PROTEINAS, 4

Autor: CABRERA ASENSIO AARON.
Año: 2002.
Universidad: LA LAGUNA.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGÍA.

Resumen: Los objetivos de esta tesis son: 1,- Caracterización y purificación de enzimas que degradan diadenosina polifosfatos intracelularmente (Ap3Aasa y Ap4Aasa) y de ectoenzimas que los degradan extracelularmente. 2,- Comparación de Actividad Ap3Aasa citosólica humana con la proteína supresora de tumores Fhit. Para garantizar una caracterización exhaustiva de los enzimas investigados se utilizaron una amplia gama de técnicas: cromatografía convencional y HPLC, electroforesis, ensayos de fluorescencia, ensayos enzimáticos, y diversos modelos experimentales: citosol de tejidos de rata, membranas de cerebro, cerebelo y sinaptosomas de rata, ovocitos de Xenopus laevis y citosol de leucocitos y plaquetas humanos. Estos diferentes modelos permitieron la comparación de las características de los enzimas estudiados en diferentes organismos y sistemas. Los ensayos de la actividad enzimática se realizaron con eteno derivados de diadenosona polifosfatos como sustratos fluorogénicos. Ello supone una gran simplificación sobre técnicas radiométricas y cromatográficas anteriormente en uso, y posibilita la valoración de la actividad Ap3Aasa en clínica mediante un sencillo, económico y rápido método fluorimétrico. Los resultados indican que es imposible distinguer cinéticamente entre la Actividad Ap3Aasa citosólica de plaquetas y leucocitos y la actividad Ap3Aasa de Fhit, que la suramina es el inhibidor más potente descrito hasta el momento de la actividad Ap3Aasa y que el enzima Ap3Aasa presenta un masa molecular de 32 kDa en condiciones nativas y de 17 kDa en SDS-PAGE. Se trata de la primera caracterización del enzima Ap3A hidrolasa humano. El estudio comparativo entre el enzima Ap3A hidrolasa y el supresor tumoral Fhit ha revelado que ambas proteínas son idénticas o isoformas estrechamente relacionadas. Por primera vez se atribuye una función específica al enzima Ap3A hidrolasa a pesar del tiempo transcurrido desde su descubrimiento. Este hallazgo, junto con la técnica fluorimétrica de valoración de la actividad Ap3Aasa, abre todo un campo de posibilidades de aplicación en diagnóstico/pronóstico oncológico. La actividad ApnAasa de membrana de cerebro, cerebelo y sinaptosomas de rata estudiadas presentan características propias de la familia E-NPP y está compuesta por diferentes especies enzimáticas que difieren en punto isoeléctrico. La distribución de la actividad 5'-nucleotidasa varía según el tipo celular y la región de la membrana de la que se trate. La caracterización de esta actividad, especialmente en sinaptososmas, supone la primera aproximación sistemática y un nuevo apoyo experimental a la hipótesis que propone a los ApnA como neurotransmisores o neuromoduladores.

Autor: MARTINEZ ESPINOSA ROSA M. .
Año: 2002.
Universidad: ALICANTE.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: DPTO. AGROQUÍMICA Y BIOQUÍMICA - FACULTAD DE CIENCIAS - UNIVERSIDAD DE ALICANTE.

Resumen: Los resultados recogidos en esta Tesis Doctoral suponen el primer estudio, tanto a nivel fisiológico como bioquímico, que se lleva a cabo sobre la Reducción Asimilativa del Nitrógeno en un organismo halófilo del dominio Archaea (Haloferax mediterranei). A. Mediterranei es capaz de crecer en medios con elevada concentración de nitrato, nitrito y NaCl. En presencia de Nlt4+ se observó una inhibición de la reducción asimilativa del nitrógeno. Dicho efecto negativo, se revertía en presencia de MSX en los medios de cultivo. H. Mediterranei presenta una pigmentación más acusada (aumenta la síntesis de bacteriorubennas) en medios con pH superior a 7'3. La nitrato reductasa asimilativa de H. Mediterranei es una molibdoenzima heterodimérica, con un pH óptimo en torno a q. Su actividad y estabilidad dependen de la concentración de NaCl. La nitrato reductasa asimilativa es un monómero con pH óptimo en torno a 7'5. El donador fisiológico de electrones en esta via metabólica es la ferredoxina.

Autor: PRIETO MARTÍN ASCENSIÓN.
Año: 2002.
Universidad: ZARAGOZA.
Centro de lectura: VETERINARIA .
Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA - UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA.

Resumen: La mitocondria tiene su propio genético y todos los elementos necesarios para su expresión. En el momento del comienzo de esta tesis, solo se conocían como proteínas implicadas en el inicio de la transcripción mitocondrial en mamíferos, y más concretamente en humanos, una RNA polimerasa (h-mtRPOL) y un factor de transcripción denominado factor de transcripción mitocondrial A (h-mtTFA). En el presente trabajo se han subclonado estas proteínas y se ha comprobado que por sí solas no son capaces de producir la iniciación del proceso. Posteriormente, se ha identificado otra proteína implicada y que ha resultado ser el factor de transcripción mitocondrial B en humanos (h-mtTFB). También se ha identificado y clonado el factor de terminación de la transcripción mitocondrial de rata (r-mTERF). Esta proteína tiene como función la de provocar la terminación de la transcripción mitocondrial cuando ésta comienza en el sitio de iniciación H1 para la sintesis de los RNA ribosómicos mitocondriales. Se ha comprobado que r-mTERF recombinante tiene capacidad de unirse a DNA "in vitro", así como de producir terminación de la transcripción "in vitro", a diferencia de lo que ocurría con la proteína recombinante humana homóloga. Además, se ha comprobado que esta actividad de terminación viene regulada por fosforilaciones de la proteína, dejando abierto el campo de estudio de esta proteína en mamíferos.

