiar en España. El 30% de pacientes con EM tratados con interferón beta (IFNB) no muestran una clara respuesta positiva al tratamiento. OBJETIVOS 1,- Investigar la hipótesis de que la EM familiar es una enfermedad similar a la EM esporádica en la provincia de Málaga. 2,- Investigar las posibles asociaciones HLA de clase II (DRB1, DQA1 y DQB1) con la EM en Málaga. 3,- Investigar las posibles asociaciones del los alelos y haplotipos HLA de clase II con las características clínicas de la EM. 4,- Investigar las posibles diferencias clínicas basales y de antígenos de histocompatibilidad HLA entre los pacientes sin beneficio clínico del tratamiento con IFNB y los que sí lo presentan. MATERIAL Y MÉTODOS PACIENTES: Desde 1990 una cohorte de 634 pacientes consecutivos con EM han sido seguidos prospectivamente en el Hospital Regional Universitario Carlos Haya de Málaga. Durante el periodo 1998-2000 genotipamos 149 pacientes con EM. Todos tenían progenitores españoles caucasoides, eran residentes en Málaga y tenían una EM clínicamente definida según los criterios de Poser. Se buscaron activamente las familias con más de un caso de EM, encontrándose 34 casos (5,4%) en 19 familias.Además, estudiamos 72 pacientes en tratamieto con IFNB durante un mínimo de un año y los clasificamos en dos categorías: respondedores en 2 ó más brotes y/o progresión de 0,5 ó más puntos en la escala EDSS tras un año de tratamiento. Analizamos las características clínicas de todos los pacientes: sexo, edad, edad de comienzo, síntomas de comienzo, forma clínica según la clasificación de Lublin, duración de la enfermedad, EDSS e índice de progresión. CONTROLES: 160 controles sanos fueron seleccionados del banco de donantes de sangre y fueron apareados por edad y sexo. Todos eran residentes permanentes en Málaga. MÉTODOS DE GENOTIPOS HLA DE CLASE II: Analizamos las subregiones de HLA clase II DRB1, DQA1 y DQB1 mediante la reacción en cadena de la polimersas y con hibridación inversa con series específicas de sondas de oligonucleótidos (PCR/SSO, Inno-Lipan, Innogenetics) para DRB1 y DQB1 con cebadores secuencias especificos (PCR/SSP, Dynal) para los subtipos de DRB1 y el locus DQA1. ANÁLISIS ESTADÍSTICO: Los datos clínicos y de HLA fueron introducidos en una base de datos y analizados con el programa estadístico SPSS, versión 9.0 para Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Las frecuencias de los alelos DRB1, DQA1 y DQB1 de los pacientes y los controles fueron comparadas utilizando x2 con la corrección de Boinferroni para comparaciones múltiples. Las comparaciones entre el genotipo HLA y las características clíncias se realizaron mediante el test de x2 para las variables categorías: sexo, síntoma de comienzo, forma clínica, respuesta al taratamiento con IFNB y mediante los tests de T Student o Mann-Whitney para las variables cuantitativas: edad de comienzo, edad en el momento del estudio, tiempo de evolución de la enfermedad, puntuacion EDSS en el momento del estudio y el índice de progresión. Se realizó un análisis multivariante mediante un modelo de regresión logística que incluía los alelos HLA de clase II como variables independientes, y la condición de pacientes con EM o control como variable dependiente. RESULTADOS Las caracteristícas clínicas de los pacientes genotipados era similares a las de la cohorte completa de Málaga. Se detectaron asociaciones positivas entre la EM y los alelos HLA de clase II DRB1*1501 (45,6% vs 21,3%, p corregida (pc) = 0,001, odds ratio (OR) = 3,1 (IC 95% = 1,89-5,11)), DQA1*0102 (51% vs 29,4%, pc = 0,001, OR = 2,3 (IC 95% = 1,48-3,) y DQB1*0602 (45% vs 20,6%, pc = 0,001, OR = 3,1 (IC 95% = 1,90-5,18) y el ahplotipo DR2 (DRB1*1501 DQA1*0102 DQB1*0602) (43,6% vs 20%, pc= 0,002, OR = 3,09 (IC 95% = 1,86-5,12). Ninguno de los alelos o haplotipos HLA clase II estaba significativamente asociado a ninguna de las características clínicas estudiadas en nuestros pacientes con EM. No se detectaron diferencias significativas entre las características clínicas ni en las distribuciones de los alelos y haplotipos HLA de clase II de nuestros pacientes con EM familiar y esporádica 52 (72%) de los pacientes era respondedores y 20 pacientes (27%) eran no-respondedores al IFNB.Las características clínicas basales eransimialres en ambos grupos, excepto la puntuación media EDSS al comienzo del tratamiento, que era significativamente mayor (p= 0,001) en el grupo de pacientes no-repondedores )3,9 +- 1,2) que la de los respondedores (2,4 +- 1,01). Ninguno de los alelos haplotipso Hla de clase II estaba significativamente asociado con la respuesta al IFNB.

