PROTEINAS, 3

Autor: GUTIÉRREZ AGUIRRE ION.
Año: 2003.
Universidad: PAIS VASCO.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: La equinatoxina-II (Eqt-II) es una toxina citolítica producida por la anémona de mar Actinia equina. Utilizando técnicas de Biología Molecular se han sintetizado diversos mutantes, cuya interaccion con membranas naturales y con sistemas modelo de membrana se ha estudiado mediante técnicas biofísicas. Esta aproximación expirimental ha permitido caracterizar tanto el papel que ciertas regiones de la toxian desempeñan dentro de su mecanismo de acción, como la importancia del estado físico de la bicapa lipídica para su actividad. En la secuencia de la proteína existe una región rica en aminoácidos aromáticos que contiene los triptófanos W112 y W116, esenciales para la unión de la toxina a las membranas. La libertad de movimientos de la región N-terminal resulta indispensable para la formación del poro, ya que debe ser es transferida al seno de la bicapa durante el mecanismo de inserción. La coexistencia de fases lipídicas en el seno de la bicapa durante el mecanismo de inserción. La coexistencia de fases lípidicas en el seno de la bicapa incrementa notablemente la actividad lítica de la Eqt-II.

Autor: HORMAECHE BERCIANO ITSASO.
Año: 2003.
Universidad: PAIS VASCO.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS DE LA UPV/EHU.

Resumen: TrwB es la proteína acopladora del plásmido R388. Este tipo de proteínas son las encargadas de poner en contacto la maquinaria de procesamiento del DNA con la responsable de su transporte, en el fenómeno de conjugación bacteriana. Las proteínas acopladoras son intrínsecas de membrana y por ello, poco estudiadas. En este trabajo diseñamos dos protocolos de purificación de TrwB y TrwB con una cola de seis histidinas en su extremo carboxilo terminal, obteniendo así muestras de TrwB monomérica y de TrwB hexamérica. Con la intención de determinar el papel que desempeña el dominio transmembrana de TrwB en la conjugación del plásmido R388, realizamos estudios de estabilidad de dicha proteína frente a una versión soluble que carece de dicho dominio (TrwBAN70). Comparamos la actividad ATPasa y la unión de nucleótidos de aTrwB con y sin dominio de membrana, así como del mutante TrwBK136T (mutadala Lys136 del motivo de unión de nucleótidos Walker A). Por último hemos comenzado a realizar estudios de reconstitución de TrwB en sistemas de membrana modelo, liposomas, siendo un entorno más parecido a la membrana celular.

Autor: SOT SANZ BEGOÑA.
Año: 2003.
Universidad: PAIS VASCO.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: GroEL es una chaperonina de E. Coli compuesta por dos anillos de siete subunidades idénticas cada uno, cuya función consiste en asistir el plegamiento de cadenas polipeptídicas en la célula, así como en proteger a las proteínas nativas del estrés térmico, impidiendo su agregación. Para realizar su función necesita unir e hidrolizar ATP con cooperatividad positiva ente las subunidades de un mismo anillo y cooperatividad negativa entre anillos. En esta tesis se ha estudiado el papel de los puentes salinos en la comunicación alostérica de GroEL. Mediante técnicas de espectroscopia infrarroja diferencial resuelta en el tiempo se concluye que la unión de ATP, y no de ADP, provca variaciones en el entorno químico de puentes salinos que afectan tanto a la comunicación inter-como intra-anillo. Posteriormente se determinó el papel de los puentes alinos inter-anillo E434-K105 y E461K. De esta caracterización se concluye que dichos puentes salinos son necesarios para controlar el termostato de GroEL, que le permite distinguir temperaturas fisiológicas de temperaturas de choque térmico, a través de la estabilización de la interfase inter-anillo, al asegurar las distancias adecuadas entre anillos que permitan la comunicación alostérica. Asimismo, cada puente salino contribuye en distinto grado al control del termostato y a la estabilidad global de la chaperonina. Esta contribución depende del número de residuos cargados que participan en cada interacción

Autor: MARTÍNEZ VICENTE MARTA .
Año: 2003.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FUNDACIÓN VALENCIANA DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS.