Autor: PALACIOS BONILLA ÓSCAR.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y DE FORMACIÓN CONTINUADA .

Resumen: Las metalotioneínas (MT) son unas proteínas de bajo peso molecular y elevado contenido en residuos de cisteína que se caracterizan por su extremada habilidad para enlazar tanto cationes de metales esenciales, como Zn(II) y Cu(I), como de metales tóxicos (Cd(II), Hg(II)). En una primera parte de este trabajo se analiza la utilización del catión Ag(I) como sonda del catión Cu(I) en el estudio de las Cu-MT, y en consecuencia se comparta detalladamente el comportamiento de ambos metales frente a la isoforma 1 de MT de mamífero. Dicha proteína, así como sus fragmentos constitutivos alfa y beta, se han obtendios por ingeniería genética con el fin de asegurar al máximo su grado de pureza. El estudio de la capacidad coordinante de MT 1, alfaMT 1 y betaMT 1 frente Ag(I) se ha llevado a cabo mediante técnicas de espectroscopía electrónica (CD y UV-Vis) y de masas (ESI-MS). Esta última ha requerido la incorporación de un método de separación previo a la determinación de la masa, con el fin de eliminar la presencia de tampón en la muestra. La electroforesis capilar (CZE) acoplada a ESI-MS ha demostrado ser una buena opción. Con el fin de validar el acoplamiento CZE-ESI-MS, en primer lugar se ha aplicado al estudio del desplazamiento del Zn(II) en Zn7-MT 1 por Cd(II) a pH 7, proceso ya conocido en las MT de mamífero que procede de manera secuencial e isomorfa. Este estudio demuestra que el acoplamiento citado permite una buen separación del tampón de la solución que contiene la proteína, a la vez que ofrece una detección precisa de la estequimotría de las especies que coexisten en solución. En base a estos resultados, se ha seguido en paralelo -mediante CD, UV-Vis y CZE-ESI-MS- la valoración de Zn7-MT 1, Zn4-alfaMT 1 y Zn3-betaMT 1 con AgClO4 a pH7 y 2.5. Los resultados muestran que a lo largo de las valoraciones se forma un elevado número de especies, tanto heterometálicas AgxZny-MT como homometálicas Agx-MT, y que en la mayoría de los puntos de valoración coexisten diversas especies. También se ha observado que el zinc ejerce un efecto plantilla en las 3 proteínas estudiadas, dado que el grado de estructuración de especies Ag-MT de la misma estequiometría depende de manera importante de que la especie inicial sea Zn-MT o apo-MT. La comparación Ag-Cu permite concluir que los únicos casos en que el ión Ag(I) se podría utilizar como sustituto de Cu(I) sina causar alteraciones estructurales significativas se dan en las especies heterometálicas M4Zn5-MT y M4Zn3-MT (M=Ag, Cu). En la segunda parte del trabajo se ha estudiado una nueva MT de Drosophila melanosgaster, denominada MTO, con el objetivo de contribuir a un criterio funcional de clasificación de las MT en Zn- o Cu-tioneína. La proteína MTO, que cuenta con 12 Cys en su cadena aminoacídica, se biosintetiza como Zn4-MTO en medios ricos en Zn, mientras que en medios enriquecidos en Cu se obtiene la especie Cu9-MTO. El conjunto de resultados, tanto in vivo como in vitro, permiten clasificar a la MTO como una Cu-tioneína, es decir con preferencia coordinativa respecto dicho metal. También, por primera vez se ha podido aportar evidencias estructurales sobre la participación de los iones cloruro en la coordinación de iones metálicos en MT, concretamente en las especies M4-MTO (M=Zn, Cd).

Autor: MÁRQUEZ MARTÍNEZ MERCEDES.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y DE FORMACIÓN CONTINUADA.