Autor: MARTÍNEZ MORENO JOSÉ MANUEL.
Año: 2001.
Universidad: MALAGA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA DE MÁLAGA.

Resumen: Los objetivos del presente trabajo son: determinar la actividad HDC y la expresión génica en enterocitos aislados de la mucosa de yeyuno e íleon de cerdos domésticos sanos. Estudiar la morfometria de las vellosidades intestinales, actividad y expresión génica de la HDC a nivel transcripcional (ARNm) en enterocitos aislados sometidos a NE, NPT, SBP, resección intestinal baja del 75% y glutamina oral o parenteral. Estudiar la relación entre la actividad enzimática HDC y la morfometría de las vellosidades intestinales. El tejido utilizado fueron fragmentos de 15-20 centímetros de íleon y yeyuno tomados antes de la manipulación quirúrgica y 7,14 y 42 días después de la operación. Los enterocitos se obtuvieron por rascado de la mucosa intestinal con un bisturí. Para la morfometría se realizaron cortes de 7 mm., y se tiñerón con hematoxilina-eosina. La actividad HDC se determinó midiendo la producción CO2 marcado con carbono 14, procedente de histidina marcada con carbono 14 en el carbono 1. Para determinación de la expresión génica se empleo la RT. PCR aditiva.

Autor: LÓPEZ MARTÍNEZ MÓNICA.
Año: 2001.
Universidad: PAIS VASCO.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: La alta incidencia del cáncer oral en la Comunidad Autónoma del País Vasco en comparación con otros registros españoles, 24,1/100.000 casos en hombres y 3,1/100.000 en mujeres, apunta hacia la necesidad de futuras acciones preventivas en este aspecto. En este sentido, la detección de alteraciones moleculares implicadas en la tumorigénesis del cáncer oral de células escamosas (COCE), tales como la inactivación de los genes supresores tumorales p16/INK4a, p14/ARF y p53 y del reparador del ADN MGMT, podría constituir un factor pronóstico de la evolución de las lesiones orales premalignas hacia cáncer oral. El análisis de muestras citológicas de la cavidad oral en pacientes con lesiones precancerosas y cancerosas ha permitido la detección de alteraciones en estos genes implicados en la carcinogénesis oral. El método de análisis molecular de las células desprendidas de la mucosa oral, desarrollado en este estudio, ha demostrado ser un procedimiento fiable y poco agresivo para la detección de células malignas en pacientes con riesgo de desarrollar un carcinoma de células escamosas. Este método en combinación con los datos clínico-patológicos convencionales en pacientes con riesgo de desarrollar un carcinoma oral puede permitir establecer unos criterios más fiables sobre la actitud terapeútica y pronóstica de una lesión precancerosa. Del mismo modo, posibilitaría realizar un mejor seguimiento de los pacientes tratados de un COCE.

Autor: LUIS JIMENÉZ OSCAR DE.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS UNIV. AUTÓNOMA DE MADRID (MÓDULO CX).