Resumen: El objetivo de este trabajo ha sido caracterizar, bioquímica y funcionalmente, una GTPasa bacteriana, la proteína MnmE de E.coli, implicada en la modificación postranscricional de algunos tRNAs. MnmE es una proteína multidominio de 50 kDa que consta de un dominio N-terminal de 220 residuos, un dominio medio de unión a GTP (dominio G) de 160 residuos y un dominio C-terminal de 75 aminoácidos que contiene la única cisteína presente en la molécula. MnmE es una GTPasa cuyas propiedades bioquímicas difieren ampliamente de las mostradas por la sGTPasas reguladoras pertenecientes a la familia de las pequeñas GTPasas, típicamente representadas por Ras. MnmE tiene muy baja afinidad por nucleótidos y una actividad GTPasa intrínseca alta; además, es capaz de multimerizar. El ciclo GTPasa funciona in vitro sin necesidad de factores adicionales tipo GAPs o GEFs. El dominio G de MnmE aislado conserva una afinidad similar por nucleótidos y la misma capacidad de hidrólisis del GTP que la proteína entera y, sin embargo, no presenta ningún subdominio activador insertado. En este trabajo se ha demostrado que la hidrólisis del GTP realizada por la proteína MnmE es esencial para la función modificadora de los tRNAs. En nuestro modelo proponemos que la hidrólisis del GTP provoca los reordenamientos estructurales en la molécula que le permiten ejecutar su función modificadora. Si es así, MnmE sería el primer ejemplo de una enzima modificadora de tRNAs con activiad GTPasa. Además, en este trabajo hemos establecido la relación entre la presencia de la modificación introducida por MnmE en los tRNAs y la viabilidad celular, demostrando la importancia de la modificación química post-transcripcional para el proceso de descodificación celular, pues este proceso se ve gravemente perjudicado cuando mutaciones que inactivan funcionalmente MnmE se combinan con mutaciones en otros genes implicados en este proceso y que por sí solas no producen fenotipo aparente.

Autor: GIANELLI BARRA M. PÍA.
Año: 2003.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: FARMACIA .
Centro de realización: INSTITUTO DE AGROQUÍMICA Y TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS.

Resumen: La proteínas pueden fijar los compuestos responsables del aroma afectando así las propiedades sensoriales de los alimentos. La fijación de los compuestos volátiles por las proteínas resulta a veces deseables, ya que permite utilizar las proteínas como transportadores del aroma o modificadores del aroma y sabor en los alimentos. En este trabajo se estudia la interacción de ocmpuestos representativos del aroma del jamón curado con componentes de la matriz proteica de la carne: dipéptido (carnosina y anserina) y proteínas sarcoplásmaticas (mioglobina), mediante la técnica de microextracción en fase sólida (SPME). Para ello, en primer lugar se optimiza la técnica de microextracción en fase sólida para el análisis cualitativo y cuantitativo de los compuestos volátiles presentes en el espacio de cabeza de jamón curado. Se debe tener presente que existen muchos factores que afectan dicha extracción tales como el tipo de fibra, la volatilidad y la masa molecular de los compuestos volátiles. Se evalúa la extracción de los compuestos volátiles con diferentes tipos de fibra. La fibra bipolares de Car/PDMS y DVB/Car/PDMS, son capaces de extraer 70 compuestos volátiles distintos. Así, en el espacio de cabeza de jamón curado la fibra de DVB/Car/PDMS extrae mayoritariamente hexanal (18%) y 2-pentanona (10%) mientras que los compuestos extraídos de forma mayoritaria por la fibra de Car/PDMS son 3-metil-butanal (19,8%) y 2-metil-butanal (17,7%) seguido de hexanal (7%) y 2-pentanona (8%). En el estudio de interacción entre compuestos volátiles y proteicos con la técnica de microextracción en fase sólida se obtiene interacción entre la carnosina con todos los compuestos volátiles estudiados excepto con la 2-pentanona. La anserina presenta interacción con 2-metil-butanal, 3-metil-butanal, hexanal y metional. Por último, la mioglobina solo presenta interacción con 2-metil-butanal y hexanal. En todos los casos estudiados, la interacción sigue la ecuación de Scatchard siendo una interacción no-covalente y reversible. En cuanto a los parámetros de interacción, la carnosina es el péptido con mayores constantes de afinidad "K" (M-1) para hexanal, 3-metil-butanal y octanal. También, se estudia el efecto de los agentes de curado en la interacción entre compuestos volátiles y proteicos. Entre los agentes estudiados, el ácido ascórbico es el que produce un efecto más destacado al disminuir la interacción entre los compuestos volátiles y la carnosina. Finalmente, se estudia el efecto de mezclas de dichos agentes de curado simulando las distintas etapas de curado sobre la interacción entre compuestos volátiles y proteicos solubles. El porcentaje de interacción es mayor en las etapas de curado en presencia de carnosina que con anserina y mioglobina. En la 2ª y 3ª etapas de curado, la interacción permanece constante excepto en el caso de octanal que disminuye en presencia de los compuestos proteicos, y en el metional que aumenta ligeramente sobre todo en presencia de carnosina. Los resultados obtenidos demuestran la existencia de interacciones entre compuestos volátiles y compuestos proteicos musculares solubles, las cuales producen la modificaicón de la proporción relativa de estos compuestos de gran potencia aromática en el espacio de cabeza. Dicha modificación puede modular el aroma y, por consiguiente, cambiar la percepción sensorial del jamón curado.

Autor: FUERTES SEDER GRACIELA.
Año: 2003.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: INSTITUTO DE INVESTIGACIONES CITOLÓGICAS.