Resumen: La bacteriorodopsina (bR) es una proteína transmembranal de siete hélices alfa de la arqueobacteria halobacterium salinarum. La bR tiene unida covalentemente mediante una Base de Shiff (BS) protonada una molécula de retinal, cromóforo responsable de que, activada por la luz, la bacteriorodopsina bombee protones desde el interior al exterior de la célula. Este bombeo se realiza mediante un fotociclo, sucesión de estados conformacionales y bioquímicos llamados intermediarios por los que pasa la proteína para dar lugar a la translocación de protones. El gradiente electroquímico de protones generado es aprovechado por las ATP sintasas para sintetizar ATP, energía que es utilizada por la bacteria en casos de emergencia cuando existe una baja disponibilidad de oxígeno en el ambiente. Gracias al interés que despertó el descubrimiento de un sistema fotosintético tan sencillo, la bR es una de las proteínas transmembranales más conocidas y se utiliza como modelo para el estudio de otras proteínas de membrana como son los receptores acoplados a proteína G. El trabajo presentado en esta tesis se ha centrado en la región extracelular de la proteína y se ha agrupado en tres bloques diferentes. En el primero de ellos se ha estudiado el papel funcional y estructural de varios grupos formadores de puentes de hidrógeno mediante la realización de las mutaciones R7E/E9R, Y79F y S193A. El estudio de estos mutantes ha mostrado que la tirosina 79, la arginina y 7 el glutámico 9 son grupos importantes para el mantenimiento estructural de la bR, ya que la realización de estas mutaciones produce una aceleración en el tiempo de reacción de la hidroxilamina, indicando una menor compactación de las hélices en estos mutantes. Estas alteraciones de la bR producen a su vez una disminución en la estabilidad térmica de la proteína. Estas mutaciones sin embargo no afectan de manera relevante la función de la bR excepto por el hecho de disminuir en una unidad de pH el pKa del complejo liberador del protón. La Tyr y 79, el Glu 9 y la Arg 7 se encuentran actuando como nexo de unión entre una red de aguas principal que conecta el retinal con la zona extracelular de la proteína, y una red de aguas local. Por otro lado la sustitución de la serina 193 por una alanina da lugar a cambios estructurales de la proteína y a un aumento en el pKa de complejo liberador del protón, además de una importante disminución en la eficiencia bombeadora de protones, demostrando que esta serina, mediante sus interacciones con el glutámico 204, se encarga de mantener la correcta funcionalidad y estructura del complejo. En el segundo bloqueo se ha estudiado el papel funcional y estructural de las prolinas 8, 77 y 200 que, dispuestas en forma de bolsillo, se encuentran alojando cuatro moléculas de agua que estarian formando una red de aguas local. Aunque las prolinas podrían interaccionar mediante puente de hidrógeno con estas moléculas de agua, parece ser que la distancia entre los diferentes grupos seria demasiado importante como para que dicha interacción pudiera darse. Sin embargo, la rigidez de la cadena polipeptídica generada por las prolinas podria dar lugar a que grupos colindantes a estas prolinas pudieran interaccionar con la red de aguas. La sustitución de estas prolinas por glicinas de manera individual y triple, y la sustitución de la prolina 8 por un triptófano dan lugar a una serie de alteraciones importantes en el entorno del retinal, como es un incremento en el pKa del principal contraión de la BS, el Asp 84, o la disminución del pKa de la BS. Estas alteraciones van acompañadas de una menor compactación de las hélices al realizas las mutaciones tal y como indican los experimentos de accesibilidad por hidroxilamina. En el caso del mutante P200G lo que se ha observado ha sido una mayor compactación de la proteína comparado con la bR salvaje, indicando que al sustituir la prolina por una glicina lo que se está produciendo es una mayor rigidez de las hélices durante el fotociclo. Las mutaciones P8W, P77G y P200G además presentan una importante disminución en la capacidad bombeadora de protones. Todos estos efectos se producirian por una alteración en las interacciones entre los grupos colindantes a las prolinas y las moléculas de agua de la red local y otros grupos de la proteína. En el tercer y último bloque presentado se han aportado datos sobre la relación a larga distancia entre el aspártico 96 y el glutámico 194. El Asp 96 se encuentra localizado en la región citoplasmática de la bR, y es el grupo encargado de reprotonar la BS una vez que ésta se ha desprotonado. Cuando este aspártico se encuentra sustituido por una aparragina, el protón que tiene que reprotonar la BS procede directamente desde el citoplasma, hecho que enlentece su reprotonación. El Glu 194 por el contrario se encuentra localizado en la región extracelular y forma parte del complejo liberador del protón. Cuando se añade la mutación E194Q al mutante D96N se observa una importante aceleración en la reprotonación de la BS tal y como lo indican los experimentos de fotólisis de destello y espectroscopia de infrarrojo. Estos resultados indicarian que la anulación de la carga negativa del glutámico 194 situado en la región extracelular, estaría afectando la entrada de protones desde el lado citoplasmático indicando pues una interacción a larga distancia. El doble mutante además posee una importante alteración en el mecanismo de bombeo de protones, no solamente porque la expulsión y captación del protón se realiza simultáneamente en la proteína, sinó porque también la eficiencia de bombeo en el mutante es de un 35% comparado con la bR salvaje. En este trabajo además se ha demostrado que como la aparición del intermediario M depende del estado de protonación del Glu194, el pKa de aparición de este intermediario es en realidad el pKa del complejo liberador del protón en el estado basal de la proteína. Por otro lado, los resultados de pKa alcalino obtenidos para diferentes mutantes estudiados en esta tesis, muestran que la desprotonación de la BS no es suficiente para dar lugar a la desnaturalización de la proteína debido a pH alcalino, sino que además seria necesaria la desprotonación de otros grupos a pH básicos como podrian ser diversas tirosinas.

Autor: ASIN CAYUELA JORGE.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y DE FORMACIÓN CONTINUADA.

Autor: DEUPÍ CORRAL XAVIER .
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAT DE MEDICINA. UNIVERSITAT AUTÓNOMA DE BARCELONA.

Autor: QUEVEDO SOUBRIET CELIA .
Año: 2002.
Universidad: ALCALA.
Centro de lectura: PABELLON DOCENTE HOSPITAL RAMON Y CAJAL..
Centro de realización: HOSPITAL RAMON Y CAJAL.

Resumen: El factor de crecimiento similar a insulina (IGF1) juega un papel esencial en la regulación del crecimiento y el desarrollo del sistema nervioso por lo que se considera como un factor neurotrófico. La unión del factor IGF1 a su receptor induce la activación de dos rutas de señales fundamentalmente: PI3K/PKB y MAPK. Una de las respuestas más tempranas y obligatorias que desencadenan los factores de crecimiento es la modulación de la síntesis de proteínas. En la presente tesis se describe cómo el factor IGF1 es capaz de activar el factor de iniciación eIF2B en cultivos neuronales de manera dependiente de las dos rutas de señales anteriormente mencionadas a corto plazo y sólo dependiente de PI3K a largo plazo. La activación de PI3K induce la disminución de la actividad GSK3 al ser esta fosforilada por PKB. Con ello disminuye la fosforilación que GSK3 ejerce sobre la subunidad e del factor eIF2B lo que permite su activación. Por otro lado, la activación de MAPK, que sólo se produce durante las primeras 6 horas del tratamiento con IGF1, induce la activación de la fosfatasa PP1 por un mecanismo desconocido pero en el que quizá sea importante la asociación que se produce in vivo entre ERK2 difosforilada y PP1. La activación de PP1 es necesaria para que se produzca la activación del factor eIF2B tras el tratamiento con IGF1 in vivo, y además, PP1 es capaz de activar al factor eIF2B in vitro. Por otro lado, el tratamiento con IGF1 induce la fosforilación de la proteína represora 4EBP1 en los residuos de Thr 36 y Thr 45, la fosforilación del factor de iniciación eIF4G y la defosforilación del factor de iniciación eIF4E, de manera concomitante con un aumento en la asociación del los factores eIF4E-eIF4G. Todos estos efectos son dependientes de PI3K y mTOR e independientes de MAPK. La activación del factor eIF2B y el aumento en la formación del factor eIF4F permiten la activación de la traducción tras el tratamiento con IGF1. Por otro lado, IGF1 induce la supervivencia neuronal inhibiendo la muerte por apoptosis que se produce por la ausencia de factores tróficos. Este efecto depende de la activación de PI3K y mTOR y es independiente de MAPK.