Resumen: El síndrome de Williams-Beuren (SW) consiste en una afectación multisistémica en el desarrollo que afecta a los sistemas nervioso central, cascular, endocrino y al tejido conectivo. Los pacientes presentan un patrón de personalidad y cognitivo característico. La base molecular del SW consiste en una deleción heterozigota en la banda cromosómica 7q11.23, definiéndose un intervalo típico delecionado de 1.6 Mb encontrado en la gran mayoría de los pacientes estudiados. El intervalo típico delecionado contiene hasta 15 genes en copia única. Solamente para el gen de la elastina ha sido demostrada una correlación entre fenotipo SW (alteraciones vasculares como la estenosis aórtica suplavalvular y alteraciones del tejido conectivo) y hemizigosis. La hemizigosis para el gen de la LIM quinasa I ha sido relacionado con los problemas de cognición visuoespacial, como parte necesaria pero no suficiente de un problema multifactorial. Para el resto de genes descritos en el intervalo, la correlación entre hemizigosis y fenotipo SW aún no ha sido aclarada. El intervalo típico es flanqueado por tres regiones de secuencias repetidas en bajo número de copias, denominadas duplicones. El duplicón centromérico se localizan a 5' del primer gen delecionado del intervalo, el duplicón medial se localiza a 3' del último gen delcionado del intervalo, y el duplicón telomérico se localiza a 3' del medial, en orientación invertida respecto a los dos primeros (en tándem entre sí). Cada duplicón mide aproximadamente 320 kb y contiene tres bloques génicos diferenciados, denominados A (110 Kb), B (120 Kb) y C (80-100 Kb). Los duplicones presentan una alta identidad de secuencia entre ello, haciendo ésta región susceptible a reordenamientos cromosómicos locales. Está propuesto que la deleción hemizigota surge por alineado inter- o intracromosómico incorrecto entre los bloques B de los duplicones centromérico y medial durante la meiosis. El estudio por cartografiado comparativo del genoma de otras especies es un herramienta que permite tanto el estudio de las relaciones evolutivas entre las especies como la validación de una especie como modelo animal de un síndrome humano. En el caso del SW, en el cromosoma 5 de ratón (bandas G1-G2) ha sido descrito un grupo sinténico con 7q11.23 que no presenta duplicones y que contiene en copia única y en el mismo orden todos los genes del intervalo crítico y de los duplicones humanos. En la evolución entre ratón y primates no se ha descrito la presencia de duplicones flanqueando la región de SW, pero sí se han aportado previamente indicios respecto a su posible presencia en primates. Los objetivos de ésta tesis son el clonaje y caracterización de genes delecionados en 7q11.23 y de sus correspondientes ortólogos murinos, la delimitación del intervalo delecionado y del punto de rotura en 7q11.23 y la caracterización de la aparición de los duplicones en la evolución de los primates. En el presente trabajo se han identificado, clonado posicionalmente y caracterizado los genes WBSCR14 y GTF2IL de la región cromosómica 7q11.23 humana. También han sido identificados, clonados posicionalmente y caracterizados sus correspondientes ortólogos murinos, Wbscr14 y Gtf2il: El gen WBSCR14 es de copia única y se encuentra en el interior del intervalo critico delecionado en el SW. Se sitúa entre los genes TBL2 y STX1A, en sentido transcripcional de telómero a centrómero. La estructura genómica abarca 33 Kb con 17 exones, 16 intrones y una región promotora inserta en una isla CpG. El mRNA consta de 3270 pb y codifica una secuencia polipeptídica de 852 aa que contiene, entre otros, un dominio bHLHLz que define a WBSCR14 como un nuevo miembro de la familia de factores de transcripción Mlx (Cairo y col., 2001). Se expresa preferente en hígado adulto y durante el desarrollo fetal. Se ha caracterizado un nuevo microsatélite polimórfico intragénico con una heterocigosidad del 40%. El ortólogo murino Wbscr 14 presenta un mRNA de 3131 