Resumen: Esta tesis se centra en investigar la posible existencia de poblaciones de proteasomas en diversas localizaciones celulares que difieran en su composición en subunidades y en determinar en cultivos celulares en diferentes condiciones de crecimiento la contribución de los proteasomas y de otras vías proteolíticas a la degradación genetral de proteínas intracelulares, así como en analizar el papel de los proteasomas en la degradación de una proteína específica de membrana plasmática, el receptor de LDL y estudiar si una de las mutaciones más frecuentes en población española que produce HF afecta a las vías degradativas de este receptor de LDL y estudiar si una de las mutaciones más frecuentes en población española que produce HF afecta a las vías degradativas de este receptor. Encontrando a los proteasomas localizados sobre todo en citosol, núcleo y asocaidos a la membrana externa del retículo endoplasmático, aunque en diferente proporción, ya que los proteasomas 26S, inmunoproteasomas y proteasomas PA28 están en núcleo. Los proteasomas contribuyen a la degradación de proteínas de vida media corta y larga, junto con los lisomas, siendo responsables ambas vías del 80% de toda la degradación. Las distintas vías proteolíticas se activan o inhiben de manera diferentes en las diferentes condiciones de credimiento, los proteasomas son más activas en ausencia de suero, debido a un incremento de la cantidad de proteínaa subicuitiladas y son menos activos en confluencia, debido a la sustitución del complejo regulador 19S y de las subunidades intercambiables del proteasoma 20S por el complejo regulador PA28 y las subunidades del inmunoproteasoma, respectivamente. Los inhibidores MG132 y ALLN utilizados como inhibidores específicos de los proteasomas son también inhibidores muy eficaces de las vías proteolíticas lisosomales. La forma madura del receptor de LDL, la proteína específica estudiada, se degrada mayoritariamente por proteasomas pero también por lisosomas. Una de las mutaciones más frecuentes en población española, la C358Y, retrasa la maduración del receptor provocando que parte de la forma precursora sea degradada por lisosomas y disminuye la estabilidad del receptor madura de forma que su degradación transcurre a través de una vías casi exclusivamente lisosomal, por tanto los dos sitemas proteolíticos mayoritarios cooperan en la degradación de una misma proteína y su importancia relativa puede variar por mutaciones puntuales en la secuencia de la misma.

Autor: SANZ ECHEVARRÍA M. BEGOÑA.
Año: 2003.
Universidad: PAIS VASCO.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS (UPV/EHU).

Resumen: En este trabajo se ha estudiado el transporte de nitrato en la cianobacteria Phormidium laminosum. Se ha caracterizado la toma neta de dichos iones en función de las condiciones ambientales (Ph, luz, temperatura, concentración de ion..), y se ha estudiado cómo afecta la fuente de nitrógeno (nitrato, nitrato o amonio) o su carencia a factores como la velocidad de toma neta, actividades enzimáticas relacionadas y a la presencia de la proteína NrtA (proteína de unión al sustrato para el sistema NRT de transporte de nitrato/nitrato). Los resultados han puesto de manifiesto diferencias entre la toma neta de ambos iones, que sugieren la existencia de un sistema de transporte específico para nitrito.

Autor: MACHICADO RIVERO CLAUDIA.
Año: 2003.
Universidad: ZARAGOZA.
Centro de lectura: CIENCIAS .
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS - UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA.

Resumen: Se implementó un método de modelización de cavidades en proteínas. Se modelaron 9 mutantes con cavidad de las flavodoxinia de Anabaena y se eligieron 5 de ellas para caracterizar su estructura, estabilidad y unión a pequeñas moléculas. A continuación se diseñó un método computacional para predecir la unión de pequeñas moléculas en cavidades enterradas así como para calcular el cambio de energía libre de unión de los complejos. Se modelaron complejos Hanodoxino mutante w66F/L44A-ligandos y se ensayó su formación experimentalmente mediante técnicas espectroscópicos. Paralelamente se implementó un método de cribado masivo de bibliotecas de ligandos en cavidades enterradas. Se implementó una función de puntaución que alistaba en los primeros puestos de la lista de candidatos a ligandos reales de una cavidad de la lisozina L99A. Habiendo comprobado la eficacia del método se buscaron algunos ligandos de la Havodoxinc con cavidad W66F/L44A y se ensayaron experimentalmente. Los ensayos experimetnales demostraron 9' los ligandos predichos a unirse en la cavidad se unión a dicha región y los no unidores predichos no lo hacían. Quedó demostrado 9' el método de diseño de proteínas transporiadoras de lejandos es efectivo, ahorrando una gran cantidad de tiempo en ensayos experimental de cristalización y unión de moléculas.

Autor: BARBINI VEGA LUCIANA FERNANDA.
Año: 2002.
Universidad: SANTIAGO DE COMPOSTELA.
Centro de lectura: VETERINARIA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA/FACULTAD DE VETERINARIA.