Autor: PUERTA GARCIA BARROSO ANGEL DE LA.
Año: 2002.
Universidad: ALCALA.
Centro de lectura: FACULTAD DE QUIMICA..
Centro de realización: INSTITUTO DE QUIMICA ORGANICA GENERAL, C.S.I.C., MADRID.

Resumen: La b-lactoglobulina (bLG) es el principal alergeno presente en leche de vaca. Para evitar las alergias provocadas por esta proteína se han comercializado fórmulas hipoalergénicas, en las que se ha intentado eliminar este alergeno. Sin embargo, se han descrito casos de alergia tras la ingestión de estos alimentos, que hacen pensar en la existencia de cantidades residuales de la proteína o de sus fragmentos peptídicos. Para realizar la determinación de este alergeno en concentraciones tan bajas en matrices complejas como son los alimentos es necesario disponer de un método de análisis de bLG altamente selectivo y sensible, con elevada precisión, rápido y automatizable, condiciones que cumplen los inmunoensayos en sistemas cromatográficos. Por tanto, se ha llevado a cabo el desarrollo de un método inmunocromatográfico empleando como relleno cromatográfico un soporte con anticuerpos específicos antibLG para la cuantificación a niveles traza de bLG en fórmulas hipoalergénicas basadas en proteínas de leche de vaca. La inyección del preparado hipoalergénico en la columna origina la retención selectiva de bLG y sus fragmentos peptídicos antigénicos. Una etapa posterior de reconocimiento en la propia columna con un anticuerpo anti bLG marcado con una sonda enzimática seguida de la inyección de sustrato de la reacción enzimática origina una cantidad de producto proporcional a la cantidad de antígeno existente en la muestra, que se cuantifica en el detector del sistema cromatográfico. El método desarrollado se ha identificado con el nombre ELIAC (enzyme-linked immunoaffinity chromatography). El estudio se ha estructurado del siguiente modo: 1) Estudio de diversos procedimientos de unión covalente de antibLG a soportes cromatográficos de diferentes características, 2) Selección y evaluación, mediante inmunodotting, de las soluciones a emplear durante el inmunoensayo en columna, 3) Caracterización de las inmunocolumnas fabricadas en términos de capacidad de carga y de la cinética de adsorción, 4) Estudio de las interacciones no específicas de antibLG-E empleando un sistema modelo, 5) Selección, mediante un sistema modelo, de las condiciones óptimas de la etapa de reacción enzimática, 6) Desarrollo del método ELIAC con soluciones patrón de bLG y 7) Aplicación del ELIAC desarrollado a la determinación de bLG y sus péptidos antigénicos en fórmulas hipoalergénicas comerciales. Como resultado de este trabajo se ha logrado la puesta a punto de un método de análisis que permite cuantificar bLG en concentración picomolar (5 millones de veces inferior a la habitual en leche de vaca), obteniendo el resultado en un tiempo unas 30 veces inferior al de un ensayo ELISA tradicional. El método desarrollado ha permitido poner de manifiesto en las fórmulas hipoalergénicas estudiadas la presencia de bLG y péptidos de bLG de diferentes tamaños que son antigénicos, lo que podría justificar la alergenidad producida en niños hipersensibles.

Autor: FIGUEROA CONDE-VALVÍS ANGÉLICA.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS "ALBERTO SOLS". CSIC-UAM.

Resumen: Los mecanismos post-transcripcionales, y en concreto el control de la vida media de los RNA mensajeros (mRNA), es hoy considerado un punto muy importante en la regulación de la expresión génica. HuR es una proteína con capacidad de unión a mRNAs que participa en la respuesta celular a diversas señales externas modulando la estabilidad de sus mRNAs diana. Este estudio está centrado en el proceso de diferenciación muscular esquelética, utilizando como sistema modelo la línea celular C2C12 de ratón. La localización de la proteína HuR es exclusivamente nuclear en células en proliferación. Hemos observado que los niveles de HuR en la citoplasma aumentan notablemente al inicio de la diferenciación de las células C2C12 y se mantienen elevados durante el proceso, disminuyendo y posteriormente siendo HuR de nuevo predominante nuclear cuando dicho proceso finaliza. Nuestros resultados muestran que HuR se une a las regiones 3' no traducidas de mRNAs que codifican reguladores transcripcionales específicos de músculo (miogenina y myoD), así como proteínas involucradas en la salida del ciclo celular (p21walf1) y en la contracción muscular (tropomiosina). La asociación de HuR con estos transcritos es inicialmente muy baja en células indiferenciadas proliferantes, se incrementa fuertemente en células diferenciadas, y disminuye nuevamente cuando el proceso de diferenciación concluye. Hemos observado que las vidas medias de estos mRNAs aumenta durante la diferenciación coincidiendo con la presencia de HuR en el citoplasma. Además, la sobre-expresión de HuR en células C2C12 causa un aumento de la expresión y vida media de mRNAs diana, y provoca también una aceleración en la formación de miotubos. En conjunto, nuestros datos indican que HuR contribuye directamente al proceso de diferenciación regulando de modo coordinado la vida media de los mRNAs que codifican proteínas críticas para miogenésis esquelética.

