PROTEINAS, 5

Autor: ARNAN ROS CARME.
Año: 2002.
Universidad: POLITECNICA DE CATALUÑA.
Centro de lectura: INGENIEROS INDUSTRIALES.

Resumen: La nucleoplasmina (NP) es la proteína mayoritaria del núcleo de los oocitos y huevos de la rana Xenopus laevis y otros anfibios. Presenta tres tramos acídicos denominados A1, A2 y A3. Esta proteína participa en la remodelación de la cromatina durante la fecundación, mediatizando la descondensación de la cromatina espermática y facilitando el ensamblaje de nucleosomas. En este trabajo se ha continuado el estudio de distintas formas recombinantes de la NP (r-NP, r-NP142 y r-NP121). Interesaba determinar la influencia de distintas condiciones en la estabilidad y la pentamerización de la molécula. En esta misma línea se estudió el papel de las Cys en la pentamerización. Mediante mutagénesis dirigida se substituyeron las Cys por Ser y se observó que la mutación C45S favorecía la monomerización de la forma r-NP142, pero no afectaba en la oligomerización de r-NP ni r-NP121. Estos resultados indican que no hay puentes disulfuro en la estructura pentamérica de la NP. Los estudios para determinar la estructura secundaria mediante dicroísmo circular pusieron de manifiesto que el mutante r-NP142 C45S tenía una estructura plegada al azar y no se mostraba funcional en la descondensación de la cromatina espermática de Dicentrarchus labrax. Otras técnicas utilizadas fueron al microscopía electrónica y las técnicas cristalográficas. Otro objetivo de este trabajo fue la caracterización de las interacciones de la NP con las histonas del núcleo del nucleosoma. Mediante ultracentrifugación analítica y gradientes de sacarosa se pudo determinar que la NP podía unir los cuatro tipos de histonas nucleosómicas con una estequiometría correspondiente a 1 mol de pentámero de nucleoplasmida por mol de octámero de histonas nucleosómicas. La NP también es capaz de unir histonas tripsinizadas (sin las colas básicas) manteniendo la misma estequiometría. También la forma r-NP121 (sin el tramo acídico principal A2) es capaz de unir histonas nativas con la misma estequiometría que para los casos anteriores. Estos experimentos indican que la interacción no sería predominantemente electrostática. Otra línea de trabajo fue estudiar la presencia de una NP-like en los oocitos de la estrella de mar Echinaster sepositus. Se ha encontrado una proteína mayoritaria termoestable, acídica y parcialmente resistente al sulfato amónico. Esta proteína es reconocida por anticuerpos policlonales antinucleoplasmina obtenidos en huevos de gallina pero no es capaz de descondensar núcleos espermáticos que contienen protamina. El último objetivo del trabajo fue el estudio estructural de la proteína de Holothuria tubulosa, la cual presenta propiedades intermedia entre la sprotaminas y las histonas. La cristalización de una molécula de estas características aportaría información sobre la estructura de proteínas que empaquetan la cromatina y podría abrir un nuevo cambino para la cristalización de protaminas y complejos NP-protamina.

Autor: FERNÁNDEZ RUIZ VERÓNICA.
Año: 2002.
Universidad: NAVARRA.
Centro de lectura: CIENCIAS .
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE NAVARRA.

Resumen: El objetivo de este trabajo es determinar el efecto del óxido nítrico (NO) en la diferenciación de monocitos a células dendríticas y en su posterior maduración. Los monocitos humanos CD14+ CD1a- CD80- CD40- CD86+ HLA-DR+, aislados de voluntarios sanos, se diferenciaron con GM-CSF e IL-4 a células dendríticas CD14- CD1a+ CD80+ CD40+ CD86+ HLA-DR+. La adición de distintos donadores de NO al comienzo de la diferenciación produjo un incremento selectivo de la subpoblación de células dendríticas CD80+ CD1a+ HLA-DR+. Las actividades arginasa II y sintasa inducible de óxido nítrico (iNOS) se detectaron en los monocitos y en las células dendríticas. Los donadores SIN-1 y DETA-NO aumentaron significativamente la actividad iNOS respecto a las células dendríticas control, aunque no se observaron cambios ni en la actividad arginasa ni en la expresión de arginasa II. Los peroxinitritos mostraron un efecto tóxico superior al óxido nítrico y esta toxicidad resultó mayor en la diferenciación de monocitos que en la maduración de las células dendríticas. La adición de L-NMMA el primer día de la diferenciación incrementó la actividad NOS en las células dendríticas. El NO produjo una intensa nitración de proteínas; se detectó una banda de 90 kDa que aparece en células dendríticas y no en monocitos. Además, todas las células CD1a+ y CD83+ mostraron una homogénea e intensa nitración de proteínas. La maduración con GM-CSF y TNF-alfa produjo la aparición de dos subpoblaciones; HLA-DR++ CD83+ y HLA-DR+ CD83-, La estimulación con LPS e IFN-gamma produjo una población homogénea HLA-DR++ CD83+. Las actividades arginasa e iNOS se detectaron en las células dendríticas maduras. La adición de DETA-NO en la maduración produjo un incremento significativo de la actividad iNOS, lo que podría estar relacionado con una mayor expresión del CD83 en estas células. Los resultados sugieren una relación entre el fenotipo, la producción de NO y la apoptosis en las células dendríticas.

Autor: MALUMBRES EQUÍSOAIN RAQUEL.
Año: 2002.
Universidad: NAVARRA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE NAVARRA.