pb codificando una proteína de 864 aa con los mismos dominios y un patrón de expresión que se incrementa durante el desarrollo fetal siendo similar en el animal adulto. Ha sido cartografiado en la banda G1 del cromosoma 5 de ratón, región sinténica con 7q11.23 humana. WBSCR14 podría participar en funciones de regulación del desarrollo de vertebrados (regulación hepática y desarrollo fetal hepático tardío) y estar implicado en alguno de los aspectos fenotípicos del SW. El gen GTF2IL existe en tres copias localizadas en los bloques B de cada duplicón que flanquean el intervalo delecionado, conjuntamente con los genes GTF21 y NCF1, en dirección transcripcional opuesta a ambos. La estructura genómica de cada locus abarca 56 Kb en las que contiene 16 exones, 15 intrones y una región promotora aparentemente sin caja TATA. El mRNA consta de 3471 pb codificando una secuencia aminoacídica deducida de 949 aa (copia media) y 967 aa (copias centromérica y telomérica). La proteína presenta dos repeticiones internas derivadas de GTF21 con estructura HLH, un dominio zinc-finger de tipo C2H2 y una significativa homología con transposasa (Buster 1), lo cual sugiere posibles acciones directas sobre el ADN, quizá como factor de transcripción. Una copia queda delecionada en pacientes con SW (la centromérica en la mayoría de los casos). Presenta un patrón de expresión ubicuo tanto durante el desarrollo como en estadío adulto en los tejidos analizados y hay constancia sólo de expresión de las copias medial y telomérica. El ortólogo murino Gtf2il es de copia única y su mRNA de 3251 pb codifica una secuencia aminoacídica deducida de 936 aa con los mismos dominios. Presenta un patrón de expresión ubicuo en los tejidos analizados, prácticamente basal durante el desarrollo y preferente en hígado y testículo en estadío adulto. Dado que la(s) copia(s) funcional(es) del gen no quedan delecionadas en pacientes con SW, es improbable que participe en el fenotipo, si bien su función podría complementar de alguna manera la pérdida de GTF21 y GTF2IRDI. Se han caracterizado los puntos de rotura cromosómicos para un paciente concreto afecto de SW cuyo cromosoma delecionado había sido separado en híbridos somáticos. El fragmento de unión se localiza en la región intergénica entre GTF2IL y NCF1. Por genotipado y Southern Blot, se han refinado los puntos de rotura en un cierto número de pacientes adicionales, y parecen ocurrir en NCF1/P1 o en la región intergénica descrita. Ensayos recientes no incluídos en esta tesis han demostrado la variabilidad en el punto exacto de rotura entre pacientes, si bien todos se concentran en el bloque B. Estos resultados indican la existencia de una predisposición preferente de este bloque para el malalineamiento cromosómico, pero la ausencia de puntos calientes para la recombinación desigual dentro del intervalo. Ello descarta la posibilidad de establecer un test molecular simple como herramienta para detectar fragmentos de unión y diagnósticar el SW. El estudio llevado a cabo en distintas especies de primate sobre la presencia y número de copias de los genes GTF2l, GTF2lL, NCF1, POM121 y STAG3 ha permitido establecer en la existencia de todos ellos en copia única hasta hace 35 millones de años. El bloque A que contiene secuencias relacionadas con STAG3, se detecta duplicado en gorilas y probablemente triplicado en chimpancés. Los bloques B y C no aparecen duplicados hasta los seres humanos. En discusión con datos publicados anteriormente, se ha propuesto que la estructura final de los duplicones que flanquean la deleción aparece como tal en humanos, sugiriéndose un cambio evolutivo reciente. Se ha establecido un modelo de formación y expansión de los duplicones basado en el modelo de evolución cromosómica propuesto previamente por diversos autores para el cromosoma 7 humano, y en la expansión por duplicaciones previas del bloque A que posteriormente mediaron la dos duplicaciones de bloques B y C hasta las tres copias.