Autor: FUENTES LEDO GLORIA.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: INSTITUTO DE CATÁLISIS Y PETROLEOQUÍMICA.

Resumen: Los ésteres de sacarosa presentan numerosas propiedades que los hacen útiles en muy diveros campos. Haciendo uso de la regioselectividad complementaria sobre los diferentes hidroxilos de la molécula de sacarosa que presentan varias hidrolasas, en medios no-acuosos, se han obtenidos dierentes monoésteres de ésta. Aplicando técnicas computacionales se ha intentado comprender las bases moleculares de la diferente regioselectividad de estas hidrolasas ampliamente utilizadas en la síntesis de estos compuestos, así como los cambios conformacionales que estas enzimas sufren durante estas reacciones. Se han utilizado diversas técnicas como el anclaje del sustrato, protocolos de minimización, búsquedas conformacionales y simulaciones de dinámicas molecular, basándonos en el conocimiento de las propiedades estructurales tridimensionales del sitio catalítico de las enzimas y del mecanismo detallado de la reacción enzimática catalizada por éstas, con el fin de estudiar la relación entre la estructura y dinámica de las proteínas en la reacción implicada. De la aplicación de éstas se han extraído ciertas conclusiones que se detallan a continuación. La base molecular de la regiopreferencia de lipasas y subtilisina encontrada experimentalmente se centra en el plegamiento proteico. Por un lado, haciendo uso de la información extraída de las búsquedas conformacionales sistemáticas realizadas, se puede afirmar que ambas enzimas presentan una especificidad de sustrato que puede estar en parte bajo "control dinámico"; así los diferentes ligandos van a terner un efecto en el comportamiento proteico, y determinarán los movimientos importantes en el curso del evento catalítico. CALB presenta una plasticidad estructural localizada en determinados aminoácidos que componen el bolsillo de ligandos, mientras que en TlL se aprecian acoplamientos de un alcance mayor entre diferentes regiones, que podrían contribuir a la cooperatividad observada en la unión de los ligandos. Mientras que con los estudios de las simulaciones de dinámica molecular, ha quedado patente que ambas lipasas retienen la flexibilidad necesaria para facilitar su habilidad catalítica cuando los ligandos se encuentras anclados a ellas y en los diferentes medios de reacción empleados en las reacciones sintéticas. Éstas también ha corroborado que la unión del ligando puede inducir cambios estructurales tanto en éste como en la proteína con la que está interactuando, y que esos movimientos proteicos internos son los que van a determinar las propiedades singulares y la función de la enzima. Por útlimo, mediante el análisis de los confórmeros de más baja energía líbre -debida a las interacciones proteína-ligando y a la contribución vibracional entrópica de los modos libracionales del ligando en su "jaula proteica", calculada utilizando la metodología de los modos normales-, es posible identificar las características enzimáticas que controlan la mencionada regioselectividad. Esta aproximación captura las contribuciones entrópicas más importantes y reduce el gasto computacional.

Autor: VALLÉS RAPP CRISTINA.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGÍA MOLECULAR SEVERO OCHOA.

Resumen: El gen codificante de la proteína SlrA de Thermus thermophilus HB8 fue identificado y clonado por su capacidad para bloquear la expresión del promotor del gen de la capa S (slpA) de esta bacteria termófila en un sistema heterólogo mesófilo (E.coli). Junto a este gen, se identificaron las proteínas SlpM y la propia SlpA como potenciales reguladores de slpA. Se demostró también que fragmentos C-terminales de SlpM y SlrA podían unirse al promotor slpA en ensayos de Southwestern blot mientras que un fragmento C-terminal de SlpA se unía a la región líder de su propio mRNA, pero no al promotor. Estos datos sugerían que SlrA y SlpM podría actuar como reguladores de la transcripción de slpA, mientras que SlpA autorregularía su traducción. Además, había sido demostrado que SlpM se sobreexpresa en el exterior de las células deficientes en slrA, siendo capaz de formar una cubierta critalina similar a la capa S. Todos estos datos indicaban que la expresión de la capa S en Thermus thermophilus HB8 está sometida a un complejo sistema de regulación en el que intervienen al menos las proteínas SlrA, SlpM y SlpA, existiendo además regulaciones cruzadas entre ellas. En esta tesis con el objetivo de conocer con más detalle la función de la proteína SlrA se ha procedido a purificar la proteína y estudiar in vitro su interacción con el promotor del gen slpA utilizando distintas estrategias. Además se ha analizado la función de SlrA in vivo a través del estudio de la expresión del gen SlrA, el análisis fenotípico y bioquímico de mutantes en SlrA de Thermus thermophilus y de la sobreproducción de SlrA en su organismo de procedencia. Nuestros datos demuestran que slrA codifica una proteína de localización periplásmica de unos 28 kDa y muy bajo número de copias, que se expresa cuando la célula disminuye su velocidad de crecimiento, coincidiendo su expresión máxima con la represión de la transcripción del gen de la capa S. Por su parte, los mutantes en slrA mantienen mayor nivel de transcripción de slpA, y durante más tiempo, sufren un notable grado de lisis celular tras permanecer algunas horas en fase estacionaria, y presentan un fuerte recambio de los componentes de la envoltura externa. La sobreexpresión de SlrA en Thermus thermophilus HB8 produce el bloque completo de la transcipción de SlpA, al tiempo ue provoca una fuerte inducción en la expresión de slpM. Por tanto nuestros datos demuestran in vivo el efecto represor de SlrA sobre el promotor de slpA y, a su vez refuerzan la idea de que SlpA reprime la expresión de slpM.