Resumen: INTRODUCCIÓN El propósito de este trabajo es el estudio de la transcripción alternativa hepática del gen de AE2 (SLC4A2), miembro de la familia de intercambiadores de aniones indpendientes de sodio. Este gen se transcribe en la mayor parte de los tejidos desde el promotor 5', dando lugar a la isoforma AE2a. Por otro lado, dentro del intrón 2 existen dos promotores alternativos solapantes que dirigen la expresión de dos variantes N-terminales más cortas, AE2b1 y AE2b2, de un modo específico de tejido, fundamentalmente en hígado y riñón. MÉTODOS La actividad promotora se evaluó por medio de ensayos duales de luciferasa en células transfectadas transitoriamente (líneas celulares HepG2, derivada de hepatoma, y PC-3, derivada de cáncer de próstata). Los fragmentos de las regiones promotoras se obtuvieron mediante PCR con la DNA polimerasa Pfu y se introdujeron en el vector de luciferasa pGL3-basic. Las sondas para los ensayos de retraso de banda y supershift se marcaron con digoxigenina y se detectaron mediante revelado no isotópico. RESULTADOS Un fragmento de DNA de 0,3 kb que incluye el promotor proximal y los sitios de inicio de la transcripción de la isoforma AE2b2, resultó especialmente activo en los ensayos de luciferasa en células HepG2. Entre otros posibles motivos de unión de factores de transcripción, la mayoría para factores de transcripción abundantes en hígado, esta región contiene una variante de 1 pb de la secuencia de 15 pb del elementos consenso HNF1 (Hepatocyte Nuclear Factor 1). Una mutación de 6 pb en este elemento consenso produce un descenso muy acusado en la actividad promotora en células HepG2, mientras que no tiene efecto en células PC-3. Mediante ensayos de retraso de banda y supershift se observa que el factor de transcripción HNF1alfa es capaz de unirse a nuestro elemento HNF1. Además, la actividad transcripcional del construido no mutado en células PC-3 se potencia tras la cotransfección con el plásmido de expresión de HNF1alfa, mientras que la actividad del construido mutado no se ve afectada en las mismas condicones. Todos estos datos apoyan que el factor de transcripción abundante en hígado HNF1alfa es capaz de estimular la transcripción alternativa de AE2 por medio del elemento HNF1 localizado en los promotores solapantes AE2b1/AE2b2 dentro del intrón 2. Se llevaron a cabo otros estudios sobre la funcionalidad de un posible elemento silenciador y un elemento MED-1 consenso. Ambos están implicados en la actividad transcripcional de los promotores alternativos según el efecto de su mutación en los ensayos de luciferasa.

Autor: RAMON MAIQUES SANTIAGO.
Año: 2001.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR.

Resumen: La arqueobacterias Pyrococcus furiosus y Pyrococcus abyssi viven a 100ºC y sintetizan, en el primer paso de la biosintesis de arginina y pirimidinas, un compuesto altamente termolabil, el carbamil fosfato (CP). Recientemente se ha publicado la existencia de un carbamil fosfato sintetasa (CPS) atipica a estos arqueones. Mientras que las CPSs tipicas consisten en un polipetido de 120 kDa que esta fusionado o asociado a otro polipeptido de 40 kDa, esta CPS atipica es un homodimero que muestra una gran similitud de tamaño y secuencia con las carbamato quinasas (CKs). Las CKs sintetizan reversiblemente CP a partir de ATP y carbamato, pero su funcion hasta ahora descrita "in vivo" es la de sintetizar ATP a partir de ADP y del CP derivado del catabolismo de la arginina. En cambio, las CPSs sintetizan irreversiblemente CP a partir de amonio, bicarbonato y dos moleculas de ATP, en una reaccion en tres pasos, cuyo ultimo paso se corresponde con la reaccion catalizada por la CK. Se ha determinado en nuestro laboratorio la estructura tridimensional de una CK tipica, demostrando que no se parece a la estructura de la CPS, y que no es adecuada para calizar la reaccion en tres pasos, con canalizacion intramolecular de intermediarios de la CPS. En la presente Tesis se describe el clonado del gen que codifica para la CPS atipica de Pyrococcus furiosus, asi como la hiperexpresion, purificacion y cristalizacion del enzima recombinante. Tras realizar estudios de difraccion de rayos-X se ha determinado la estructura tridimensional del enzima unido a una molecula de MgATP a una resolucion del 1.5 A. En este trabajo se describe en detalle la estructura del enzima, se caracteriza su centro activo, y se proponen las bases del mecanismo catalitico. Por otro lado, el gran parecido que la estructura de la CPS atipica de Pyrococcus furiosus presentaba con la de la CK de Enterococcus faecalis determinada previamente en nuestro laboratorio nos obligo a poner en duda los resultados publicados por otros grupos que catalogaban al enzima de P.furiosus como una CPS. Los ensayos enzimaticos realizados demuestran sin lugar a dudas que el enzima es un CK y no una CPS. Ademas se ha podido caracterizar los distintos pasos de la reaccion catalizada por este enzima, lo que nos ha ayudado en el entendimiento de porque los enzimas termofilicos son lentos a bajas temperaturas.

Autor: MOLINA HEREDIA FERNANDO PUBLIO.
Año: 2001.
Universidad: SEVILLA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE SEVILLA.