Autor: MARTÍNEZ LAMPARERO ANA.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: INSTITUTO DE INVESTIGACIÓN BIOMEDICAS ALBERTO SOLS.

Resumen: La ATPasa de calcio del retículo sarco/endoplásmico (Sarco/Endoplasmic Reticulum CaATPase, SERCA) es una proteína integral de membrana implicada en el transporte de calcio desde el citoplasma al retículo sarcoplásmico de las células musculares o al endoplásmico de las no musculares. Esta proteína presenta en el crustáceo Artemia franciscana dos isoformas distintas que se expresan en diferentes tejidos. Una de ellas está codificada por un mRNA de 4.5 kb que se expresa en músculo y la otra por un mRNA de 5.2 kb que se expresa en la totalidad de los tejidos. Cada uno de estos mRNAs se transcribe desde uno de los dos promotores alternativos que posee este gen. El estudio de los dos promotores que presenta este gen en el curstáceo Artemia franciscana ha sido el objetivo de esta Tesis. Se ha intentado identificar y caracterizar las principales regiones reguladoras presentes tanto en el promotor muscular (Pr 1) como en el promotor no muscular (Pr 2). Por un lado se han realizado estudios de unión de proteínas nucleares de Artemia a los promotores mediante técnicas de protección a digestión por Dnasa I. Ambos promotores presentan zonas protegidas cuando se incuban sondas de dichos promotores con extractos de nauplias. Estas regiones no aparecen cuando se incuban dichas sondas con extractos de quistes, lo que sugeriría la existencia de distintos factores de transcripción en embriones enquistados y en nauplias. También se han realizado ensayos funcionales mediante técnicas de expresión transitoria en células de mamíferos. Los dos promotores son activos en células de mamífero, si bien el promotor muscular presenta una más baja actividad. En células de insecto la actividad de ambos promotores es muy baja. Los estudios realizados han permitido detectar en el promotor no muscular regiones reguladoras de la actividad transcripcional situadas a 1.2-1.4 kb del origen de transcripción, una activadora, en la zona más distal del promotor, y una represora situada en una región más proximal respecto al inicio de transcripción. Este tipo de estudios no permitió detectar ninguna región reguladora del promotor muscular en células de mamífero, lo cual podría justificar la escasa actividad del promotor en estas células.

Autor: JIMÉNEZ FERNÁNDEZ M. DOLORES.
Año: 2001.
Universidad: CORDOBA.
Centro de lectura: INGENIEROS AGRÓNOMOS.
Centro de realización: E.T.S.I.A.M..

Resumen: Los tritórdeos son híbridos obtenidos por el cruzamiento entre una cebada silvestre y diferentes tipos de trigo potencialmente dotados de un alto contenido proteico. En este trabajo se ha procedido a la identificación de este material desde dos puntos de vista fundamentalmente: A,- CITOLÓGICO Se ha determinado el contenido proteico y de ARNr de distintas combinaciones genómicas realizadas indistintamente con los genomios A, B, D, propios del trigo y los H y R propios de cebada y centeno respectivamente. Así mismo se han establecido estadísticamente las posibles relaciones entre estos contenidos y otros parámetros como el área nucleolar, número máximo de nucleolos, número medio de nucleolos y ADN. B,- BIOQUÍMICO Se ha procedido a la caracterización bioquímica de generaciones avanzadas de tritórdeo. Para ello se han determinado del contendio proteico de las semillas, el contenido en fibras ácido y neutro detergente (ADF y NDF), el perfil aminoacídico, el fraccionamiento proteico y el contenido en nitrógeno no proteico (NNP). La fracción proteica gliadina resultó ser la mayoritaria por lo que se procedió también a la determinación de los aminoácidos de la misma. Entre todos ellos se han estudiado estadísticamente sus correlaciones. Nuestros estudios revelan la potencialidad de este nuevo material en cuanto al contenido proteico.