Autor: SALINAS LA ROSA MARTA.
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: Los factores de crecimiento y neurotrofinas como el factor de crecimiento nervioso (NGF) protegen frente a la apoptosis neuronal en condiciones de estrés, mediante la activación de varias cascadas de señales intracelulares. Una de estas cascadas, representada por la fosfatidilinositol 3 quinasa (Pl3K) y su efector Akt/PKB podría participar en la protección frente a insultos oxidativos que producen neurodegeneración. En esta Tesis, hemos analziado el papel protector de esta vía frente a las toxinas 1-metil-4-fenilpiridino (MPP+) y 6-hidroxidopamina (6-OHDA). Estas toxinas inducen estrés oxidativo y neurodegeneración, y reproducen características de la enfermedad de Parkinson. El estrés oxidativo provoca un aumento de ceramida que a su vez induce apoptosis mediante mecanismos no bien definidos. Hemos obsrvado que este esfingolípido participa en el programa de apoptosis mediante la inhbición de la vía de sueprvivencia Pl3K/Akt e implica la defosforilación de Akt por una proteína fosfatasa activada por ceramida (CAPP). Una versión de Akt anclada a la membrana mediante una señal de miristilación fue menos sensible a la desforilación por CAPP y confirió resistencia frente a la apoptosis inducida por C2-ceramida. Además la expresión de esta quinasa, constitutivamente activada, atenuó en gran medida la apoptosis provocada por este lípido. Puesto que la ceramida se considera un segundo mensajero de apoptosis para múltiples estímulos proapotóticos, incluyendo estrés oxidativo, estos resultados sugirieron que la activación de Akt podría proteger frente a toxinas productoras de especies reactivas de oxígeno (ROS). De acuerdo con esta hipótesis, hemos observado que Akt protege frente a la apoptosis inducida por MPP+, estabilizando el potencial de membrana mitocondrial y reduciendo los niveles de ROS, lo que sugiere una relación entre Akt y la maquinaria celular de detoxificación oxidativa. En la búsqueda de enzimas antioxidativos regulados por Akt, hemos analizado el efecto de la 6-OHDA en producción de ROS y apoptosis. Hemos observado que el NGF bloquea parcialmente la producción de ROS mediante la activación transcripcional de la enzima hemo oxigenasa 1 (HO-1). La activación de la vía Pl3K/Akt es necesaria para la inducción de esta enzima por NGF y, además, la activación de Akt es suficiente para aumentar su expresión transcripcional. Estudiando la región 5' regulada por el gen ho-1 humano hemos identificado un elemento de respuesta a Sp1 regulado por Pl3K/Akt. La regulación de un factor de transcripción tan general podría explicar la capacidad de esta vía para regular muchas funciones celulares diferentes como metabolismo, proliferación, diferenciación y supervivencia. Los resultados presentados en esta Tesis indican que versiones activadas de Akt protegen frente a muerte celular inducida por neurotoxinas relacionadas con la enfermedad de Parkinson y plantean la posible utilidad de esta quinasa en terapia génica de dicha enfermedad.

Autor: MARCO RECUENCO M. CARMEN DE .
Año: 2002.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGÍA MOLECULAR "SEVERO OCHOA" (CBM-SO).

Resumen: La proteína MAL es el miembro fundador de una familia de protéinas que comparten características estructurales y bioquímicas con MAL. Los resultados sobre el estudio de la proteína MAL han demostrado que es el primer componente encontrado de la maquinaria de tráfico de membranas mediado por "rafts". En concreto se ha demostrado que la proteína MAL es necesaria para el transporte directo a la membrana apical de proteínas de membrana y de secreción asociadas o no a "rafts", en las células epiteliales polarizadas de riñón MDCK. Sin embargo el patrón de expresión de MAL es muy restringido y existen tipos celulares que presentan un fenotipo polarizado, con rutas de transporte polarizadas. Por todo ello, nuestro grupo planteó la hipótesis de que otros miembros de la familia de MAL tuviesen un papel como maquinaria de "rafts" en procesos de tráfico de membranas. Por lo tanto, el presente trabajo de tesis ha consistido en demostrar un papel general de los miembros de la familia de MAL como maquinaria de "rafts" implicada en diferentes procesos de tráfico de membranas. Para llevar a cabo dicho objetivo se ha realizado la caracterización bioquímica y funcional de dos miembros inéditos de la familia de MAL: BENE y MAL2. El resultado del estudio de la proteína BENE, en las células endoteliales ECV304, es que se asocia a la proteína caveolina-1 y ambas proteínas trabajan de forma conjunta en la homeostasis del colesterol de membrana. El resultado de la proteína MAL2 en las células hepáticas HepG2 ha demostrado que MAL2 es necesaria para el proceso de transporte indirecto o transcitosis del complejo pIgR-IgA y de la proteína endógena Cd59. De modo que en respuesta a la hipótesis inicial de que los miembros de la familia de MAL de proteínas funcionan como maquinaria de "rafts" en diferentes procesos de tráfico de membranas, podemos concluir que, efectivamente, dos nuevos miembros: BENE MAL2 participan en diferentes procesos de tráfico de membranas mediados por "rafts".

Autor: HEREDIA ZORRILLA PEDRO.
Año: 2002.
Universidad: PAIS VASCO.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: Se ha estudiado la función y estructura de la proteína PsbO del fotosistema II (PSII). El estudio funcional se ha realizado mediante producción de oxígeno e inducción de fluorescencia de membranas enriquecidas en PSII en presencia o ausencia de PsbO. Los resultados indican que esta proteína es clave para el correcto funcionamiento del PSII y que su ausencia favorece la inhibición de la función del PSII. El estudio estructural se ha llevado a cabo mediante técnicas bioinformáticas elaborando alineamientos múltiples de secuencia, predicciones de estructura secundaria y modelado remoto. Mediante "threading" se ha construido un modelo 3D de la proteína basado en estructuras 3D conocidas de proteínas cristalizadas. El modelo predice que la proteína es de tipo sándwich-beta de tipo inmunoglobulina y que posee dos dominios. Además, los datos obtenidos mediante la aplicación de técnicas como la fluorescencia de proteínas y FTIR apoyan este modelo. Con estas técnicas se ha cuantificado el porcentaje de estructura secundaria con un resultado mayoritario de hoja-beta (35-40%). Además, mediante FTIR se han podido observar cambios conformacionales en la proteína tras la privación de ión calcio del medio.

