PROTEINAS, 2

Autor: BALSERA DIEGUEZ MONICA.
Año: 2003.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: EDIFICIO HISTORICO .
Centro de realización: INSTITUTO DE RECURSOS NATURALES Y AEROBIOLOGA (IRNA, CSIC).

Resumen: Este trabajo de Tesis Doctoral se ha centrado en el análisis estructural y de estabilidad conformacional de PsbQ (Photosystem II(b) protein Q), una de las principales proteínas extrínsecas asociadas al fotosistema II (PSII) en plantas superiores y algas verdes. Esta proteína, junto con las proteínas PsbP y PsbO, es esencial para la estabilidad funcional y estructural del complejo de fotolisis del agua en plantas. Se ha optimizado el protocolo de aislamiento de PsbQ en espinaca para evitar su degradación proteolítica; además, se ha sobreexpresado la proteína recombinante en E. coli y se ha aislado y purificado para mejorar el rendimiento en la obtención de proteína. Los estudios hidrodinámicos realizados demuestran que la proteína PsbQ es un monómero con estructura alargada, que se comporta como una partícula estable y homogénea en disolución a 20 ºC. El análisis estructural se ha realizado combinando técnicas espectroscópicas, bioinformáticas, cristalografía de rayos-X y calorimétricas. Los datos estructurales muestran que PsbQ consta de una región N-terminal (1-45 residuos) compuesta mayoritariamente por estructura no regular y extendida, y una región C-terminal (46-149 residuos), más compacta, formada por un haz de 4 a-hélices invertidas. En la región N-terminal aparece una poliprolina tipo-II, con estructura de hélice a izquierdas, que podría estar implicada en la interacción con el PSII. Los residuos 14-32 no son visibles en el mapa de densidad electrónica, sugiriendo que es una zona flexible y posiblemente extendida en disolución. PsbQ es una proteína estable frente a la desnaturalización inducida por agentes químicos (GdnHCl) y temperatura. El proceso de desnaturalización es reversible y se ajusta al modelo clásico de dos estados (N " D) Los dos estados desnaturalizados son equivalentes tanto estructural como energéticamente. La máxima estabilidad de PsbQ in vitro se encuentra en el intervalo de pH 5-8, que podría estar relacionado con el pH óptimo de funcionamiento del lumen.

Autor: GONÇALVES PINA DAVID.
Año: 2003.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: FACULTAD DE BIOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGIA.

Resumen: La toxina Shiga es una proteína constituida por dos fragmentos, el denominado fragmento A, que tiene una actividad catalítica responsable de la inhibición de la síntesis de proteínas, y el fragmento B (STxB), responsable del transporte intracelular, mediante unión a un receptor en la membrana, hacia el citosol. La STxB es un homopentámero con 69 residuos por monómero que se utiliza actualmente como instrumento en la caracterización de la maquinaria involucrada en la ruta inhabitual que sigue, denominada transporte retrógrado, pasando de los endosomas tempranos directamente al aparato de Golgi y al retículo endoplásmico. Tiene además aplicación en la vectorización de medicamentos para tratamientos terapéuticos. Esta proteína reúne características idóneas para realizar estudios de estabilidad, pues su desnaturalización es un proceso reversible, y por lo tanto permite interpretar su mecanismo inverso, el plegamiento. Conocer los estados que esta proteína adopta para plegarse nos permitiría saber si existen intermediarios que podrían explicar como STxB logra translocarse a través la membrana. Así, en este trabajo se caracterizaron los parámetros termodinámicos de la desnaturalización de STxB frente a la temperatura, pH y guanidina hidrocloruro, utilizando técnicas biofísicas como son la calorimetría diferencial de barrido, el dicroismo circular, y la espectroscopía de infrarrojo. Los datos experimentales muestran que en todos los casos, STxB se desnaturaliza de modo cooperativo, según un modelo en el cual se considera tan solo la existencia de dos estados poblados, el pentámero nativo y el monómero desplegado, con la disociación del pentámero ocurriendo en simultáneo con el desplegamiento de la proteína. De acuerdo con este modelo, las transiciones térmicas reversibles, demuestran una dependencia frente a la concentración de proteína. Un análisis teórico de los parámetros termodinámicos sugiere que el monómero aislado no es estable en su conformación nativa y que son las interacciones entre los monómeros que estabilizan la estructura.

Autor: FERNÁNDEZ RAMOS CAROLINA.
Año: 2003.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: La Tripanosomiasis Americana (enfermedad de Chagas), es una infección protozoaria causada por el flagelo llamado Trypanosoma cruzi, ampliamente extendido por el Continente Americano. En Países endémicos se estima que 16-18 millones de personas están infectadas por el parásito. El impacto médico y social de la enfermedad de Chagas es alto, estimandose que se pierden hasta 1.208.5 millones de dólares/año a causa de la enfermedad. Un problema en aumento en toda América es la transmisión de la enfermedad a través de la transfusión de sangre, siendo la segunda vía deinfección de Trypanosoma cruzi. Si se tiene en cuenta las emigraciones de Sur a Norte, no solo constituye un problema en Sudamérica sino también en Norteamérica e incluso en Europa. De ahí la necesidad de buscar marcadores que tengan valor diagnóstico. El trabajo experimental durante el primer año ha consistido en el aislamiento de las proteínas biotiniladas y el estudio de su localización ultraestructural. Para ello después del cultivo "in vitro" de las formas epimastigotas de T.cruzi y la obtención del total de proteínas, se procedió a la purificaicón de estas proteínas utilizando Cromatografía de Afinidad, seguido de la diálisis y la concentración de las mismas por liofilización. A continuación se procedió al estudio de sus propiedades químicas, como el conocimiento de los pesos moleculares o los puntos isoeléctricos utilizando técnicas electroforéticas. Para averiguar la localización ultraestructural de estas proteínas se utilizaron técnicas inmunocitoquímicas por Microscopía Electrónica de Transmisión. Durante el segundo año, y con el objetivo de estudiar las propiedades inmunogénicas de estas proteínas y su valor como marcador diagnóstico. Se inmunizaron animales de experimentación y se estudió como reaccionaban estas proteínas frente a distintos sueros chagásicos bien caracterizados así como a frente a otros sueros no chagásicos utilizando la técnica de inmunotransferencia.