Resumen: Una de las lineas de investigacion mas intereses de la bioquimica contemporanea es el estudio de la relacion entre la estructura y la funcion de las macromoleculas biologicas, o reconocimiento molecular. Como sistema objeto de este estudio, se ha escogido el citocromo c6(Cit)y la plastocianina (Pc), dos proteinas con estructuras diferentes pero con identica funcion, cual es transportar electrones entre los complejos de membrana citocromo b6-f y fotosistema I(PSI). La conexión entre ambos complejos la realiza una metaloproteina soluble, que puede ser la Pc en plantas o el Cit en cianobacterias, aunque existen algas verdes (Eucarioticas) y otras cianobacterias capaces de sintetizar tanto Pc como Cit. La siguiente pregunta se plantea de inmediato: ¿Porque el Cit se ha visto desplazado por la Pc durante el curso evolutivo? Cit y Pc consituyen un excelente ejemplo para el estudio de la evolucion biologica a nivel molecular.Ambas proteinas poseen propiedades bioquimicas similares, y exhiben un mecanismo de reaccion con el PSI distinto de un organismo a otro pero similar dentro de un mismo organismo. En este proyecto se han clonado, mutado y expresado en la enterobacteria Excherichia coli los genes que codifican la Pc(p e tE) y el Cit(petJ) de la cianobacteria Anabaena sp. PC 7119. Posteriormente, se ha realizado un estudio estructural y funcional comparado de todas las proteinas recombinantes. Los resultados obtenidos son los siguientes: 1. Se han clonado, secuenciado y expresado correctamente en Escherichia coli los genes petJ y petE de la cianobacteria Anabaena sp PCC 7119. 2. Se ha diseñado un metodo de superproduccion del citocromo c6,cuyo rendimiento ha permitido realizar estudios funcionales y estructurales, asi como marcar homogeneamente con 15 N la hemoproteina. 3. El citocromo c6 de Anabaena sp. PCC 7119 posee dos zonas mediante las cuales interacciona con el PSI. La primera es un "area con carga neta positiva", responsable de las interacciones electrostaticas a larga distancia y de la formacion de un complejo electrostatico transitorio con el PSI. La segunda es una "superficie hidrofoba" alrededor del area en la que el grupo hemo es accesible al solvente, responsable de la formacion de una interfase de contacto con el PSI que permite que los electrones pasen desde el atomo de hierro del grupo hemo hasta el dimero de corofilas P700+. 4. La plastocianina de Anabaena sp. PCC 7119 posee una "cara hidrofoba", cuya funcion es crucial para la transferencia de electrones, similar a la de otras plastocianinas. Ademas, la plastocianina de Anabaena presenta una "cara positiva", responsable de la interaccion electrostatica con el PSI, cuya funcion es equivalente a la de la "cara negativa" de las plastociainas de otros organismos. 5. Las "areas hidrofobas y positivas" del citocromo c6 y de la plastocianina son funcionalmente equivalente. Cada metaloproteina posee un unico residuo de arginina, absolutamente conservado en cianobacterias, que es crucial para la reduccion eficiente del fotosistema I. 6. El citocromo c6 y la plastocianina interaccionan con el citocromo f y con el PS utilizando las mismas regiones.

Autor: ABSI EL HADI.
Año: 2001.
Universidad: SEVILLA.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD FARMACIA UNIV. SEVILLA .

Resumen: Nuestro objetivo en esta tesis fue el estudio de las alteraciones de algunas de las funciones importantes del metabolismo celular inducidas por agentes oxidantes, neurotoxicos y durante el envejecimiento y el posible papel protector de compuestos antioxidantes y neuroprotectores para prevenirlas. Las moleculas relevantes de estas funciones estudiadas son: el complejo I de la cadena respiratoria y el FE-2 de la maquinaria de la traduccion. En una primera parte, de esta tesis hemos estudiado el efecto inhibidor del MPP+ sobre la velocidad maxima de la respiracion en mitocondrias hepaticas aisladas y sinaptosomas estriatales y en diferentes centros cerebrales centrandonos en el estudio de la actividad del complejo I de la cadena respiratoria. Por otro parte se ha sugerido que la accion toxica del MPTP esta mediada por especies reactivas de oxigeno, de hecho, hemos determinado los parametros de estrés oxidativo en diferentes biomoleculas mitocondriales -lipidos y proteinas-in vitro e in vivo. A continuacion, debido al descubrimiento del efecto protector del 1-MeTIQ contra el efecto toxico del MPP+, hemos estudiado su capacidad antioxidante y la actividad de la enzima que lo sintetiza en distintas areas de cerebro de ratas jovenes y viejas y sus niveles en suero de enfermos de Parkinson. En una segunda parte, se ha examinado la alteracion de la maquinaria de sintesis de proteinas analizando el estado molecular de FE-2 en homogeneizado y en cortes tisulares hepaticos y cerebrales sometidos a estrés oxidativo inducido por varios agentes oxidantes (HC,AAPH, y H2O2) y durante el envejecimiento. En ambos casos, se ha estdiado tambien la accion protectora de la melatonina como agente antioxidante. Despues nos hemos interesados a estudiar el posible mecanismo responsable de la alteracion que sufre el FE-2 utilizando inhibidores de proteasas y determinando los parametros de estrés oxidativo en diferentes biomoleculas (lipidos y proteinas) in vivo e in vitro. Por ultimo, para poder establecer un marcador biológico para diagnosticar la EP de manera precoz, hemos estudiado los parametros de estrés oxidativo, la capacidad antioxidante y los niveles de TIQ y 1-MeTIQ en sueros de los pacientes enfermos y sus correspondientes parejas sanas.

Autor: CÓZAR CASTELLANO IRENE.
Año: 2001.
Universidad: LA LAGUNA.
Centro de lectura: MEDICINA .
Centro de realización: DPTO. BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR.

Resumen: Partiendo de sueros de enfermos de la enfermedad autoinmune conocida Síndrome de Sjögren, y con un sistema de muestreo de una genoteca de expresión de cerebro humano, se han identificado antígenos relacionados con dicha patología. Se han identificado tres grupos de macromoléculas: conocidas y caracterizadas como antigénicas, conocidas y no caracterizadas como antigénicas y una proteína desconocida, producto del gen hHesB. Se ha caractrizado el gen hHesB, que se expresa de manera ubicua en todos los tejidos humanos y cuyo mRNA es de 2,8 kb. Está regulado por un promotor no convencional, con una zona de unión a Sp1, pero que no posee cajas TATA convencionales.el gen está localziado en el cromosoma 9 humano y posee pseudogenes maduros en los cromosomas 2,5,15,17 y 19. Buscando un modelo para posteriores estudios, se estudio el homólogo del gen en la rata. El gen en la rata tiene un mRNA del mismo tamaño que el humano y cuya expresión también es ubicua, la homología entre la secuencia de la proteína de rata y la humana es de 97%, por lo que es un buen modelo para estudios fisiológicos y patofisiológicos posteriores. La proteína codificada por el gen hHesB es de 15,5 kb, es soluble y se localiza en la mitocondria.Tiene un dominio estructural denominado HESB que posee dos cisteínas conservadas que son necesarias para la función de la proteína,que está relacionada con la formación de los complejos Fe/S. Se ha estudiado la función de la proteína mediante un modelo en levadura (S. Cerevisiae) complementando la función de la proteína homóloga mutada en esta especie con el gen heterólogo humano, aunque hay indicios suficientes de que ambas proteínas realizan la misma función, no se observó complementación funcional. Esta tesis es una aportación al estudio de las muchas proteínas humanas de las que aún se desconoce su estructura y su función, así como a el establecimiento de la localización, limitación y estudio de los genes que recientemente han visto liberadas sus secuencias con el Proyecto Genoma Humano.