Autor: GIL ORTIZ FERNANDO.
Año: 2002.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA .

Resumen: Esta tesis versa sobre el enzima N-Acetil-L-Glutamano quinasa (NAGK), no regulado por asquina, de Escherichia coli. Este enzima, miembro de la familia aminoácido quinasa, cataliza la transferencia del fosfato gamma del ATP al acetilglutomato en el segundo paso de la síntesis de argimina. En el desarrollo de esta tesis doctoral hemos determinado por medio de cristalografía de rayos x la estructura tridimensional de este enzima a una resolución de 1.5 A, que ha revelado que se trata de un homodímero, con subunidades de 258 aminoácidos, nucleado por una hoja beta molecular abierta de 16 elementos, rodeada por alfa hélices. Además, hemos caracterizado los sitios de unión para los dos sustratos, hemos concluido que la catálisis se lleva a cabo a través de un mecanismo de tipo asociativo y hemos definido por medio de varios complejos cristalinos el curso de fosfórido durante la reacción. También se describe la unión superficial de una segunda molécula de nucleótido y se avanza hacía el conocimiento de la regulación por retroalimentación de la fosforilación de acetilglutamato mediante la cristalización de la NAGK regulada por argimina de pseudomonas aeruginosa.

Autor: JIMÉNEZ GARRIDO BEATRIZ.
Año: 2002.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: QUÍMICA.
Centro de realización: FACULTAD DE QUÍMICA (UNIVERSITAT DE VALENCIA).

Resumen: La presente tesis muestra la potencialidad de la Resonancia Magnética Nuclear (RMN) aplicada a sistemas paramagnéticos a la hora de determinar propiedades estructurales, moleculares y dinámicas de los sistemas de estudio. La RMN pramagnética era tradicionalmente evitada por la pérdida de información en las proximidades del entorno metálico. En esta Tesi sse demuestra, sin embargo, que el paramagnetismo en RMN proporciona datos estructurales (derivados de las velocidades de relajación, de los desplazamientos de pseudocontacto y de los acoplamientos dipolares residuales) que compensan y superan la pérdida de información por relajación. Los sistemas de estudio han sido la proteína azul de cobre (BCP) rusticianina (Rc) y la proteína activadora de calcio calbindina D9k (Cb). Rc es la BCP con el mayor potencial redoz (680 mV), siendo, asimismo, muy estable a valores de pH extremadamente ácidos. Hemos caracterizado la interacción del metal con sus ligandos mediante estudios de RMN paramagnética tanto del sistema nativo, Cu(II), como del derviado de cobalto(II). La estructura electrónica del ion cobre viene determinada por la interacción de éste con los ligandos histidina, mientras que la interacción del cobre con los ligandos cisteína y metionina es debido al plegamiento global y en las proximidades del entorno metálico de la proteína. La interacción Cu-SgammaCys es tanto más fuerte cuanto más cerca está el ion metálico del plano NHisNHisSCys formado por los átomos dadores de los ligando ecuatoriales. El estudio de mutantes de Rc en la metionina axial revela que aquellos aminoácidos que proporcionan al cobre una geometría más tetraédrica (mutantes de glutamina, glutamato y cisteína) desplazan al cobre de ese plano y disminuyen la velocidad de autotransferencia electrónica. Mutantes en esta metionina que obligan al cobre a permanecer en dicho plano (leucina) favorecen la velocidad de transferencia electrónica. Por otra parte, hemos constatado en la presente Tesis que el elevado potencial redox de Rc es consecuencia del alto entorno hidrofóbico que rodea al metal. Así mismko, hemos estudiado las características dinámicas y de hidratación de esta proteían mediante RMN heteronuclear 1H- 15N. Rc es la más rígida e hidrofóbica entre las BCPs. Estas dos singularidades están relacionadas con su gran estabilidad a bajo pH. El otro sistema con el que hemos trabajado, la proteína Cb, nos ha servido como modelo para determinar la relevancia de las restricciones paramagnéticas en el cálculo de estructuras de proteínas en disolución. El empleo adecuado de estas restricciones nos ha permitido obtener una estructura con una muy buen resolución (la desviación estándar de la familia de estructuras obtenidas era 0.25A). También hemos realizado estudios de desplegamiento de la proteína en presencia de agente desnaturalizante. En ese este estado incipiente desnaturalizado, el núcleo hidrofóbico de Cb presenta un empaquetamiento muy compacto, conservando completamente su estructura terciaria. Éste es uno de los factores que influyen en la gran estabilidad de la proteína. Hemos puesto de manifiesto que los iones metálicos son esenciales en la estabilidad estructural de la calbindina D9k. De hecho, hemos relacionado la mayor movilidad de los lazos en ausencia de iones metálicos con pequeños cambios estructurales y con la rotura de interacciones terciarias fundamentales. Estos cambios pueden ser la causa de la disminución drástica de la estabilidad de apo-Cb con respecto a la calbindina metalada.

Autor: DOMÍNGUEZ SOLÍS JOSÉ RAMÓN.
Año: 2002.
Universidad: SEVILLA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA .
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE SEVILLA.