Resumen: El estudio de los procesos de proliferación y apoptosis en el hígado es de gran importancia debido a que su desregulación genera un amplio número de enfermedades hepáticas. En este trabajo de tesis es estudió la participación de dos proteínas (protimosina alfa, PTA y gliceraldehído 3 fosfato deshidrogenasa, GAPDH) en los procesos de proliferación y apoptosis hepática. El mayor conocimiento acerca de la participación de estas proteínas en estos proceso, permitirán desde la investigación básica aportar en el entendimiento de las patologías del hígado y contribuir a la prevención, el diagnóstico o tratamiento de las mismas. Para esto, y en primer lugar, se establecieron los sistemas de hepatocios primarios y de línea celular en cultivo, se indujeron a proliferar con HGF, se determinaron las condiciones óptimas de esta inducción, y se pusieron a punto métodos de determinación de la proliferación celular. Por otro lado, se indujo la apoptosis de los hepatocios con dos agentes (TGF-beta1 y cicloheximida), se determinaron las condiciones óptimas de esta inducción, y se pusieron a punto las metodologías de determinación de apoptosis. Se estudiaron los niveles de RNA menajero de la PTA (por Northern Blot) en la quiescencia, la apoptosis y la proliferación celular, determinándose que existe un aumento de la expresión de esta proteína en la proliferación y una disminución en la apoptosis. Para la GAPDH se estudió su expresión a nivel de proteína en extractos proteicos nucleares y citoplasmáticos, mediante la técnica de Western Blot. La expresión del GAPDH resultó aumentada en los núcleos apoptóticos y en los citoplasmas proliferantes y apoptóticos. Para estudiar la localización de estas proteínas en los distintos estados celulares (quiescencia, proliferación y apoptosis) se realizó una inmunocitoquímica que se observó al microscopio confocal. Mediante esta técnica se localizó a la PTA en los núcleos de células quiescentes y proliferantes, pero en los citoplasmas de hepatocitos en mitosis o en apoptosis avanzada. Para la GAPDH la localización resultó citoplasmática en los hepatocitos quiescentes y proliferantes, y citoplasmática y nuclear en las células en apoptosis temprana. Para determinar si existían variaciones en la actividad glicolítica de GAPDH en extractos nucleares y citoplasmáticos de las células quiescentes, apoptóticas y proliferantes se utilizó el método cinético. La actividad resultó aumentada en los núcleos apotóticos, y en los citoplasmas proliferantes y apoptóticos. En conclusión, en las células hepáticas proliferantes la PTA está sobre-expresada y presenta localización nuclear, excepto en las células en división, en las cuales la proteína se hace citoplasmática luego de la ruptura de la membrana nuclear. El aumento de la PTA en la proliferación de hepatocitos en cultivo coincide con lo que sucede en otros tipos celulares y aporta más evidencias sobre la posible función de la PTA en la proliferación celular. Por el contrario, la expresión de esta proteína disminuye en la apoptosis y se produce una salida de la PTA desde el núcleo hacia el citoplasma en la apoptosis avanzada. Estos resultados sugieren un posible rol "antiapoptótico" de esta proteína. Por otro lado, la GAPDH se localiza en los citoplasmas de células hepáticas proliferantes, está aumentada su expresión, y también incrementada su actividad glicolítica. Los aumentos de GAPDH durante la proliferación se darían en respuesta al aumento de los requerimientos energéticos y a la biosíntesis regulada por el ciclo celular que presenta esta proteína. La proteína trasloca desde el citoplasma hacia el núcleo en la apoptosis temprana (detectada por Western Blot e inmunocitoquímica) y tanto los núcleos como los citoplasmas presentan aumentos de la expresión y de la actividad glicolítica. La traslocación de la GAPDH durante la apoptosis de hepatocitos coincide con resultados de estudios en otros tipos celulares, siendo esta traslocación imprescindible para que la apoptosis proceda.

Autor: ZORRILLA LÓPEZ SILVIA.
Año: 2002.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: QUÍMICA.
Centro de realización: INSTITUTO DE QUÍMICA FÍSICA "ROCASOLANO". CSIC .

Resumen: Una característica común a todos los sistemas biológicos es su elevada concentración total de macromoléculas (50-400 mg/mL). Esta alta concentración de macromoléculas, tiene importantes efectos sobre la termodinámica y la cinética de las reacciones que tienen lugar en los medios fisiológicos. El estudio cuantitativo de las propiedades estructurales y de las interacciones en sistemas aglomerados, presenta dificultades experimentales y de interpretación para la mayoría de las técnicas biofísicas. El objetivo general de este trabajo es el desarrollo de métodos avanzados de anisotropía de fluorescencia con resolución temporal de picosengudos y de FCS, adecuados para la obtención de información cuatitativa en medios aglomerados que simulan las condiciones de aglomeración macromolecular existente "in vivo". En este trabajo, se ha estudiado el efecto de la aglomeración macromolecular debida a altas concentraciones de Rnasa A o de HSA sobre el equilibrio de homodimerización de la apoMb así como sobre la difusión rotacional y translacional tanto del dímero como del monómero de apoMB. Las técnicas de anisotropía de fluorescencia con resolución temporal han permitido detectar la formación de dímeros flexibles de apoMb en presencia de RNasa A como proteína aglomerante, en una proporción que aumenta al aumentar la concentración de RNasa A (0-250 mg/mL) y con constantes de asociación aparentes superiores a 10(5) -10(6) M, dependiendo de la concentración de RNasa A. En las soluciones de HSA como proteína aglomerante, la apoMb se mantiene monomérica en todo el intervalo de concentraciones de HSA estudiado (0-200 mg/mL). En diferente efecto observado sobre el equilibrio de dimerización de la apoMb es compatible con la menor exculsión de volumen en las soluciones de HSA que en las de Rnasa A para una misma concentración en mg/mL. En las soluciones de alta concentración de RNasa A o de HSA la microviscosidad que actúa sobre la difusión del monómero y el dímero de apoMb, es diferente de la viscosidad macroscópica y es distinta también para la difusión rotacional y translacional. Para los estudios de difusión translacional se utilizó la técnica de FCS. En ambos casos, existe una ley empírica potencial que relaciona la viscosidad microscópica en la macroscópica. La microviscosidad que actúa sobre la rotación es menor que la macroviscosidad y ésta a su vez es menor que la microsviscosidad translacional.