Autor: AGIUS GUADALUPE MARIA.
Año: 2001.
Universidad: MALAGA.
Centro de lectura: CIENCIAS .
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: El objetivo de esta tesis doctoral es la caracterización molecular y bioquímica del gen FaALKE aislado del escrutinio de una librería sustractiva de fruto rojo contra fruto verde de Fragaria x ananassa. La proteína tiene similitud con la familia de proteínas oxido reductasas dependiente de NADPH, que catalizan la oxidación de una amplia gama de sustratos como aldehidos, monosacáridos y gluconatos. Estudios de expresión han demostrado que este gen es un gen específico de fruto y que su expresión aumenta durante el proceso de maduración. A su vez,la clonación caracterización del promotor de este gen demuestra que confiere especificidad y regulación en fruto y que solo 400 pb corriente arriba del ATG son suficientes para conferir actividad promotora. Estudios de funcionalidad de la proteína FaALKE en plantas transgénicas de Arabidposis que sobreexpreesan el gen FaALKE, demostraron que la proteína FaALKE está implicada en la biosíntesis de vitamina C en frutos de fresa, que emplea como precursos al ácido D-galacturónico.

Autor: GARCÍA RANEA JUAN ANTONIO.
Año: 2001.
Universidad: MALAGA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGIA.

Resumen: La aplicación de metodologías y herramientas bioinformáticas, aplicadas sobre bases de datos de naturaleza biológica y molecular, ha permitido estudiar algunas características molelculares y funcionales a nivel de genomas eucariotas, así como, en el campo de la interaccion entre proteínas ras con sus efectores. En este trabajo se ha abordado el estudio de la superfamilia de proteínas ras desde distintos niveles organizativos. En primer lugar, se ha estudiado las características estructurales y funcionales del sistema de genes ras en la levadura Sacharomyces cerevisiae. Asi mismo, la disponibilidad del genoma completo de otros organismos eucariotas ha permitido comparar el número y distribución de los genes ras entre distintas especies eucariotas, entre las que se encuentran c. Elegans, D. Melanogaster, y Homo sapiens. En segundo lugar, y mediante el uso del análisis de treedeterminantes y de experimentos de docking simulados por ordenador, se abordo el estudio de la informacion a nivel de secuencia aminoacidica de todas las secuencias las presentes en las bases de datos. Como resultado de dichos estudios fue posible predecir modelos de interacción entre la proteínas Ran y Rcc1, así como, inferir aquellos residuos funcionales implicados en la determinación de la especificidad de interacción entre las proteínas Ras y Ral con sus efectores.

Autor: GARCIA MIRA M. MAR.
Año: 2001.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: Las proteinas son capaces de llevar a cabo tareas moleculares con gran velocidad y especificidad, lo que, a priori, deberia hacerlas muy utiles en un amplio abanico de aplicaciones industriales y tecnologicas. El factor fundamental que limita en muchos casos las aplicaciones tecnologicas de las proteinas es su baja estabilidad lo que ha hecho de la estabilizacion de las proteinas un objetivo muy importante en el campo de la biotecnologia. Una de las estrategias que la naturaleza utiliza para estabilizar proteinas es la optimizacion de la distribucion de cargas. Nosostros creemos que podemos emular a la naturaleza y obtener proteinas mutantes de alta estabilidad mediante el diseño racional de la distribucion superficial de cargas pero el trabajo en esta direccion exige que se aborden determinados objetivos concretos algunos de los cuales se han explorado en este trabajo: 1)Mejora de los procedimientos computacionales de prediccion. En esta tesis doctoral exploramos la posibilidad de utilizar los valores de pk determinados experimentalmente mediante resonancia magnetica nuclear para introducir en nuestros procedimientos teoricos de predicion el efecto del ambiente y de las interacciones especificas. 2)Caracterizacion de las interacciones electrostaticas en los estados desnaturalizados. Con referencia a este objetivo concreto iniciamos en esta Tesis doctoral el estudio experimental de dos sistemas que creemos pueden proporcionar informacion. A)Estudio de los fragmentos procedentes de la escision proteolitica de la tiorredoxina oxidada de E.Coli, el complejo que resulta de su asociacion y la proteina intacta. B)Estudio del desplegamiento termico del dominio de union E3 del nucleo de dihidrolipoamida succinil transferasa del complejo 2-oxoglutarato deshidrogenasa de E.Coli. 3)Caracterizacion del efecto que tienen sobre la estabilidad las interacciones electrostaticas en estados intermedos en el proceso de desnaturalizacion inducida por la temperatura. En relacion con este objetivo concreto, hemos estudiado la estabilidad de la forma silvestre y varios mutantes de inversion de carga de apoflavodoxina de Anabaena. Esta proteina presenta un intermedio de tipo "globulo fundido" que puede limitar el efecto estabilizador de las mutaciones de inversion de carga. 4)hemos determinado los factores de correccion para la medida del pH en mezclas agua-guanidina y hemos explorado la posibilidad de predecir teoricamente el efecto de la concentracion de guanidina sobre el numero de protones unidos a los estados nativo y desnaturalizado de las proteinas.