Resumen: En este trabajo de Tesis Doctoral hemos profundizado en diferentes aspectos de la regulación de las enzimas O-Acetilserina(tiol)liasa y Serina acetiltransferasa en A.thaliana, a fin de conocer mejor la ruta de asimilación de azufre en dicho organismo. Además hemos realizado un estudio del papel que desempeña la isoforma citosólica de la enzima O-Acetilserina(tiol)liasa en la respuesta de las plantas a condiciones de estreses medioambientales como metales pesados y ambientes ricos en azufre atmosférico. Los resultados más relevantes obtenidos han sido: 1,- Tratamientos con metales pesados o metaloides, como cadmio y arsenito, inducen la expresión de los genes y actividades enzimáticas SAT y OASTL en A.thaliana. 2,- A concentraciones elevadas de cadmio y arsenito se observa una disminución en los niveles de cisteína y glutatión como consecuencia de la síntesis de fitoquelatinas inducida, en Arabidopsis, en respuesta al estrés. 3,- La sobreexpresión del gen Atcys-3A, que codifica la isoforma citosólica de la OASTL de A.thaliana, permite la obtención de plantas transformadas con niveles superiores de actividad OASTL de hasta 7 veces. Mediante silenciamiento génico, es posible obtener líneas con menores niveles de transcrito y actividad OASTL. 4,- El incremento de actividad OASTL en el citoplasma de las líneas transformadas se correlaciona con una mayor tolerancia de la planta a cadmio, arsénico y mercurio, y a su acumulación en las partes aéreas de la planta. 5,- La disponibilidad de cisteína en el citoplasma es una etapa limitante en la síntesis de glutatión, y pro tanto de fitoquelatinas, y es esencial en la tolerancia de las plantas de A.thaliana a medios contaminados con cadmio. 6,- Los tricomas son el principal punto de acumulación de cadmio en las partes áreas de A.thaliana, siendo 10 veces superior que en la células de la epidermis. La sobreexpresión del gen Atcys-3A incrementa, a su vez, los niveles de acumulación de cadmino en los tricomas hasta 3,5 veces. 7,- La sobreexpresión del gen Atcys-3a produce plantas tolerantes y acumuladoras de cadmio, arsénico y mercurio, presentes en medios conteniendo uno o varios de estos elementos y por tanto con aplicaciones en fitorremediación. 8,- Líneas transformadas de A.thaliana sobrexpresando el gen Atcys-3A son más resistentes a la fumigaicón con H2S debido al incremento en la actividad OASTL en hoja. Estas plantas son capaces de duplicar el contenido de S-orgánico.

Autor: LLORIÁN SOPEÑA MIRIAM .
Año: 2002.
Universidad: CANTABRIA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: Este trabajo describe la interacción entre la proteína SNP70/NpwBP, una proteína previamente descrita por su interacción con Npw38/PQBP-1, y proteina fosfatasa de tipo 1 (PP1). El trabajo se centra en la caracterización de los motivos responsables de su interacción entre ambas proteína, encontrando dos regiones responsables de la misma. Así mismo también se prueba que la interacción entre las dos proteínas parece ejercer cierto efecto inhibitorio con respecto a la actividad foasfatasa presente. En la segunda parte del trabajo se estudia la localización subcelular de SNP70, así como las regiones responsables de su presencia en determinados comportamientos subcelulares encontrando que tanto su extremo amino terminal, como el dominio carboxi terminal son las regiones que determinan su patrón de expresión característico dentro de las células. Por último, este trabajo se centra en el estudio de la posible participación de SNP70/NpwBP en reacciones de maduración de RNA, encontrando que esta proteína forma parte constitutiva de los espliceosomas durante la reacción de splicing, que se encuentra fosforilada durante la misma y que la adición del dominio central de la proteína a reacciones de splicing in vitro, inhibe splicing por un mecanismo que es independiente de su capacidad para interaccionar con PP1. Más aún dicho mecanismo, parece ser debido a un secuestro de factores necesarios para que se lleva a cabo la reacción y no por que la adición de dicho dominio a la reacción provoque un desplazamiento de la proteína endógena.

Autor: BARRIUSO MAGDALENO M. BEGOÑA.
Año: 2002.
Universidad: VALLADOLID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: Esta tesis describe la producción de compuestos antitumorales empleando proteínas inactivadoras de ribosomas (RIPs), unas enzimas vegetales que inhiben la biosíntesis proteica. Los nuevos agentes terapéuticos se han diseñado para destruir la neovasculatura tumoral- y de este modo, provocar el colpaso del tumor- sin dañar a los tejidos sanos. Para ello, los compuestos se han enviado hacia dos antígenos específicos de las células endoteliales de los vasos tumorales: la endoglina humana y la sintegrinas del tipo alfav. En primer lugar, se han producido en Escherichia coli dos RIPs recombinantes, las musarminas 1 y 4. Su purificación cromatográfica ha permitido recuperar proteínas homogéneas, que mantienen la actividad de sus homólogas nativas. Las dos proteínas anteriores, junto con otras RIPs monoméricas (saporina S6 y momordina I nativas), se han utilizado en la construcción d einmunotoxinas, compuestos formados por la unión química de una RIP y un anticuerpo, que se une selectivamente a una determinada molécula blanco. De los conjugados producidos, 4 se dirigen a la endoglina humana, mientras que el resto reconoce un anticuerpo monoclonal que, a su vez, se fija a la endoglina humana. Las inmunotoxinas generadas han resultado muy eficaces in vitro, ya que en un intervalo amplio de concentraciones eliminan células con endoglina sin afectar a las demás células. Además, entre los nuevos preparados se han obtenido, por primera vez, conjugados anti-endoglina en los que intervienen dos RIPs recombinantes (musarminas 1 y 4), que son potencialmente menos inmunogénicos y tóxicos que los que contienen RIPs nativas. Asimismo, se ha creado una proteína de fusión tóxica formada por la Mu1 y un péptido de adhesión a integrinas alfav. Este compuesto conserva esencialmente la actividad catalítica de la RIP aislada, y provoca una ligera inhibición en el desarrollo de tumores en ratones.