Autor: PÉREZ PULIDO ANTONIO JESÚS.
Año: 2003.
Universidad: MALAGA.
Centro de lectura: CIENCIAS .
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: Desarrollo de una herramienta computacional para la asignación de función a proteínas o a sus dominios e implementada en un servidor web denominado AnaGram. El sistema funciona en dos etapas diferentes que finalmente dan como resultado una predicción de función para una secuencia problema dad: 1) Primero son seleccionados pequeños fragmentos peptídicos comunes entre la proteína problema y otras proteínas de las bases de datos, los cuales podrían actuar, como piezas modulares de la evolución para la construcción de péptidos funcionales y a los que llamamos protomotifs. 2) Y en una segunda etapa la función es asignada a la proteína, basándose en correlaciones entre los protomotifs encontrados y las anotaciones funcionales de las secuencias de donde proceden y contenidas en la base de datos de proteínas SWISS-PROT o en la de referencias bibliográficas MEDLINE. Además, también son usadas ontologías para definir mejor la predicción, las cuales organizan jerárquicamente las funciones encontradas. La potencia de AnaGram radica en que siempre encuentra algún tipo de similitud entre la secuencia analizada y otras proteínas con información funcional en las bases de datos, aunque otros métodos tradicionales no sean capaces de dar resultados significativos. Por todo ello, AnaGram puede ser usado para obtener información en experimentos de definición de función, mutagénesis dirigida y diseño de medicamentos. El sistema ya ha sido ensayado con conjuntos amplios y diversos de secuencias de protéínas, dando unos resultados muy positivos con todas ellas (Pérez et al., Comp. Funct. Gen., 3(5), 423-440).

Autor: OLMO MIRA MARIA FRANCISCA .
Año: 2003.
Universidad: CORDOBA.
Centro de lectura: FACULTAD DE CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: La reducción del nitrato tiene un papel importante en el ciclo biogeoquímico del nitrógeno e implicaciones en la agricultura, medio ambiente y salud pública. El nitrato actúa como un aceptor alternativo de electrones durante la respiración anaeróbica bacteriana y es la mayor fuente de nitrógeno para plantas y bacterias. En procariotas, la reducción de nitrato a nitrito se lleva a cabo por tres diferentes tipos de enzimas, Nas, Nar y Nap, con propiedades reguladoras y bioquímicas distintas. Además, tipos diferentes de nitrito reductasas están presentes en bacterias. Sin embargo, tanto las reducciones de nitrato como las de nitrito requieren la presencia de centros sulfoférricos, no sólo en las enzimas nitrato y nitrito reductasas, sino también en otros componentes del sistema de reducción de nitrato. En esta tesis doctoral se llevó a cabo el estudio de algunas proteínas sulfoférricas implicadas en la reducción del nitrato en bacterias fototróficas. Este estudio se desarrolló en dos estirpes del género Rhodobacter: R. sphaeroides DSM158, que contiene una sistema periplásmico (Nap) de reducción del nitrato, y R. capsulatus E1F1, que tiene un sistema asimilador (Nas). Las proteínas sulfoférricas estudiadas fueron NapF de R. sphaeroides DSM158 y Hcp, NasB y NirD de R. capsulatus E1F1. Resultados 1.- NapF es la única proteína sulfoférrica, además de la subunidad catalítica NapA, en el sistema de reducción periplásmica del nitrato en R. sphaeroides DSM158 y otras bacterias. La secuencia del gen napF sugiere la presencia de cuatro centros del tipo [4Fe-4S] que son unidos transitoriamente a la proteína, como también se dedujo de los estudios espectroscópicos de la proteína recombinante 6XHis-NapF purificada de E. coli. Además, una proteína nitrato reductasa inactivada mediante su incubación con bipiridilo fue reactivada por NapF sólo si también estaba presente la proteína cisteína desulfurasa NifS de Azotobacter vinelandii. Por lo tanto, el papel fisiológico de NapF es transferir el centro sulfoférrico a la apoproteína NapA antes de su transporte al periplasma. 2.- Las proteínas de centro híbrido (Hcp) se han estudiado ampliamente, principalmente debido a las propiedades características de sus centros sulfoférricos. La proteína Hcp de Rhodobacter capsulatus E1F1, codificada por el gen hcp dentro de la región nas de esta bacteria, se purificó como proteína recombinante en E. coli, fusionada a un motivo de polihistidinas. La proteína Hcp purificada contenía los centros [2Fe-2S] y [4Fe-2S-2O] y redujo hidroxilamina a amonio in vitro con metil viológeno como donador de electrones. La actividad hidroxilamina reductasa se caracterizó bioquímicamente y se obtuvo que se inhibió por oxígeno y por reactivos de hierro y azufre. Se ha propuesto un papel de la proteína Hcp implicada en la detoxificación de la hidroxilamina en R. capsulatus E1F1. 3.- NasB y NirD son las subunidades de la nitrito reductasa asimiladora de R. capsulatus E1F1, y ambas son proteínas sulfoférricas. En general, las nitrito reductasas asimiladoras bacterianas no están bien estudiadas, con la excepción de las de cianobacterias, pero en este caso la enzima usa ferredoxina en vez de NADH como donador de electrones. La proteína recombinante 6XHis-NasB se purificó en E. coli y se caracterizó bioquímicamente su actividad nitrito reductasa. Esta nitrito reductasa utilizó NADH como donador de electrones, el cual transfiere los electrones al nitrito a través de FAD, [4Fe-4S] y sirohemo. Consecuentemente, la reducción de nitrito se inhibió por agentes reactivos de hierro y azufre. Como la nitrato reductasa asimiladora de R. capsulatus E1F1 es también una enzima dependiente de NADH, estos resultados confirmaron que el NADH es el principal reductor en la asimilación de nitrato en Rhodobacter capsulatus E1F1.