Autor: GUILLÉN VIEJO CARLOS.
Año: 2002.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: FUNDACIÓN JIMÉNEZ DÍAZ.

Resumen: La interleuquina-6 (IL-6) parece actuar como mediadora de diversos agentes resortivos y jugar un papel importante en la pérdida de masa ósea en la deficiencia estrogénica. Su receptor soluble (sIL-6R) ejerce un efecto autoregulador sobre la IL-6 que podría incidir en su acción osteolítica. La IL-6 se induce por la activación del factor de transcripción NF-kB, un factor que es activado por varios agentes resortivos, como la parathormona (PTH), en los osteoblastos. La proteína relacionada con la PTH (PTHrP) ejerce efectos complejos sobre el remodelado óseo, en parte a través de otras citoquinas. Hemos analizado la hipótesis de que la PTHrP podría formar parte de un circuito de retroalimentación para mantener los niveles de IL-6 en el entorno óseo. Hemos encontrado que el fragmento 1-36 y el posible fragmento 107-139 de la PTHrP aumentan la expresión de IL-6 en células de fenotipo osteoblástico: de osteosarcoma de rata UMR 106 y humano MG-63, y de hueso trabecular humano (hOB). En estas células, este efecto se abolió con inhibidores del NF-kB. Además, encontramos que ambos fragmentos activan el complejo NF-kB e inducen la translocación nuclear del heterodímero constituyente p65-p50, interfiriendo con la degradación del inhibidor IkB-alfa citosólico, con un patrón similar al observado para la inducción de la IL-6. Los efectos de ambos fragmentos de la PTHrP juntos no fueron mayores que los observados con cada uno por separado. La inducción de la IL-6 por la PTHrP N- y C-terminal a través del NF-kB tiene características de un gen de respuesta temprana, y ocurre por un mecanismo dependiente de proteína quinasa (PK) A o PKC, respectivamente. Por otra parte, tanto la IL-6 como el sIL-6R, a concentraciones asociadas al aumento del remodelado óseo, inducen la expresión de la PTHrP y su propia expresión en los hOB. Nuestros hallazgos demuestran que ambos fragmentos de la PTHrP inducen la expresión de IL-6 en los osteoblastos. Los diferentes mecanismos asociados a este efecto de ambos fragmentos de la PTHrP, junto con el nuevo circuito de retroalimentación de la IL-6 a través de la PTHrP descrito, podrían suministrar rutas alternativas para la síntesis de esta citoquina en el entorno óseo. Estos resultados plantean nuevas perspectivas para comprender los mecanismos moduladores del remodelado óseo y sus alteraciones en la fisiopatología ósea.

Autor: DOMÍNGUEZ DE MARÍA PABLO.
Año: 2002.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: DPTO. QUÍMICA ORGÁNICA Y FARMACÉUTICA FAC. DE FARMACIA. UNIV. COMPLUTENSE DE MADRID.

Resumen: Los objetivos trazados y cumplidos en la presente Tesis Doctoral son los siguientes: Realización de un estudio de la inducción de dichos biocatalizadores por la levadura Candida rugosa ATCC 14830, explorando diferentes estructuras orgánicas, distintas del ácido oleico, como única fuente de carbono e inductor, estudiando en cada caso la proporción de isoformas encontradas en el medio de cultivo extracelular. Desarrollo de diferentes métodos de caracterización de las lipasas crudas producidas, partiendo de los clásicos métodos de hidrólisis, para llegar hasta nuevos protocolos sintéticos, tales como reacciones de esterificación y de transesterificación. Todas las lipasas obtenidas según el punto anterior fueron comparadas con muestras comerciales de las casas Sigma y Roche, mediante el empleo de dichos protocolos de caracterización. Estudio de métodos de inmovilización de enzimas, dentro de micelas reversas, por atrapamiento en fibras de hidroxipropilmetilcelulosa, y evaluación de su potencial utilidad como catalizadores de reacciones orgánicas de síntesis.