Autor: LLAMAS AZÚA ANGEL.
Año: 2001.
Universidad: CORDOBA.
Centro de lectura: CIENCIAS .
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: Además de nutriente, el nitrato es una molécula señal que regula una serie de procesos metabólicos y de diferenciación. Como señal positiva, el nitrato regula la expresión de genes implicados en su propia asimilación, como son los trasnportadores de nitrato y nitrito (TN, Tni), la nitrato reductasa (NR) y la nitrito reductasa (NiR). En cuanto a procesos de diferenciación, el nitrato interviene en la morfogénesis de la raíz. El objetivo de esta Tesis Doctoral ha sido el profundizar en los mecanismos de señalización positiva de la ruta de asimilación de nitrato de Chlamydomonas reinhardtii. Mediante mutagénesis insercional, con un gen que confiere resistencia al antibiótico Zeomicina (ble) se ha pretendido identificar posibles nuevos genes relacionados con la señalización positiva del nitrato, se ha demostrado: 1,- Que el gen ble no es un marcador selecionable adecuado para mutagénesis insercional en Chlamydomonas, debido al efecto mutagénico de la Zeomicina. 2,- El gen Nit2 es esencial para la expresión de la NR. Se ha realizado un estudio de la actividad de promotores de varios genes de la ruta de asimilación de nitrato (Nia1, Nrt2;1, Nar1) fusionados al gen reportero de la Arilsulfatasa como sensor de la señalización positiva. Se ha comprobado que el fenómeno de autorregulación de Nia1 se explica por una señalización persistente del nitrato debido a la ausencia de NR y a la presincia de un sistema de transporte de alta afinidad. Demostrándose que son los distintos sistemas de transporte de nitrato y/o nitrito, dependiendo de su afinidad capacidad, y especificidad para transportar nitrato o nitrito, así como otras características de inhibición por otros factores ambientales, son los que regulan la concentración intracelular de nitrato y así la expresión de los genes que activa. El gen Nit2 tiene una regulación muy precisa, está sujeto a represión por amonio pero no a inducción por nitrato, y es esencial para sentir el nitrato intracelular. Se ha Estudiado el nitrito como señal en los genes de la asimilación de nitrato, se ha comprobado que el nitrito per se es una señal positiva para la expresión de los genes Nar1 y Nrt2;1 pero no para Nia1.

Autor: KOSOY DAROQUI ANA.
Año: 2001.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGÍA.

Resumen: El factor Gaga está involucrado en una gran variedad de procesos relacionados con transcripción en Drosophila. La región genómica correspondiente con el promotor TRL fue obtenida y una visión mínima del promotor TRL fue definido utilizando transfecciones transitorias en células Sa. Mediante análisis de footprinting con DNAsaI de esta región localizamos múltiples lugares de unión para Gaga sugiriendo un papel regulatorio potencial para Gaga sobre su propio promotor. El estudio demostró que Gaga regula negativamente su promotor. Esta represión es dependiente de la unión Gaga al DNA. Un fragmento de 400 pares de bases del promtor del TRL es capaz de mediar represión en un promotor heterólogo. Nuestros resultados abren la posibilidad de observar efectos de represión mediados para Gaga.

Autor: LAGE MARTIN JOSE MANUEL.
Año: 2000.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: MEDICINA .
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: Diversas técnicas para el diagnóstico del cáncer necesitan muestras de ADN procedentes de un reducido número de células. Estas células pueden ser extraídas del conjunto heterogéneo de células que constituyen el tumo mediante microdisección, que garantiza la homogeneidad de las células de interés. Hasta la fecha se handesasrrollado diveros métodos de amplificacióndel ADN genómico procedente de estas células de interés, ya que en caso contrario resultaría insuficente el ADN genómico original para abordar el diagnóstico. Estos métodos se fudamentan en la técnica de amplificación mediante PCR o "reacción en cadena de la polimerasa". En el desarrollo de esta tesis se muestra la optimización de un método de amplificación isotérmica como alternativa a los métodos derivados de la PCR, Este método, por su simplicidad, podría facilitar su uso en análisis diagnósticos que requiriesen un elevado número de muestras, ya que sería fácilmente automatizable. Para comprobar la homogeneidad de la reacción se realizó un análisis preliminar mediante la técnica de array-CGH, estableciendo una comparacióne ntre un ADN genómico no amplificado,y un ADN aplificado de una línea celular de cáncer de mama. Igulamente se desarrollaron microarrays de ADN complementario con los que evaluar sobre un mayor número de genes la homogeneidad de la amplificación isotérmica de ADN genómico.