Autor: REQUEJO AGUILAR RAQUEL.
Año: 2003.
Universidad: CORDOBA.
Centro de lectura: E.T.S.I. AGRONOMOS Y MONTES.
Centro de realización: E.T.S.I. AGRONOMOS Y MONTES.

Resumen: El presente trabajo de Tesis Doctoral, centrado en el estudio de la respuesta de maíz al arsénico, ha abarcado cuatro aspectos fundamentales: respuesta tóxica de maíz al arsénico, papel de las fitoquelatinas en la tolerancia, la acumulación y distribución del arsénico en plantas expuestas y, la influencia de la exposición a arsénico en la expresión proteica (proteoma) de raíces y parte aérea de maíz. El maíz es una especie relativamente tolerante a As, siendo el arsenito (AsIII) mucho más tóxico que el arseniato (AsV) deduciéndose que 75 micromolar de AsIII y 150 micromolar podían considerarse los valores de EC50 para estas especies. La raíz mostró menor sensibilidad al metaloide que la parte aérea, la longitud foliar fue más afectada por AsIII , ocurriendo lo contrario con el contenido de clorofila, más afectado por AsV. El As incrementó el contenido de tioles no proteicos de la raíz, no así de la parte aérea, de las plantas. Tal incremento se asignó mayoritariamente a fitoquelatinas, ya que los contenidos de GSH tendieron a decrecer. Esta inducción fue superior para AsV. La inducción por As no fue una respuesta específica de maíz, sino que que también se producía en garbanzo y girasol. El tratamiento con flurazol, un inductor de la síntesis de GSH y la actividad GST de maíz, fue capaz de reducir la toxicidad del As. Este efecto parece deberse a la acumulación de GSH y, sobre todo, de su precursor gamma-glutamilcisteína. Por el contrario, el BSO, un inhibidor biosintético del GSH, produjo hipersensibilidad a As. El maíz mostró una alta capacidad acumuladora de As (en torno a 1000 ppm), aunque de forma restringida a la raíz y siendo algo superior en respuesta a AsV que a AsIII. El tratamiento con quelantes como DMS y DMPS, no consiguió redistribuir el metaloide. La identificación, mediante electroforesis 2 DE, 11 y 7 proteínas de máxima modificación de expresión por efecto del tratamiento con arsénico en, respectivamente, raíz y parte aérea indica que, en el primer tejido, la inducción de defensas antioxidantes es la respuesta dominante mientras que, en el segundo, podría serlo una represión amplia de la síntesis proteica.

Autor: GIL DONES FÉLIX.
Año: 2003.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: INIA, DPTO. DE BIOTECNOLOGÍA.

Resumen: Las plantas se han utilizado con fines curativos desde hace miles de años, sin embargo la obtención de biofármacos y vacunas en plantas es más reciente. La ingeniería genética de plantas ha permitido la obtención de plantas transgénicas, para obtener estos productos de interés. Las plantas presentan un gran potencial como sistemas de producción de proteínas con interés terapéutico o vacunal, ya que son fácilmente transformables, se cultivan de forma económica y sencilla y presentan menos riesgos potenciales que los sistemas basados en animales. El uso efectivo de las plantas como sistemas de producción dependerá de mejorar los niveles de acumulación de proteínas a lo largo del ciclo de vida de la planta y en las siguientes generaciones.

Autor: DÍAZ LÓPEZ TERESA.
Año: 2003.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: QUÍMICA.
Centro de realización: CIB (CSIC).

Resumen: RepA es la proteína iniciadora de la replicación del plásmido de Pseudomonas pPS10. En un rango de concentración del orden de micromolar, RepA existe como dímero en disolución. Los dímeros se unen a dos repeticiones invertidas localizadas en el promotor del gen repA, reprimiendo su propia síntesis. Los monómeros, sin embargo, se unen a cuatro secuencias directamente repetidas del origen (denominadas iterones) iniciando replicación. RepA está compuesta de dos dominios "Winged-Helix (WH). Para unirse a la secuencia del iterón a través de los dos dominios. RepA debe acoplar la monomerización con un cambio conformacional en el dominio N-terminal (WH1), que incluye un motivo cremallera de leucinas. En esta Tesis se muestra por primera vez que la secuencia del iterón, in vitro, disocia los dímeros en monómeros y altera la conformación de RepA, sugiriendo un efecto alostérico. La información estructural reciente sobre el dímero de RepA, junto con la estructura de la forma monomérica de la proteína homóloga RepE del plásmido F, muestran las bases moleculares de la activación de proteínas Rep. En este trabajo se caracterizan mutaciones que sustituyen dos residuos de Leu por Ala en el motivo cremallera de leucinas de RepA. Este mutante, denominado RepA-2L2A, que desetabiliza el núcleo hidrofóbico del WH1, resulta en cambios estructurales que se asemejan a los que ocurren en la activación de la proteína. Proponemos en esta tesis que RepA-2L2A se asemeja a un intermediario de plegamiento en la ruta de obtención de monómeros activos. En este trabajo, se ha observado que interacciones de baja afinidad de la proteína RepA con las secuencias del operador y del iterón, se favorecen utilizando altas concentraciones (hasta 50 mg/ml) de BSA, Ovoalbúmina y Mioglobina. Estos aditivos proteicos, que ocupan una fracción significativa del medio y no participan directamente en la interacción, mejoran la unión inicial de la forma monomérica de RepA y desfavorecen la disociación del complejo, sugiriendo un efecto de aglomeración macromolecular. Mediante un análisis por resonancia del plasmón en superficie (SPR) hemos podido observar en esta tesis la interacción de muy bja afinidad de la proteína RepA-2L2A con la secuencia de un interón. También se muestra mediante microscopía electrónica, la primera evidencia de la existencia de complejos tipo handcuffing en pS10. Estos complejos tipo hadcuffing, propuestos como mecanismo de control en otros sistemas relacionados, se forman mediante interacciones proteína-proteína entre moléculas de RepA unidas a los iterones del origen. Se demuestra que la formación de estos complejos implica interacciones entre los dominios WH1 de diferentes monómeros de RepA.