Autor: MARTÍNEZ CABALLERO SONIA .
Año: 2002.
Universidad: EXTREMADURA.
Centro de lectura: VETERINARIA.
Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA.

Autor: CARBALLEIRA RODRÍGUEZ JOSÉ DANIEL.
Año: 2002.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA .

Resumen: Esta Tesis Doctoral surge de la colaboración entre el Centro de Investigación Básica de GlaxoSmithKline en Tres Cantos y el Grupo de Biotransformaciones del Departamento de Química Orgánica y Farmacéutica de la Facultad de Farmacia de la UCM. Partiendo de una colección de 416 microorganismos seleccionada buscando la máxima biodiversidad, hemos conseguido identificar una serie de nuevos biocatalizadores de células enteras útiles en las reacciones de reducción de compuestos carbonílicos y oxidación de alcoholes, que muestran unas características muy prometedoras para su posible escalado industrial. Los microorganismos seleccionados para la reducción de compuestos carbonílicos fueron los hongos filamentosos Diplogelasinospora grovesii y Gongronella butleri así como la levadura Schizosaccharomyces octosporus. Para la oxidación de alcoholes hemos seleccionado tres levaduras: Williopsis californica, Williopsis saturnus y Pachysolen Tannophilus. Una vez seleccionados los microorganismos estudiamos su actividad frente a gran número de sustratos clasificados en series homólogas con el objetivo de modelizar la actividad de los biocatalizadores utilizando las técnicas QSAR-3D /CoMFA. Hemos demostrado la alta capacidad predictiva de los modelos propuestos, que nos permiten conocer a priori la idoneidad de nuestro biocatalizador frente a una reacción determinada, conocimiento de gran interés para el Químico Orgánico. Tras obtener los modelos tridimensionales de cada uno de los biocatalizadores encontramos similitudes en el patrón de actividad tanto en reducción como en oxidación, esto apoya la teoría de la existencia de un ancestro común a las alcohol deshidrogenasas responsables de estas reacciones. Hemos desarrollado un método de valoración global de los datos obtenidos en el screening a gran escala, la estructura de los sustratos y los modelos QSAR-3D/CoMFA que nos permiten, partiendo de la hipótesis de evoluciónd divergente, proponer un modelo del centro activo de la alcohol deshidrogenasa ancestral de la que provienen las presentes en los microorganismos estudiados.

Autor: PÉREZ BOADA MARTA.
Año: 2002.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: QUÍMICA .
Centro de realización: CENTRO DE INVESTIGACIONES BIOLÓGICAS (CSIC).

Resumen: En esta tesis se han abordado estudios estructura-función de un nuevo tipo de peroxidasa producida por el hongo ligninolítico Pleurotus eryngii, denominada peroxidasa versátil (VP). Esta hemoproteína se caracteriza por su amplia especificidad de sustrato, que incluye desde el Mn2+ hasta compuestos aromáticos fenólicos y no fenólicos o colorantes de tipo azo. Se ha desarrollado un sistema de expresión heteróloga de la VP en Escherichia coli, situando el cDNA correspondiente a la proteína madura en el vector de expresión pFLAG1. La proteína expresada se acumuló en forma de cuerpos de inclusión, que se aislaron y solubilizaron en presencia de urea, para realizar posteriormente el plegamiento in vitro de la peroxidasa recombinante. Se investigó la influencia de diferentes parámetros en la reacción de plegamiento, como el pH, las condiciones redox y la concentración de proteína, urea e iones calcio. El protocolo optimizado permite recuperar hasta un 10% de enzima en forma activa, un rendimiento tres veces superior al obtenido para otras peroxidasas estructuralmente similares. Asimismo se han realizado estudios mediante la técnica de stopped-flow para la caracterización espectroscópica del ciclo catalítico y el análisis de la cinética del estado transitorio de la reacción de la VP con el H2O2 y el alcohol veratrílico (VA), que es uno de sus sustratos reductores. Los resultados obtenidos ponen de manifiesto unas propiedades de los intermediarios de oxidación (compuestos I y II) muy similares a las de otras peroxidasas estudiadas. Se ha calculado la constante de formación del compuesto I a distintos valores de pH, así como las constantes de formación y reducción del compuesto II por el VA. Los estudios de NMR de la proteína en disolución y difracción de rayos X tras obtención de cristales proporcionaron información estructural precisa de la VP. Los espectros de NMR de la VP mostraron que el entorno del hemo es similar al de otras peroxidasas y permitieron predecir un potencial redox superior al de las peroxidasas procariotas o de plantas pero inferior al de las peroxidasas ligninolíticas de Phanerochaete chrysosproium. Además los espectros de NMR durante la titulación de la VP con Mn2+ sugirieron la existencia de un único sitio de unión situado en las proximidades de los propionatos del hemo. La estructura cristalográfica (resuelta con una resolución de 1,13 A) incluye 11 hélices, 4 puentes disulfuro, 2 calcios estructurales, y un grupo hemo de tipo b situado en la cavidad central. El análisis detallado permitió determinar además la localización de ciertos aminoácidos que podrían ser funcionalmente relevantes. Utilizando el sistema de expresión heteróloga desarrollado se llevó a cabo la mutagénesis dirigida de tres de estos residuos, y se estudiaron las variantes obtenidas. Los resultados han permitido confirmar el sitio de unión de Mn2+ propuesto a partir de los datos de NMR, que se encuentra situado cerca del propionato interno del hemo, así como la implicación de un triptófano superficial en la oxidación de sustratos aromáticos como el VA, que tendría lugar a través de una ruta de transferencia electrónica de largo recorrido. Sin embargo, no se han obtenido evidencias de que algún sustrato se oxide en la zona del canal de acceso al hemo tal como ocurre en las peroxidasas de plantas.