Autor: MERCADO VIANCO LUIS ALBERTO.
Año: 2001.
Universidad: SANTIAGO DE COMPOSTELA.
Centro de lectura: VETERINARIA.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA .FACULTAD DE VETERINARIA.

Resumen: Las proteinas quinasas a traves de la fosforilacion de sustratos regulan las respuestas fisiologicas celulares tanto a nivel citosolico como nuclear. Las diferentes isoformas de proteina quinasa C han sido caracterizadas en mamiferos y clasificadas en 3 grupos: las clasicas (cPKC) que son dependientes de DAG, Ca2+ y fosfatidil L-serina, las nueva (nPKC) que son dependientes de DAG y PL, e independientes de Ca2+, y las atipicas (aPKC) que solo son dependientes de PS. Las cPKC y las nPKC son sensibles a esteres de forbol, como el PMA, esta molecula se une a la quinasa en el mismo sitio que el dag, que es clave para su maxima actividad quinasa. En invertebrados la PKC ha sido muy poco estudiada y destacan los trabajos de Sossin y col(1991,1993) quienes han purificado Ap1 I y Ap1 II, la primera es una isoforma de molusco similar a las cPKCBI y BII y la segunda a la isoforma nPKCE, de mamiferos. En M.galloprovincialis Barcia y cols.(1997) describieron la presencia de peptidos que eran reconocidos por anticuerpos contra las isoformas a,B y --- de mamiferos, ademas de actividad PKC sobre sustratos clasicos para esta quinasa. Con estos antecedentes y considerando la universalidad de la familia de las PKC en diferentes especies de ubicación filogeneticamente distante, se planteo como hipotesis la existencia de una isoforma de PKC en manto de mejillono que podria tener una amplia distribucion en sus diferentes tejidos y que ademas podria ser estudiada en hemocitos, como modelo biologico de la respuesta inmune en invertebrados. Mediante tres pasos cromatograficos sucesivos: columna de intercambio anionico (DE52), gel filtracion (S-200) y cromatografia de adsorcion en hidroxilapatito (HTP), se purifico un peptido simple de aproximadamente 105 kDa de peso molecular (p105), con actividad quinasa de tipo nPKC, es decir, dependiente de PMA y PS, que ademas tiene la capacidad de autofosforilacion sin mediar la estimulacion de cofactores lipidocos. Se demostro que su actividad quinasa no solo es independiente de Ca2+, sino que ademas el cation ejerce una inhibicion mixta sobre p105, con una ki de 0,6 mM y una Ki´de 2 mM, de lo que se deduce que inhibe preferentemente a p105 libre que asociada a sustrato. En cuanto a la cinetica enzimatica se determino que protamina sulfato fue el mejor sustrato con una Km aparente de 1,92 uM y una Vmax de 21,73 (mUI/ml). En comparacion con estudios realizados por Kazanietz y cols (1993) la alta fosforilacion sobre este sutrato, la pobre fosforilacion de histona de tipo IIIS y la actividad enzimatica sobre el peptido comercial VRKRTLRR, le asemejan a la isoforma nPKCE de mamiferos, cuyos anticuerpos tambien presentaron reaccion cruzada con p105 en ensayos de Western blotting (WB). Se demostro en autorradiogramas que p105 se autofosforila sin aumentar su activacion en presencia de cofactores como PS y PMA, por WB se comprobo que la autofosforilacion de la enzima es en residuos aminoacidicos de serina. Utilizando la tecnica descrita por Ceveini y cols(1991) se inmunizo ratones con p105 y se obtuvieron anticuerpos poloclonales especificos contra la enzima, desde tumores asciticos inducidos en la cavidad abdominal de los animales. El anticuerpo fue utilizado para caracterizar una doble banda de 105 y 108 kDa, caracteristica de la enzima cuando es revelada por WB de extracto crudo de manto, branquia, pie, musculo aductor posterior, hepatopancreas y hemocitos del mejillon. En estos tejidos y celulas la enzima esta asociada tanto a la fraccion citosolica como de membrana y la intensidad de las bandas en los WB se correlaciona con los niveles de actividad nPKC medidos en cada caso. Considerando que en celulas inmunitarias de mamiferos la presencia de PMA estimula la translocacion de isoformas de cPKC y nPKC a la membrana plasmatica, se probo incubar hemocitos con PMA, que habian sido previamente estabilizados en cultivos primarios. Los resultados visualizados en microscopia confocal, WB y midiendo la actividad nPKC de la fraccion citosolica y de membrana demostraron que PMA induce la translocacion de p105 a la membrana plasmatica, proceso que es regulado por down regulation, tanto en celulas de tipo RH como SH.

Autor: CASTILLO ALIAGA JOSEFA.
Año: 2001.
Universidad: VALENCIA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS-UNIVERSITAT DE VALENCIA.

Resumen: La eliminación de agua que sufren las semillas al final de su desarrollo esta relacionada con una condensacion de la cromatina. A pesar de importacia de este proceso, apenas se ha investigado en esa area y existe muy poca informacion acerca de los mecanismos moleculares implicados. En este sentido, proteinas asociadas a la cromatina, especificas del embrion y que desaparecen durante la germinacion, como es el caso de p16, podrian tener un papel en la proteccion de la estructura de la cromatina, preservandola de la perdida dramatica de agua. Por tanto, resultaba interesante el estudio en detalle de las caracteristicas de esta proteina y su posible funcion asociada a la cromatina. Para ello se ha aislado el cDNA que codifica p16. El gen se ha denominado psp54 y codifica n polipéptido mas largo de manera que p16 esta codificada por el tercio C-terminal del cDNA de psp54. Tanto p16 como su proteina precursora muestran similitud de secuencia con proteinas de reserva aunque a nivel fisiologico presenta marcadas diferencias, ya que su mRNA se almacena en la semilla seca y es capaz de inducirse en respuesta a estrés hidrico y tratamiento con ABA durante la germinacion. La proteina p16 se ha inmunoculizado en nucleos y se ha demostrado su interaccion con las histonas y el DNA in vitro. Por todo ello se ha propuesto que esta proteina podria estar implicada en el establecimiento, mantenimiento y/o proteccion de la estructura de la cromatina frente a la deshidratacion que sufren las semillas al final de la embriogenesis.