Autor: BLAZQUEZ GONZÁLEZ ANA BELEN.
Año: 2003.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: QUÍMICA.
Centro de realización: FACULTAD DE CC. QUÍMICAS.

Resumen: La Proteína Oligomérica de la Matriz del Cartílago (COMP), conocida también como trombospondina 5, es una glicoproteína con una elevada masa molecular (520 kDa). Es una proteína altamente aniónica debido a su elevado contenido en Asp/Asn y Glu/Gln, que constituyen más del 30% del total de sus residuos. Se trata de un homopentámero constituido por cinco subunidades idénticas, cada una de ellas con una masa molecular de aproximadamente 120 kDa. Cada una de estas subunidades consta de: * Un dominio globular carboxilo terminal. * Siete dominios de unión a calcio o repeticiones tipo 3. * Cuatro dominio de tipo EGF o repeticiones tipo 2. * La región N-terminal. Inicialmente se aisló y purificó la COMP a partir de cartílago aticular humano. A partir de esta proteína purificada se obtuvieron anticuerpos policlonales anti-COMP humana en conejos. Se produjeron también anticuerpos monoclonales anti-COMP humana en ratón, y estos anticuerpos fueron de gran utilidad parala detección de COMP humana en fluidos biológicos (líquido sinovial y suero) de pacientes con osteoartritis en rodilla. No está determinada completamente la funcionalidad biológica de la COMP, pero al dominio que se le ha atribuido alguna función ha sido al dominio globular carboxilo terminal. Por tanto decidimos expresar el fragmento C-terminal en tres sistemas de expresión tales como: E.coli, Pichia pastoris y baculovirus. De los tres sistemas de expresión, sólo P.pastoris nos permitió obtener el dominio C-terminal completamente puro.

Autor: RODRÍGUEZ ALFARO JOSE ANGEL.
Año: 2003.
Universidad: MURCIA.
Centro de lectura: VETERINARIA.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE MURCIA.

Resumen: Proteina quinasa C (PKC) es una quinasa implicada en transmisión de señales, que participa en multitud de procesos fisiológicos. La PKC es activado por lípidos como fosfatidilserina (PS) y diacilgliceroles (DAG) en sistemas dependientes de calcio, también es activada por ésteres de forbol como PMA (sustancias promotoras de tumores). PKC forma una gran familia de isoenzimas, en esta tesis se han estudiado diversos aspectos concernientes al mecanismo de acción de PKC alfa, delgrupo de las clásicas y PKC zeta del grupo de las atípicas. El dominio C2 de esta isoenzima clásica ha sido cristalizado formando complejos con diferentes fosfolípidos. Según estos cristales el dominio C2 presenta en su zona próxima a las cadenas beta 3 y beta 4. Caracterizada por la acumulación de residuos de lisinas. Esta región rica en lisinas ha sido estudiado mediante mutagenesis para comprobar sus implicaciones en la actividad de la proteína y se ha comprobado que se une a vesículas que contienen PS, PA y con muchas mayor afinidad a vesículas que contienen PIP2 mediante un mecanismo que no depende de calcio cuando se realizan estudios con el dominio C2 aislado. En el contexto de la PKC alfa completa, se concluye que este se puede activar por PIP2. El mecanismo de activación requiere que primero se una el calcio al enzima provocando un cambio conformacional que permite el acceso del PIP2 a la zona rica en lisinas provocando así la activación de la PKC alfa. La región rica en lisinas participa en una interacción intramolecular (probablemente con residuos de Asp del dominio C1) que mantiene a la PKC alfa en estado inactivo. Una vez que el calcio está presente es cuando esta región queda accesible al resto de posibles ligandos. Cuando la activación de la PKC alfa se realiza de una forma dependiente de calcio y PS, la zona rica en lisinas también participa estabilizando el anclaje del dominio C2 a la membrana mediante su interacción con una molécula de PS. Además es probable que la estabilización producida por esta interacción permita la entrada de un tercer calcio en la zona superior del dominio y que denominamos zona de unión a calcio. Con estudios de microscopía confocal se ha determinado que la región rica en lisinas participa directamente en la localización in vivo de la PKC alfa en la membrana plasmática de células NIH3T3. Es muy probable que esta región permita el acceso del diacilgliceron al dominio C1 o interaccione con otras proteínas que facilitan el acceso a la membrana plasmática. También se ha estudiado la activación de la PKC zeta, los fosfatidilinositoles que presentan mayor afinidad por el dominio regulador de esta isoenzima son el PIP2 y el PIP3. Este efecto sin embargo no se traduce en un incremento muy elevado de la actividad enzimática, significando que probablemente la función de estos fosfolípidos seía localizar al enzima en una zona concreta de la célula donde se requiere específicamente su función quinasa.

Autor: GARCÍA-VERDUGO DE LUCAS IGNACIO.
Año: 2003.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGÍA UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID.