Autor: PEINADO MENA JUAN RAMÓN.
Año: 2002.
Universidad: CORDOBA.
Centro de lectura: CIENCIAS .
Centro de realización: UNIV. DE CÓRDOBA.

Resumen: Esta Tesis Doctoral el fenómeno de la plasticidad secretora de las células endocrinas, utilizando para ello como modelo las células melanotropas existentes en el lóbulo intermedio de anfibios. En concreto, este trabajo realiza un estudio comparativo entre los dos subtipos de melanotropas con características funcionales distintas, definidas como melanotropas secretoras y melanotropas almacenadoras, enfocado a determinar los mecanismos moleculares que controlan el estado secretor de este tipo celular. Para llevar a cabo estos estudios, se han utilizado técnicas novedosas, como son el Differential Display, RT-PCR semicuantitativa y microscopía confocal. Además, se han conseguido las secuencias de ADNc completas de varios de los genes de interés. En particular, se analizan diferentes proteínas con un papel clave en el proceso secretor, como son las graninas (secretogranina II, cromogranina A y 7B2) y las convertasas (PC1 y PC2). También se ha investigado la existencia de nuevos genes implicados en este proceso y que, por lo tanto, pueden estar implicados en el mantenimiento del fenotipo secretor de las melanotropas.

Autor: BERNADÓ PERETÓ PAU.
Año: 2002.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: QUÍMICA.
Centro de realización: FACULTAD DE QUÍMICA.

Resumen: Históricamente la resonancia magnética nuclear se ha basado en propiedades de tipo local. Las propiedades globales medidas por RMN ofrecen una mejor definición del sistema tanto a nivel estructural como a nivel dinámico. En esta memoria se han estudiado dos tipos de propiedades globales: las constantes dipolares residuales, CDR, en sistemas parcialmente orientados, y las velocidades de relajación. Además, se han desarrollado herramientas teóricas para su interpretación. Nuestra primera contribución a los sistemas parcialmente orientados ha sido el desarrollo de una ecuación analítica que predice el grado de orientación de una biomolécula en el interior de un sistema orientador de tipo estérico como las bicelas a partir de la estructura tridimensional de la misma. Se ha realizado también un estudio experimental sobre la modulación mediante lantánidos de la orientación de fragamentos de membrana púrpura. En esta situación, las propiedades dinámicas de proteínas en el interior de un sistema orientador fuerte se ven modificadas. Se ha demostrado que este efecto dinámico está relacionado con el mismo proceso de orientación. Las velocidades de relajación dependen del tamaño y la forma de las proteínas, y pueden predecirse a través de cálculos hidrodinámicos. Se han realizado este tipo de cálculos para numerosas proteínas y se han comaprado los valores teóricos con los experimentales. Esta comparación permite la detección de fenómenos dinámicos locales. Hemos interpretado también el valor del parámetro ajustable a. Este parámetro nos ofrece una visión del comportamiento dinámico de la proteína en solución, si se producen fenómenos de agregación/oligomerización (a.> 3.5 A) o si hay movilidad interdominio (a.

Autor: TORRECILLAS SÁNCHEZ ALEJANDRO.
Año: 2002.
Universidad: MURCIA.
Centro de lectura: VETERINARIA.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE MURCIA.