Autor: PLASENCIA GIL M. INES.
Año: 2001.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: FAC. DE C.C. BIOLOGICA (UCM).

Resumen: El surfactante pulmonar es un importante complejo lipoproteico que se localiza en la interfase aire-liquido de los alvéolos pulmonares. El componente lipidico mayoritario, la DPPC, es a su vez el principal responsable de la función tensoactiva que este sistema tiene en el pulmón para la que necesita tambien de la presencia de proteinas especificas denominadas, SP-A, SP-B, SP-C y SP-D. La SP-C es lipopétido de 35 residuos altamente hidrofóbico. Esta proteina se estructura como una a-helice hidrofobica muy estable tanto en disolventes orgánicos como en membranas y participa activamente en los procesos biofisicos que llevan a la reducción de la tensión superficial en el alveolo pulmonar. La SP-C posee un segmento N-terminal, polar, que contiene dos cisteínas esterificadas por sendas cadenas de ácido palmítico, cuya implicación en las propiedades de la SP-C no se conocen. Con el propósito de profundizar en el conocimeinto del papel de esta región de la proteina se han sintetizaron diversos péptidos diseñados a partir de la secuencia del segmento N-terminal de la SP-C en sus dos versiones, acilada y desacilada, con los que se han realizado estudios estructurales y de caracterización de la interacción lipido-proteina mediante la aplicación de diferentes tecnicas biofisicas. Los resultados obtenidos han llevado a proponer una modelo estructural para este segmento, cuya conformación cambia a consecuencia de la acilación. Las secuencias estudiadas tienen capacidad para interaccionar, perturbar e insertarse en entornos de membrana, capacidad que resulta modulada por la presencia de las cadenas de acilo. Las caracteristicas estructurales y funcionales de estos péptidos les convierte en potenciales moléculas con actividad antipatgénica, lo que resultó comprobarse en ensayos atibióticos frente a diversos tipos de bacterias y patogenos eucariotas como Lehismania. La acilación altera las propiedades microbioanas, dejando abierta la cuestión de una posible función de defensa para la SP-C en los espacios pulmonares.

Autor: MARTÍN MARTÍN BELÉN.
Año: 2001.
Universidad: VALLADOLID.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: El neutrófilo es una célula madura encargada de la defensa del organismo frente a la invasión de microorganismos patógenos. Para poder realizar esta función, en el neutrófilo debe de llevar a cabo la degranulación de forma secuencial, en respuesta a un estímulo inflamatorio, de los 4 típos distintos de gránulos que posee (vesículas secretoras, gránulos de gelatinasa, gránulos específicos y gránulos azurófilos). La maquinaria que regula esta jerarquía en la secreción de los gránulos corresponde, basándonos en los resultados obtenidos en este trabajo, a la hipótesis SNARE planteada para la secrección en otros sistemas celulares (células neuronales y no neuronales). Segñun esta hipótesis, la fusión entre membranas está mediada por la interacción entre proteínas, denominadas proteínas SNARE (sintaxinas, VAMPs y proteínas SNAP), que están asociadas a las membranas de los compartimentos que se van a fusionar. Los neutrófilos humanos maduros presentan varios componentes de estas proteínas SNARE, identificados mediante técnicas de RT-PCR, clonaje y secuenciación. Entre ellos se pude citar la expresión de sintaxina 1C, 3A, 3B, 4,5,6,7,9,11 y 16, VAMP 1,2,3,4,5,7 y 8. Asi como la presencia de sinaptotagmina V, mienbro de la familia de sinaptotagminas caracterizadas por se sensores de calcio en los procesos exocitóticos regulados. La secreción de los gránulos específicos (gránulos móviles) tras la activación del neutrófilo está regulada por interacciones entre proteínas SNARE. Una de estas interacciones se produce entre sintaxina 6 (asociada a la membrana plasmática) y SNAP-23 (asociada a la membrana de los gránulos específicos). Otra de las interacciones se establece entre sintaxina 4 (asociada a la membrana plasmática del neutrófilo) y VAMP-2 (asociada a la membrana de los gránulos específicos). Las proteínas SNARE asociadas a la membrana de los gránulos móviles están ausentes en los gránulos azurófilos (gránulos menos móviles), siendo esta, posiblemente, la causa del diferente orden de secrección que estos tienen tras la activación del neutrófilo. La secrección de los gránulos menos móviles (gránulos azurófilos) está regulada por la interacción entre sintaxina 6 y otras proteínas SNARE. Dado que una misma proteína (sintaxina 6) puede estar mediando la secreción de distintos tipos de gránulos (gránulos específicos y gránulos azurófilos) las interacciones establecidas entre las proteínas SNARE en el neutrófilo maduro son bastante promiscuas. Este estudio demuestra la presencia y el papel funcional de proteínas SNARE en el neutrófilo humano, y da una explicación molecular a la regulación de la secreción independiente de los diferentes gránulos citoplasmáticos del neutrófilo, basado tanto en la posible presencia de diferentes proteínas SNARE en las membranas de las distintas clases de gránulos citoplasmáticos como en posibles diferencias cuantitativas.