Resumen: La proteína SP-A del surfactante pulmonar forma parte del sistema inmune innato del pulmón, implicado en la defensa inmediata frente a una amplia variedad de patógenos y toxinas. La SP-A pertenece a una familia de proteínas estructuralmente homologa denominada colectina, lectinas tipo-C (dependientes de calcio) con un dominio de colágeno. La capacidad de la SP-A de unirse a distintos ligandos (calcio, azucares, fosfolípidos y proteínas) justifica su multiplicidad funcional: A,- Mejorar la actividad biofísica del surfactante. B,- Aglutinar patógenos y toxinas, disminuyendo su toxicidad y promoviendo su eliminación por fagocitosis. C,- Modular la respuesta inflamatoria en el alveolo. Esta actividad multifuncional de la SP-A contribuye a evitar el colapso de los alvéolos durante la espiración, a mantener el espacio alveolar esterilizado, y a limitar la respuesta inflamatoria frente a endotoxinas inhaladas. La multiplicidad funcional de la SP-A depende de su compleja estructura oligomérica, formada por 18 cadenas polipeptídicas, que en humanos y primates, pero no en otros mamíferos, proceden de dos genes funcionales distintos (SP-A1 y SP-A2). La proporción en la que se encuentran las cadenas polipeptídicas SP-A1 y SP-A2 en la proteína humana y la importancia funcional de contener dos cadenas polipéptidicas, que diferen principalmente en el dominio de colágeno no se conoce. En esta memoria se describe, por primera vez, las diferencias estructurales y funcionales entre las proteínas recombinantes humanas SP-A1 y SP-A2 (procedentes de un solo gen) expresadas en células de insecto y entre la forma co-expresada procedente de ambos genes. Por otra parte, se ha caracterizado la interacción de la SP-A humana, nativa y recombinantes, con el lipopolisacarido bacteriano (LPS) presente en solución, así como incorporado en monocapas de dipalmitilfosfatidilcolina en la interfase aire-líquido. Además se ha demostrado que la SP-A interfiere en la unión de LPS a CD14, componente del complejo receptor de LPS, y en la transferencia de LPS al CD14 mediado por la proteína de unión a LPS (LBP).

Autor: CARRERAS MARGALEF ESTER.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: ESCUELA DE POSTGRADO.

Resumen: La proteína catiónica de eosinófilo (ECP) es una ribonucleasa que se encuentra en los gránulos secundarios de los eosinófilos. Los niveles de ECP en los fluidos corporales se utilizan como indicador del número y activación de los eosinófilos. La ECP es tóxica para diversos patógenos como son bacterias, helmintos y virus y para células de mamífero. Para identificar immunológicamente la ECP se ha seleccionado una región específica de la proteína (D112-P123) como posible epítopo antigénico. La región D112-P123 no se encuentra en la Rnasa A, 1,4 y 5 y es donde se observa la máxima desviación del esqueleto de la cadena principal de la ECP y la neurotoxina derivada de eosinófilo (EDN) con la que comparte un 67% de identidad de secuencia. Se han inmunizado conejos con un péptido sintético (D112-P123) conjugado a una proteína transportadora y se han purificado los anticuerpos policlonales con una columna de afinidad con la ECP inmovilizada. El anticuerpo D112-P123 reconoce específicamente la ECP en condiciones reductoras y no reductoras y no presentan reactividad cruzada ni con la EDN ni con la Rnasa A ni con otras proteínas control. La imunodetección por transferencia Western con el anticuerpo D112-P123 ha mostrado que hay una relación lineal entre la cantidad de proteína (1-75 ng) y el señal obtenido. Se ha ensayado la reactividad del anticuerpo D112-P123 en fluidos corporales y granulócitos. El anticuerpo D112-P123 detecta la forma nativa no glicosilada y las formas glicosiladas de la ECP en granulócitos, esputo y plasma. Se ha obtenido una buena correlación entre los niveles de ECP determinados con el anticuerpo D112-P123 y un anticuerpo que comercialzia Pharmacia & Upjohn (Uppsala, Suecia). Para estudiar la relación entre la estructura y las actividades biológicas de la ECP se han obtenido variantes de la proteína en residuos específicos de la ECP. Se han escogido residuos catiónicos y aromáticos expuestos en la superficie de la proteína (W10K, W35A/R36A, R75A/F76A, R101A/R104A) y de la región D115-Y122 (R121A, R121A/Y122A, (115-122)-ECP y (115-122 EDN)-ECP). Se ha estudiado el efecto de la ECP y sus variantes en la actividad ribonucleasa, la disrupción de membranas, la citotoxicidad para bacterias gram positivas y gram negativas y la inhibición del crecimiento de células de mamífero. También se ha realizado una predicción de la estructura tridimensional de los mutantes por modelaje molecular. Las variantes de la ECP no modifican sustancialmente ni la estructura tridimensional de la proteína ni la actividad ribonucleasa. La actvidad sobre membranas de la ECP y sus variantes se ha analizado utilizando vesículas sintéticas. La ECP muestra una clara preferencia para desestabilizar vesículas acídicas cosa que surgiere que las cargas positivas de la proteína son importantes para la interacción con las membranas. El estudio del efecto de las mutaciones en la actividad sobre las membranas ha mostrado que aminoácidos ctiónicos específicos y los triptófanos de la proteína (W10, W35R36 y R101R104) están relacionados con la permeabilización de la membrana. Estos resultados correlacionan bien con el efecto de los mutantes en la inhibición del crecimiento de células de mamífero. Las regiones W35R36 y W10 son esenciales para la inhibición de la proliferación. Otros residuos catiónicos y aromáticos R75F76, R101R104, Y122 tienen un papel secundario en la inhibición del crecimiento que se puede explicar por la posible interacción de estos residuos con los carbohidratos de la superficie de las células de mamífero. La región W35R36 tienen un papel esencial en la actividad bactericida para bacterias gram positivas y gram negativas. Los otros residuos estudiados tienen efectos distintos en la actividad bactericida de la ECP dependiendo se trate de E.coli o S.aureus. Mientras que los residuos R101R104 y R75F76 son importantes para la actividad bactericida sobre E.coli, los residuos W10 y la región del bucle D115-Y122 son necesarias para la actividad bactericida sobre S.aureus. Se puede concluir que las regiones catiónicas y hidrofóbicas estudiadas participan en la capacidad de la ECP para permeabilizar membranas biológicas y/o en la interacción de la proteína son componentes de la pared bacteriana o con lo carbohidratos de la superficie de las células de mamífero.