Autor: MORCILLO HIDALGO LUIS.
Año: 2000.
Universidad: MALAGA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: MEDICINA - FACULTAD.

Resumen: El objetivo de este estudio, ha sido analizar la influencia de tres polimorfismos del sistema renina angiostensina RAS, sobre los niveles plasmáticos deangiotensina I, angiotensina II y angiotensian (1-7). Se selecionó una población joven de 93 individuos sanos. Los péptidos fueron separados por HPLC y cuantificados por RIA, los genotipos fueron determinados por PCR y posterior digestión enzimática No se encotraron diferencia en los niveles plasmáticos de los péptidos en los nueve genotipos de la población, sin embargo, cuando los sujetos fueron distribuidos por sexos se observó un aumento de angiotensina (1-7) en hombres respecto a mujeres. Entre genotipos aquellos hombres con alelo T tuvieron mayores niveles de angiotensina (1-7) que aquellos con el alelo M. Las mujeres con el genotipo DD mostraron un aumento no significativo de angiotensina I y II. La correlación lineal entre los péptidos fue significativa entre AI/AII y AII/A (1-7),pero no mostraron correlaciónden AI/A (1-7). Existe una diferencia por sexos en los niveles de A(1-7). Cuando la poblaciónse distribuye por sexos, se puede observar que los genotipos ejerceninfluencias en los niveles plasmáticos de los péptidos de la angiotensina. La angiotensina II se presenta como un sustrato preferente con respecto a la angiotensina I para la síntesis de A (1-7). Estas diferencias sugieren que las hormonas sexuales afectan a la regulación del RAS, quizás a través de la renina, siendo mas claro este efecto en hombres en el polimorfismo M235T y en mujeres en el polimorfismo I/D.

Autor: MARTÍN PEÑA MERCÉ.
Año: 2000.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: INSTITUT MUNICIPAL D'INVESTIGACIÓ MÉDICA IMIM.

Resumen: El gen DCC está localizado en la zona cromosómica 18q21 la cual se encuentra deplecionada en un gran número de tumores y cuya ausencia correlaciona, en muchos casos, con los estadios más avanzados del tumor. Por ello, DCC ha sido propuesto desde su identificación, como buen candidato a supresor tumoral. DCC codifica para una proteína transmembrana de aproximadamente 180 kDa, cuyo dominio extracelular contiene 6 subdominios fibronectina tipo III y 4 inmunoglobulina C-like. Por ello DCC, junto con la neogenina, forma una subfamilia dentro de la superfamilia de las inmunoglobulinas. En cambio el dominio intracelular, forma una subfamilia dentro de la superfamilia de las inmunoglobulinas. En cambio el dominio intracelular no posee consensus de dominios funcionales ni homologías con otras proteínas a excepción de la negoenina. En cuanto a su función celular, se ha demostrado que el DCC actúa como receptor de la netrina-1 en el sistema nervioso, ejerciendo un papel en la guía axonal durante el desarrollo. Por otra parte, se había propuesto con anterioridad que DCC podía tener un papel en la diferenciación mucrosecretora y neuronal, y en la adhesión celular de células PC-12 y fibroblastos. Más recientemente se ha implicado DCC en la apoptosis y el ciclo celular. El objetivo de esta tesis ha sido elucidar la función del DCC en las células del sistema gastrointestinal. Para ello, hemos analizado la expresión del DCC por RT-PCR en un papel de líneas celulares derivados de cáncer de colon que presentan diferentes fenotipos o grados de diferenciación y por immunohistoquímica en tejido normal. Nuestros resultados sugieren que el DCC no tiene una implicación directa en la diferenciación mucosecretora o absortiva de las células del epitelio gastrointestinal. De acuerdo con esta hipótesis, la expresión ectópica del DCC, mediante tranfección estable en células HT-29, no induce la expresión de marcadores de diferenciación. No obstante, la presencia del DCC aumenta la adhesión célula-célula y disminuye la adhesión célula-matriz de las HT-29. En efecto, el número de desmosomas así como su complejidad estructural, es mayor en las células que expresan DCC. Asimismo, la integrina alfa6beta4, propia de hemidesmosomas, así como proteínas de adhesiones focales, como es el caso de la talina, sufren una desorganización en las HT-29 como resultado de la expresión del DCC. Por otro lado hemos observado una fuerte reducción del número de fibras de estrés de actina, mientras que el citosqueleto de filamentos intermediarios y el de microtúbulos no parece afectado. El análisis del dominio citoplasmático del DCC ha revelado una región yuxtamembrana de 30 aminoácidos que presenta características propias de dominios proteicos que unen proteínas ERM. El análisis por microscopia confocal en células COS-1 cotransfectadas con el cDNA del DCC y de la ezrina, muestra zonas de colocalización sugiriendo una interacción entre ambas proteínas. Ensayos de asociación in vitro han demostrado que el DCC interactúa de foram específica con el dominio N-terminal de la ezina y del NF-2, muy probablemente mediante esta región yuxtamembrana de 30 aminoácidos que nosotros hemos denominado EBD (ERM Binding Domain), ya que el dominio N-terminal del DCC carente del EBD no es capaz de unir las ERM. Además, ensayos de co-inmunoprecipitación utilizando extractos proteicos de células COS-1 transfectados con el cDNA del DCC, han demostrado que una pequeña proporción de ezina endógena interacciona in vivo con el DCC. Nuestros resultados sugieren que el DCC podría ejercer su función como supresor tumoral debido a su acción sobre la adhesión celular, la cual vendría mediada a través de una vía de señalización en la cual participarían las ERM's.