Autor: CORRALES ROCAFORT SUSANA.
Año: 2001.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: El proceso de plegamiento/desplegamiento es hoy en día uno de los temas más importantes sin resolver en química de proteínas. Dado que la constante dieléctrica del medio y la presencia de enlaces de hidrógeno juegan un papel fundamental, la caracterización del entorno en el que se encuentran estos es un factor determinante. Actualmente, la comprensión de los procesos de plegamiento y la descripción de los factores que intervienen en ellos se efectúa experimentalmente empleando agentes desnaturalizantes. La alfa-LA constituye un interesante modelo ya que presenta grandes cambios estructurales en función del pH, temperatura y en presencia de agentes desnaturalizantes, tipo urea e hidrocloruro de guanidina o tipo alcohol. La detección de tales cambios puede efectuarse empleando técnicas espectroscópicas, RMN, fluorescencia, DC y FTIR, lo que permtie seguir variaciones en estructura terciaria y/o secundaria. No obstante ninguna de las técnicas citadas permite seguir el proceso a tiempo real, por lo que para ello hemos considerado necesario trabajar además con técnicas de cinéticas rápidas ("Stopped-flow"). Confirmamos la formación de un estado intermedio entre las formas nativa y desnaturalizada, con estructura secundaria pero no terciaria, a todos los pH estudiados. Además, observamos un plegamiento complejo muy dependiente del pH. Al estudio de la desnaturalización de la alfa-LA bovina en presencia de urea, hidrocloruro de guanidina y disolventes tipo alcohol muestra que el proceso de plegamiento/desplegamiento depende de propiedades propias del disolvente, como la acidez, basicidad y polaridad/polarizabilidad. El uso del ANS en la presente tesis pone de manifiesto que el seguimiento del proceso de plegamiento/desplemagimiento debe efectuarse al menos en esta proteína con dos sondas distintas, ya que el ANS y los Trp monitorizan procesos distintos, presumiblemente zonas de la molécula diferentes.

Autor: GARRIDO PERTIERRA AMANDO.
Año: 2001.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA.

Resumen: La piruvato quinasa (ATP: piruvato 5- O- fosfotransferasa; EC 2.7.1.40) cataliza la transformación de fosfoenolpiruvato y ADP en piruvato y ATP. Esta enzima, que aparece en todas las células vivas, es clave en la ruta central del metabolismo de los carbohidratos. En la especie humana han sido caracterizados dos genes diferentes: el PK-M que principalmente, codifica las isozimas del tejido musucular y de los leucocitos y la PK-LR que codifica las isozimas del hígado y de los eritrocitos. La deficiencia en piruvato quinasa, debido a una mutación en el gen PK-LR, origina alteraciones, únicamente, en el metabolismo de los eritrocitos, porque estas células no son capaces de compensar el defecto enzimático aumentando la síntesis de enzima mutada ni utilizar otras rutas degradativas. Por ello, la deficiencia de esta enzima es causa principal de la anemia hemolítica no esferocítica; los síntomas clínicos de esta enfermedad abarcan desde un estado hemolítico compensado hasta una anemia grave que pude provocar incluso la muerte de los pacientes. Los métodos clásicos para estudiar las variantes con deficiencia piruvato quinasa han sido estandarizados por la Comisión Internacional de Estandarización en Hematología (ICSH). Sin embargo, la interpretación de los resultados bioquímicos de las enzimas deficientes en la actividad piruvato quinasa se ve dificultada por la alta frecuencia de heterocigotos que conducen a enzimas híbridas con diferentes propiedades moleculares. Además, debido a la baja actividad de la enzima en los eritrocitos de los pacientes, estos requieren constantemente sangre y la caracterización de la enzima deficiente se ve dificultada por las actividades de la enzima de los eritrocitos normales del donante y del producto del gen PK-M de los leucocitos. Estos problemas han llevado a estudiar la enzimopatía eritrocitaria piruvato quinasa mediante técnicas de Biología Molecular, utilizando fundamentalmente la amplificación del gen PK-R mediante la reacción en cadena de la polimerasa y la secuenciación nucleotídica del mismo. Los resultados, así obtenidos, han proporcionado un diagnóstico exacto de la enfermedad, marcan la pauta a seguir en el transcurso de la misma y facilitan la aplicación de una terapia adecuada. El trabajo se realizó sobre 10 pacientes, no relacionados familiarmente, con deficiencia en piruvato quinasa eritrocitaria y anemia hemolítica no esferocítica. No se ha podido establecer una correlación directa entre el nivel de actividad de la enzima y el grado de alteración clínica observada. Mediante el análisis molecular se han encontrado 11 mutaciones diferentes en los 17 alelos mutados; tres de estas mutaciones, G694A, A1150G y G1154A, no habían sido previamente descritas. Los estudios de modelización molecular han permitido observar notables modificaciones en la estructura local de la molécula, originadas por mutaciones que inducen desajsutes en el balance de las cargas eléctricas y/o impedimientos esféricos. Estas mutaciones se corresponden, asimismo, con disminución de la actividad piruvato quinasa, como demuestran los bajos niveles de esta actividad en pacientes portadores de dichas mutaciones.

Autor: BENITEZ ZUNZUNEGUI JORGE.
Año: 2001.
Universidad: VALLADOLID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: El objetivo de esta tesis es construir farmacos específicos para la terapia Experimental del Cáncer que no dañasen a las células sanas. Para ello se ha purificado en gran cantidad las RIPs de sa--- mediante una optimización del método clásico de obtención de -- b y ebulina l, y se han utilizado como transportadores selectivos el anticuerpo monoclonal 44G4 y la lectiva dimérica SELD, que se dirigen específicamente a las células endoteliales de la vasculatura tumoral y a las células de carcinomas que sobreexpresan -- de membrana (como el carcinoma de calor humano), respectivamente. Despúes de optimizar las condiciones de reacción de la construcción de los conjugados 44G4-niginab, 44G4-ebulina L y SELDo-nigina B, además de otros conjugados indirectos y con otras RIPs como la Nigina B básica, se han obtenido inmunotoxicas y lectitoxinas muy activas y tóxicas en sistemas acelulares y también sobre las células blanco que expresan al antígeno para el que están dirigidos, pero no han mostrado toxicidad en células no blanco ni en animales. Por tanto, estas moléculas pdorían ser utilizadas en la terpia del cáncer como fármacos que no dañan a células snas.