Autor: DÍAZ SOLARES MAYKELIS.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: ESCUELA DE POSTGRADO.

Resumen: La formaldehído deshidrogenasa dependiente de glutatión (FALDH)(EC 1.2.1.1), conocida también como ADH clase III, es un enzima ubícuo, presente en el reino vegetal y animal. La eliminación de formaldehído dentro de la célula se realiza principalmente mediante la FALDH, que utiliza NAD+ como cofactor. El formaldehído es un intermediario del metabolismo celular normal, aunque puede tener también un origen exógeno, siendo un polucionante atmosférico y de aguas residuales. Por otra parrte, el formaldehído se forma intracelularmente durante la peroxidación lipídica en situaciones de estrés oxidativo. La eliminación de este formaldehído, que es muy tóxico para la célula, es necesaria para su supervivencia. Recientemente se ha descubierto que la FALDH tiene también actividad S-nitrosoglutatión reductasa. El S-nitrosoglutation (GSNO) es uno de los más abundantes metabolitos endógenos del óxido nítrico (NO), que actúa como uno de los señalizadores moleculares en los mecanismos de defensa de las plantas. En esta Tesis Doctoral hemos demostrado que la expresión de la FALDH está regulada por herida y por diferentes hormonas vegetales, tales como el ácido jasmónico y el ácido salicílico. También hemos generado plantas transgénicas de A.thaliana portadoras de una construcción antisentido, que presenta una importante disminución de la actividad enzimática FALDH, directamente relacionados con los niveles de proteína. Dichas plantas transgénicas tienen una menor capacidad de metabolizar formaldehído exógeno y presentan un aumento de la resistencia basal a patógenos fúngicos y bacterianos. Por otra parte, las plantas transgénicas con niveles de FALDH modificados (tanto las antisentido como las de sobreexpresión) muestran un fenotipo diferente, principalmente en la raíz. La inmunolocalziación en tejidos reveló que la FALDH presenta un patrón de expresión en hojas y en raíz que es específico del tipo celular. A nivel subcelular, la FALDH está presente en citoplasma, núcleo y cloroplasto. Esta es la primera vez que se describe la localización cloroplástica de la FALDH.

Autor: FERNÁNDEZ FUENTES NARCISO.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD AUTONOMA DE BARCELONA.

Autor: VERGARAJAUREGUI LETAMENDIA SILVIA.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGÍA MOLECULAR "SEVERO OCHOA".

Resumen: En una búsqueda de proteínas que interaccionaban físicamente con el dominio C-terminal de GLUT4, con el sistema de doble híbrido de levadura, identificamos el dominio carboxilo de Daxx y el dominio carboxilo terminal de una proteína desconocida a la que denominamos KIS. La intervención encontrada por el doble híbrido entre C-GLUT4 y C-KIS y C-GLUT4 y C-Daxx fue validada por la capacidad del C-GLUT4 traducido in vitro de interaccionar con el Daxx silvestre, el C-Daxx y el C-KIS traducido in vitro. C-Daxx y C-KIS no interaccionan con el dominio C-citoplasmático de GLUT1, el transportador de glucosa expresado de forma ubicua y homólogo a GLUT4. La anulación de la señal dileucina (Leu489Leu790), crítica para el transporte de GLUT4 desde la red trans del Golgi al compartimento perinuclear de almacenaje, y para su internalización desde la superficie celular por endocitosis, por la substitución del par LeuLeu por el par Ala-Ser inhibió en un 50% la interacción entre C-GLUT4 y C-Daxx, mientras que la introducción de una alanina entre las dos Arg que preceden al par dileucina, inhibió completamente la interacción de C-KIS y C-GLUT4. La Daxx y el GLUT4 contenidos en fibroblastos 3T3-L1 transfectados establemente con GLUT4, así como en adipocitos 3T3-L1, son coinmunoprecipitados con anticuerpos contra GLUT4 y Daxx, respectivamente. Utilizando un procedimiento bien establecido de fraccionamiento celular, demostramos evidencia de la existencia de dos poblaciones intracelulares de Daxx en el núcleo y en los microsomas de baja densidad. Estudios de microscopía confocal localizaron a Daxx en los cuerpos PODs y en estructuras vesiculares en el citoplasma, frecuentemente organizadas en hileras y bajo la membrana plasmática. También presentamos evidencias de que tanto GLUT4 como Daxx son conjugadas a SUMO-1. Hemos caracterizado una nueva proteína a la que hemos denominado KIS, codificada por un mRNA de 2.4kb. Sorprendentemente, el dominio de interacción a GLUT4 (DIG) era precedido por tres codones de parada. El mRNA contiene posibles sitios de procesamiento alternativo que eliminarían los tres codones de parada, situando el dominio DIG en fase de lectura con KIS. Mientras que eliminarían los tres codones de parada, situando el dominio DIG en fase de lectura con KIS. Mientras que no hemos encontrado el transcrito alternativo utilizando las técnicas de Northern, RT-PCR y RPA, hemos demostrado la expresión de DIG, ya que anticuerpos específicos contra este dominio y contra el dominio N-terminal de KIS reconocen específicamente una misma proteína de 58 kDa. KIS es una proteína de membrana de Tipo I con un dominio transmembrana en su extremo amino terminal. Estudios de inmunofluorescencia de fibroblastos SGBS transfectados con GLUT4 y de adipocitos 3T3-L1 mostraron que KIS se distribuye en una región perinuclear, donde co-localiza parcialmente con GLUT4, co-localización que también fue verificada en criosecciones de adipocitos 3T3-L1 por microscopía electrónica. La colocalización entre KIS y GLUT4 y la implicación de la señal de retención dileucina de GLUT4 en la interacción entre éste y C-KIS sugiere que KIS podría jugar un papel en el transporte de GLUT4 desde el Golgi.