Resumen: La proteína quinasa C (PKC) participa en numerosas funciones fisiológicas a través de distintas rutas de señalización celular. El grupo de las isoenzimas clásicas de la PKC incluye a la PKC alfa, beta I, beta II y gamma y está regulado por diacilglicerol, ésteres de forbol, calcio y fosfolípidos aniónicos. La introducción de una insaturación en una de las cadenas de los diacilgliceroles que forman parte de la membrana modifica en gran medida la capacidad de activación de la PKC alfa de manera independiente a la presencia de fosfolípidos aniónicos y cationes divalentes. Los dominios C2 de las isoenzimas clásicas de la PKC muestran afinidades similares por calcio en ausencia de membranas y el proceso implica la intervención de la menos dos cationes según los estudios realizados mediante espectrocopía de fluorescencia. La presencia de membranas aumentó la afinidad por el catión. Además, los tres dominios interaccionan de manera distinta con las membranas en presencia de calcio. Según la calorimetría de titulación isotérmica, los dominios C2 de las isoenzimas clásicas de la PKC presentan dos tipos de sitios de unión de calcio, para enlazar un total de tres cationes de manera similar. La desnaturalización térmica de estos dominios C2 en presencia de distintas concentraciones de calcio fue irreversible. La transición se desplazó hacia mayores temperaturas con concentraciones crecientes de calcio, siendo mayor el efecto en presencia de fosfolípidos aniónicos. El significado de los ligandos unidos a cada uno de los dominios C2 fue diferente. La estructura secundaria de los dominios C2 de las isoenzimas clásicas de la PKC obtenida mediante espectroscopía de infrarrojo mostró una elevada proporción de hoja beta. La adición de calcio no modificó la estructura secundaria pero sí aumentó la estabilidad frente a la desnaturalización térmica. El proceso de desnaturalización de los dominios C2 fue distinto para cada uno. La PKC alfa completa presenta una importante contribución de hoja beta en su estructura secundaria, según los datos de la espectroscopía de infrarrojo. La adición de distintos ligandos no modificó en gran medida esta estructura secundaria. El proceso de desnaturalización térmica de la PKC alfa en presencia de distintos ligandos fue similar, salvo con la adición de PMA.

Autor: ALVAREZ ALVAREZ JAVIER .
Año: 2002.
Universidad: OVIEDO.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: La heteroglobina (HGB) es una proteína heterodimérica que presenta un tamaño aparente de 39 ó 37 kDa y que ha sido detectada en condiciones no reductoras en glándulas de Harder, parótidas y submaxilares así como en saliva de hámster sirio, empleando un antisuero antipéptido desarrollado frente al extremo C-terminal de la ORF del cDNA FHG22. Este antisuero detecta en condiciones reductoras un único polipéptido de 5,6 kDa llamado HGB.A, que mediante secuenciación amino terminal fue identificado como el producto maduro de traducción del mRNA FHG22. La distribución tisular y los niveles de expresión de HGB.A y de la HGB son iguales a los del mRNA FHG22, con mayor expresión en hembra en glándulas submaxilares y de Harder. La purificación de la HGB reveló que está constituida por la subunidad HGB.A unida por puentes disulfuro a la subunidad HGB.B, un polipéptido N-glicosilado de 33,5 kDa que tras su completa desglicosilación presenta un tamaño de 9 kDa. Gracias al diseño de una sonda de HGB.B para el escrutinio de la genoteca de cDNA de glándula de Harder de hembra, se identificaron dos clones de cDNA (HGB.B1 y HGB.B2) correspondientes a isoformas altamente homólogas (96,2% de identidad) de la subunidad HGB.B. Ambas poseen ORFs de 94 aminoácidos que, a pesar de presentar entre sí 12 diferencias, conservan tres sitios consenso de N-glicosilación y péptidos señal idénticos. Estudios de homología revelaron que los polipéptidos HGB.A, HGB.B1 y HGB.B2 pertenecen a la familia de las Secretoglobinas-Uteroglobinas. La expresión de los mRNAs para las subunidades HGB.A y HGB.B es paralela a la expresión de la HGB y del polipéptido HGB.A, pero el mRNA HGB.B2 no se detecta en glándulas submaxilares. El estudio de la expresión de HGB a lo largo del ciclo estral del hámster demostró que la expresión de la HGB en glándulas de Harder ocurre sólo en el día 2 del ciclo, coincidiendo con la subida de los niveles séricos de estradiol. Sin embargo, en glándulas submaxilares y parótidas la expresión ocurre en los cuatro días del ciclo con niveles poco o nada variables. Por último, se ha demostrado que la HGB es el primer alérgeno descrito de hámster sirio, al ser reconocido específicamente por anticuerpos IgE humanos presentes en sueros de pacientes alérgicos al hámster.

Autor: VALDES OJEDA EVA M..
Año: 2002.
Universidad: OVIEDO.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: La proteína Sfc1 de Saccharomyces cerevisiae pertenece a una familia de proteínas mitocondriales que esta formada por 35 miembros, los cuales están codificadas por genes nucleares. Estas proteínas se sintetizan en el citosol sin presecuencia aminoterminal y se mantienen sin plegarse gracias a la acción de chaperononas citosólicas. Luego, las translocasas de la membrana mitocondrial externa e interna (TOM y TIM, respectivamente) las reconocen y las transportan a través de ambas membranas. Esta clase de proteínas contiene secuencias internas de señalización para su transporte a la mitocondria. El papel fisiológico de Sfc1 es transportar el succinato producido en el citosol, a partir de isocitrato por la acción de la isocitrato liasa, al interior mitocondrial mediante un intercambio por fumarato. Este intercambio es esencial para el crecimiento de S.cerevisiae en etanol o acetato como única fuente de carbono. En este trabajo hemos determinado la importancia de tres residuos de cisteína y de dos grupos amino presentes en el transprotador Sfc1 para su función, mediante técnicas de mutagénesis dirigida. Además, hemos identificado posibles secuencias internas relacionadas con la localización subcelular de Sfc1.