Autor: BERENGUER FROEHNER BETTIANA.
Año: 2001.
Universidad: SEVILLA.
Centro de lectura: FARMACIA .
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: En este trabajo se ha comparado el efecto de tres antiinflamatorios no esteroides de perfiles farmacológicos diferentes (metomizol, celecoxil y piroxicam), sobre varios modelos de úlcera aguda y úlcera crónica en ratas. En los modelos agudos hemos comprobado, que si bien celecoxil no provoca apenas daño sobre una mucosa gástrica sana, exacerba las lesiones gástricas preexistentes. Piroxicam causó daño en el modelo de administración única y también empeoró el estado de la mucosa previamente inflamada. Por el contrario metemizol reflejó un comportamiento muy benigno en todos los modelos agudos de las dosis mayores ensayadas. En el modelo de úlcera crónica, se observó un retraso muy importante en la curación de la lesión gástrica cuando se administró a los animales durante 15 días celecoxil 2 veces al día. Este retraso se podría explicar con la inhibición de la expresión de la cicloxigenasa 2 observada.

Autor: PACHECO GONZÁLEZ BEATRIZ.
Año: 2001.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: QUÍMICA .
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS, UCM.

Resumen: En la actualidad las hepatitis víricas causadas por los virus tipo B y C constituyen las principales causas de hepatitis aguda o crónica en el mundo. Según la OMS los virus de las hepatitis B y C (HBV y HCV) infectan a más de 350 y 170 millones de personas en todo el mundo, respectivamente. Los únicos tratamientos disponibles en la actualidad implican la utilización de interferón. Esto unido a la falta de una vacuna frente al HCV apunta a la necesidad de profundizar en el estudio de estas patologías. En el presente trabajo se aborda la expresión, purificación y caracterización estructural de las proteínas de la envoltura de estos virus. Con respecto al HBV, se ha llevado a cabo la expresión de la proteína M del HBsAg con una extensión de seis histidinas en su extremo amino terminal en la levadura Pichia pastoris; en cuanto al HCV, se han expresado diversas formas de las proteínas de la envoltura, E1 y E2, tanto en E.coli como en Pichia pastoris. Por otro lado, el análisis de la secuencia de aminoácidos de la proteína S del HBV ha permitido identificar una región contigua al péptido de fusión que contiene repeticiones de héptadas similares a las encontradas en proteínas virales fusogénicas de otros virus. Esta región se ha clonado y expresado en E.coli con el fin de estudiar su implicación en el mecanismo de fusión del HBV con la membrana de la célula hospedadora. Finalmente, utilizando la escala de hidrofobicidad interfacial de Wimley y White se han detectado tres regiones en la proteína E2 del HCV con tendencia a interaccionar con membranas. Péptidos sintéticos correspondientes a estas regiones son capaces de desestabilizar sistemas modelo de membrana, lo que sugiere que estas regiones podrían actuar como péptidos de fusión del HCV.

Autor: FIGUEROA GARCÍA FRANCISCO JAVIER.
Año: 2001.
Universidad: CADIZ.
Centro de lectura: CIENCIAS .
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: El objetivo principal de este trabajo era profundizar en la función que desempeña el antígeno centromérico humano CENP-A, en el papel general del centrómero. Para ello se plantearon cinco objetivos puntuales a desarrollar: 1,- Generar anticuerpos monoespecíficos contra el antígeno centromérico humano CENP-A para su uso posterior en ensayos tanto in vivo como in vitro. 2,- Ensayos del papel de la proteína centromérica CENP-A durante distintas fases del ciclo celular mediante el análisis por microinyección celular de los anticuerpos específicos anti-CENP-A generados. 3,- Establecer un protocolo inicial de purificación del autoantígeno humano CENP-A a partir de células y/o tejidos humanos, para su empleo en ensayos funcionales. 4,- Realizar ensayos de inmunoprecipitación de cromatina a partir de extractos nucleares humanos y analizar los componentes (ácidos nucleicos y proteínas) centroméricos coinmunoprecipitados con CENP-A. 5,- Aislar, clonar y caracterizar el gen del autoantígeno CENP-A en el genoma de hámster, y comparar la homología con el de otras especies ya descritas. Se ha generado un anticuerpo específico frente a un péptido de la región aminoterminal de la proteína humana CENP-A. Dicho anticuerpo ha sido purificado en una columna de afinidad y posteriormente utilizado en ensayos de microinyección en células humanas (HeLa), los cuales han revelado el papel esencial de CENP-A para la formación del cinetocoro y la división de la célula. Posteriormente se ha establecido un protocolo de purificación de la proteína nativa a partir de extractos de placenta humana, mediante solubilización de cromatina, cromatografía de intercambio iónico y de afinidad. Asimismo, se ha llevado a cabo la inmunoprecipitación de complejos de cromatina centromérica con el mismo anticuerpo generado anteriormente. El análisis mediante secuenciación de los ADN inmunoprecipitados ha revelado que no presenta de forma significativa la secuencia CENP-B box. Se ha identificado secuencias ATATATACGT, (GAAT)n y secuencias GA repetidas que, formando apareamientos anómalos G:A o agrupaciones de triple hélice, podrían favorecer el ensamblaje del cinetocoro, la asociación de CENP-A y la activación del centrómero. También se ha llevado a cabo un muestreo en una genoteca de ADNc de hámster (lamda-ZAP, CHO) con una sonda correspondiente al ADNc de la proteína humana. Se ha secuenciado el ADNc completo, obteniendo una secuencia de 1623 pares de bases, y una secuencia deducida de aminoácidos de 129 aminoácidos.