Autor: MACHÓN SOBRADO CRISTINA.
Año: 2003.
Universidad: CANTABRIA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: TrwD es una proteína implicada en el proceso de la conjugación bacteriana del plásmido R388. Forma parte de una amplia familia de proteínas, presentes en diversos sistemas de secreción de macromoléculas. Ésta es la familia de proteínas VirB11, que tienen la característica de poseer actividad ATP hidrolasa. Uno de los objetivos de la presente tesis era estudiar la interacción de TrwD con la membrana, empleando para ello liposomas como membranas modelo. La proteína era capaz de unirse a las vesículas lipídicas, integrándose en la monocapa externa,sin afectar a la interna y se encontró en un equilibrio entre una forma a la membrana y una forma soluble. Por otro lado,se hizo un estudio de la relación estructura-función, para lo cual se diseñó y seleccionó una serie de mutantes. Tres de los mutantes construídos se comprobó que se unían a la membrana interna bacteriana com mayor afinidad que la proteína nativa, mientras que un cuarto mutante presentaba una menor afinidad por los nucleótidos trifosfatos que la proteína nativa. Además, se analizaron 200 compuestos comerciales de referencia en busca de posibles inhibidores de la conjugación bacteriana, y posteriormente se estudiaron las dianas sobre las que estaban ejerciendo su acción. Entre los compuestos estudiados, se seleccionaron dos ácidos grasos insaturados, que resultaron ser inhibidores no competitivos de la actividad ATPasa de TrwD.

Autor: ARIAS PIEDRAS YOLANDA.
Año: 2003.
Universidad: VALLADOLID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: Las proteínas inactivadoras de ribosomas (RIPs) son proteínas de origen vegetal y bacteriano que provocan la inhibición irreversible de la síntesis de proteínas en ribosomas eucarióticos y en algunos procarióticos. Las RIPs inactivan a los ribosomas eucarióticos mediante la hidrólisi del enlace N-glucosídico de la adenina 4324 del 28S rRNA, el cuál participa en la interacción del ribosoma con el factor de elongación 2. El interés por los RIPs está aumentando debido a su empleo en la construcción de inmunotoxinas para la terapia del cáncer. Las RIPs se pueden clasificar en RIPs de tipo 1 y RIPs de tipo 2. Los RIPs de tipo 1 son proteínas con una sola cadena que tiene actividad N-glucosilasa. Los RIPs de tipo 2 son proteínas con dos cadenas unidas por un puente disulfuro, una cadena A con actividad N-glucosidasa y una cadena B que es una lectina, normalmente específica para polisacáridos complejos que contienen galactosa y que están presentes en la membrana plasmática. Entre los RIPs de tipo 2 tenemos: Ricina, Abrina, Volkensina, Modeccina y Viscumina. La Ricina es una toxina muy poderosa obtenida a partir de semillas de Ricinus Communis, ejerce un efecto inhibidor muy fuerte sobre la síntesis de proteínas animal. En los últimos años se han encontrado en el género vegetal de Sambucus una mezcla compleja de RIPs de tipo 1 y 2. Los RIPs de tipo 2 del saúco son, entre cuatro ó cinco órdenes de magnitud, menos tóxicos frente a células animales y animal entero que la Ricina. Entre estos RIPs de tipo 2 no tóxicos tenemos la Nigrina b, la Ebulina y RIPs de tipo 2 relacionados. Desde hace algunos años, la principal aplicación terapéutica de las RIPs deriva de su utilización como parte tóxica de las inmunotoxinas dirigidas contras las células tumorales o infectadas por virus. Las inmunotoxinas son conjugados formados por la unión covalente de una parte tóxica, en este caso una RIP, y una molécula transportadora capaz de dirigir la toxina una célula blanco de manera específica. Como molécula transportadora se han utilizado hormonas, lectinas, factores de crecimiento, recpetores, y fundamentalmente anticuerpos monoclonales dirigidos contra determinantes celulares específicos o, como inmunotoxina indirecta, hacia anticuerpos monoclonales anticelulares. Otra posibilidad es el uso de anticuerpos bifuncionales capaces de reconocer tanto la RIP como el determinante celular. La RIP más utilizada en inmunotoxinas es la Ricina bien como toxina completa, generando graves problemas de toxicidad inespecífica debido a su cadena B, o bien como toxina modificada ó bloqueada. Debido a estas características, el uso de Nigrina b o Ebulina 1, RIPs de tipo 2 no tóxicas, para 1 a construcción de inmunotoxinas presenta una gran ventaja frente a Ricina. La angiogénesis tumoral constituye una etapa crucial en la progresión de un tumor que pasa de ser una acumulación de células neoplásticas pequeña e inocua a una masa tumoral con crecimiento maligno y con capacidad de diseminarse por otros órganos del organismo. Fue Folkman en 1971, el primero que propuso la posibilidad de tratar un tumor, bloqueando el proceso de angiogénesis. La terapia antiangiogénica tiene como objetivo hacer que los microvasos tumorales que están proliferando retornen a un estado quiescente o destruirlos. Un punto importante para valora la efectividad de la terapia antiangiogénica es que sea específica para la vasculatura del tumor y no dañe a los vasos sanguíneos normales. La presencia de marcadores específicos en el endotelio tumoral pueden utilizarse como blancos terapéuticos. La endoglina es esencialmente un marcador con proliferación de células endoteliales durante un proceso angiogénico. Por lo tanto, ciertos anticuerpos monoclonales frente a endoglina y sus inmunoconjugados pueden ser muy útiles para la terapia antiangiogénica dirigiendo agentes citotóxicos a la vasculatura tumoral humana.