Autor: SOLANS PUJOL M. ASUNCION.
Año: 2000.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: El cromosoma 21 (HSA21) es el más pequeño de los cromosomas humanos y representa alrededor de un 1,2% del genoma humano. El HSA21 ha sido ámpliamente debido a su condición de cromosoma más pequeño y al hecho de que en su brazo largo se encuentran localizadas más de 20 enfermedades diferentes, como la homoscistinuria, dos formas de sordera congénita, una fomra de la enfermedad de Alzheimer o la esclerosis lateral amiotrófica, entre otras.Además la trosomía del HSA21 es la aneuploidía más común y da como resultado el síndrome de Down (SD),la primera causa de retraso mental en recién nacidos. El SD tiene una incidencia de uno cada setecientos nacimientos y se debe a la existencia de tres copias del HSA21. La mayoría de los casos (95%) están causados por una trisomía completa del HSA21, consecuencia de una no disyunción del HSA21 enla linea germinal de uno de los progenitores. El resto de los casos son consecuencia de translocaciones cromosómicas, incluyendo translocaciones Robertsonianas i mosaicismo entre una trisomía completa y células euploides con trisomías parciales. En todos los casos, el resultado es una triple dosis del HSA21 o de parte del HSA21. El SD se caracteriza por una serie de rasgos fenotípicos que afectan diferentes tejidos y órganos, entre los cuales destaca el retraso mental,la hipotonía, la infertilidad en los hombres y una patología similar a la enfermedad de Alzheimer que se dan con una incidencia del 100% de los casos. El resto de los rasgos fenotipícos tiene una incidencia variable. El objetivo principal de este trabajo es contribuir a la construcción del mapa físico y transcripcional del HSA21, además de la identificación de nuevos genes que se localicen en el brazo largo del HSA21 y que puedan estar relacionados con el fenotipo que caracteriza el SD. Para la construcción de un mapa físico de alta resolución se ha realizado la construción de mapas contiguos de cósmidos solapados a partir de tres YACs, en tres regiones diferentes del brazo largo del HSA21. El aislamiento de nuevos genes se ha realizado mediante las técnicas de selección de cDNAs y del clonaje in silico. La caracterización de 5 nuevos genes (FTCD, BACE2, C2lorf7, G3PPL i F4-31) ha implicado la secuenciación del cDNA humano completo, el estudio del patrón de expresión en diferentes tejidos, la determinación de la estructura genómica, el asilamiento y secuenciación de los ortólogos en ratón, y estudios funcionales.