Autor: ORTEGA DE MUES ARANTXA.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA-UAM.

Resumen: La proteína relacionada con la parathormona (PTHrP) se sintetiza en la mayoría de los tejidos normales fetales y adultos, incluyendo el riñón. A través del receptor tipo 1 para PTH/PTHrP (PTH1R), la PTHrP ejerce efectos proliferativos sobre diversos tipos de células renales. Además, la PTHrP se sobreexpresa en distintos modelos de daño renal. El fracaso renal agudo (FRA) es una patología caracterizada por una pérdida rápida de la morfología y la función renal, seguida de una intensa regeneración del epitelio tubular. Utilizando un modelo de FRA por ácido fólico (AF) en la rata, que induce un cuadro similar al observado en humanos, planteamos estudiar el papel de la PTHrP en esta patología. Dada la implicación del sistema renina-angiotensina en la progresión del daño renal, se invetigó la relación del bloqueo del a angiotensina II (Ang II) con los posibles cambios de función renal y la expresión de la PTHrP en este modelo, y los mecanismos moleculares implicados. Además en un modelo de ratón transgénico que sobreexpresa la PTHrP en el túbulo proximal estudiamos la evolución del daño induciod por el AF. Los resultados aquí expuestos demuestran que, tanto el deterioro de la función ranl como la sobreexpresión de la PTHrP en el FRA inducido por este nefrotóxico, depende de la activación del sistema renina-angiotensina. Además, usando células túbuloepiteliales renales in vitro, hemos identificado un mecanismo por el cual la nefrotoxicidad inducida por el AF activa el sistema local Ang II/receptor AT1 y estimula la expresión de la PTHrP. Esta estimulación ocurre a través de la activación de la proteína que se une al elemento de respuesta al AMPc (CREB) por un mecanismo que requiere la fosforilación de quinasa reguladas por señales extracelulares (ERKs). La PTHrP parece actuar como un factor profibrogénico, y podría contribuir a los mecanismos de progresión del daño renal en este modelo de FRA.

Autor: ABASCAL SEBASTIÁN DE ERICE FEDERICO.
Año: 2003.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGÍA.

Resumen: La secuenciación de genomas supone un paso muy importante, pero aún estamos lejos de comprender la información que encierran estos libros de instrucciones. Análogamente a la piedra rosetta y los jeroglíficos egipcios, la comparación de genomas de distintos organismos será la que posiblemente nos dé algunas pistas. Para conseguirlo debemos encontrar los genes y predecir su función. También debemos organizar la información de un modo tal que sea posible relacionar datos de distinta naturaleza. Este trabajo se encuadra en un proyecto para el desarrollo de un sistema automático de análisis de genomas. El esqueleto de este robot, ORFandDB, es un esquema entidad-relación sobre el que se traduce la información procedente de fuentes heterogéneas: bases de datos públicas como Swiss-Prot, NCBI-Taxonomy, Pfam u otras, así como de los resultados de programas coo BLAST, PSI-BLAST o programas de identificación de genes. La contribución más relevante en esta tesis es la del desarrollo de un módulo para anotar de forma automática la función de las proteínas. El método se basa en la idea de que las proteínas con un mismo origen evolutivo tienen funciones similares. Para encontrar estas proteínas homólogas hemos investigado métodos de búsqueda como BLAST, PSI-BLAST o uno desarrollado por nosotros de búsqueda con secuencias intermedias. Una vez encontradas la proteínas homólogas, aplicamos un método de clustering o agrupamiento, basado en el corte normalizado de un grafo, para identificar grupos de ortólogos o subfamilias, en los que el rol de la proteína ancestral supuestamente se ha conservado a lo largo de la evolución. Las anotaciones de estos ortólogos que hay en las bases de datos son la fuentes de información que usamos para anotar las proteínas nuevas o desconocidas. Para ello realizamos un análisis léxico automático con el fin de evitar la propagación de anotaciones erróneas y de determinar qué descripciones de la función son más informativas. Por otra parte, dado que la unidad evolutiva básica son los dominios y no las proteínas completas (a lo largo de la evolución ha aparecido proteínas nuevas gracias a la combinación de dominios ya existentes), el sistema trata de usar como fuente de información aquellos ortólogos con una misma estructura de dominios, aquéllos que alinean a lo largo de sus secuencias completas. Hemos aplicado estos métodos para el análisis y la anotación del genoma de Buchnera aphidicola (Baizongia psitaciae). La inspección de los resultados nos ha permitido estimar la precisión del método de anotación de función de un 94%.

Autor: ILORO MANZANO IBON.
Año: 2003.
Universidad: PAIS VASCO.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: DPTO. BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR, FACULTAD DE CIENCIAS, UPV.

Resumen: Se ha utilizado la espectroscopia de infrarrojo para el análisis estructural de varios tipos de proteínas (tanto de membrana como solubles). Se ha querido enfatizar el desarrollo de la espectroscopia de infrarrojo bidimensional de correlación (2D-IR)mediante el estudio de muestras reales, como la anexina (tanto de pollo como humana), las proteínas implicadas en la conjugación del plásmido R388 TrwC y TrwB (esta última en dos variantes: TrwB y TrwBDN70), la lectina de lenteja y la Metionina Adenosil transferasa (MAT). En un intento por obtener una mayor información de los mapas bidimensionales, también se han realizado simulaciones matemáticas con el fin de obtener patrones bidimensionales del comportamiento de bandas que sufren variación en intensidad, posición y anchura de bandas.