PROTEINAS, 6

Autor: PELACHO SAMPER BEATRIZ.
Año: 2001.
Universidad: NAVARRA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: En los últimos años se ha puesto de manifiesto una relación bidireccional entre los sistemas neuroendocrino e inmunitario, que tiene una clara influencia en la fisiopatología de diversas enfermedades. Neuropéptidos como la beta-endorfina, liberada por la pituitaria y células del sistema inmunitario, en respuesta al estrés físico o mental, altera la función del sistema inmunitario debido a la existencia de receptores de opioides en las células de dicho sistema. En nuestro estudio, hemos profundizado en los mecanismos moleculares inducidos por la beta-endorfina en monocitos humanos. Así, hemos demostrado que provoca la elevación de los niveles de cAMP, de modo dependiente de calcio/calmodulina y que está mediado, al menos en parte, por el NO producido como consecuencia de la activación de la cNOS por calcio/modulina. Además, la activación de proteína G estimuladora de la adenilato ciclasa está implicada en el aumento de dicho nucleótido cíclico. Hemos comprobado también, que la estimulación de monocitos humanos por la beta-endorfina conlleva la mitrosilación en tirosinas de la subunidad alfa de la proteína Gs. Por otro lado, la fosforilación de proteína en residuos de tirosina, que se produce en monocitos humanos por tratamiento con beta-endorfina, requiere de la activación previa de la PLC-PIP2, y promueve las cascadas de la ERK, JNK y p38. Se induce además la activación de los factores de transcripción NF-kB, AP-1 y CREB/ATF. La fosforilación del ATF-2 por la p38 y la JNK, y la degradación del IkB dependiente de las actividades PKA y PP2B, son etapas esenciales en la activación de AP-1 y NF-kB respectivamente, y podrían estar implicadas en el incremento de la producción de IL-1beta por monocitos humanos. Por otro lado, se ha comprobado clínicamente una recaída de pacientes con enfermedades autoinmunes como consecuencia del estrés. El pénfigo, es una enfermedad autoinmune que se caracteriza por la formación de ampollas a nivel de la epidermis, como consecuencia de la ruptura de las uniones intercelulares que conectan los queratinocitos. Hemos comprobado la unión específica de la IgC, purificada a partir de un paciente con pénfigo vulgar (IgG-PV), a queratinocitos humanos (HaCaT). Dicha unión implica, al menos, a las proteínas desmogleína-3 y desmogleína-1. La unión específica de la IgG-PV a queratinocitos HaCaT provoca la ruptura de las uniones intercelulares, así como las sobreexpresión de la tirosina quinasa FAK. Además, induce específicamente la entrada en apoptosis. Este proceso apoptótico lleva consigo la condensación de la cromatina nuclear, la fragmentación internucleosomal del DNA dependiente de caspasa-3, la activación de la caspasa-3, así como un aumento de los niveles de Bax y una disminución de los de Bcl-2. El pénfigo se caracteriza no sólo por alteraciones a nivel de epidermis, sino también del sistema inmunitario. Hemos comprobado que la IgG-PV estimula la producción de IL-1beta y TNF-alfa por monocitos humanos, tanto a nivel de mRNA, como de proteína. Los factores de transcripción CREB/ATF, NF-kB y AP-1 podrían estar implicados en este proceso. Además, la estimulación de monocitos humanos por la IgG-PV es más potente que la producida por las IgGs purificadas a partir de un individuo sano, por lo que los anticuerpos podrían ser importantes en el mantenimiento de la respuesta inmunitaria en el pénfigo vulgar.

Autor: PÉREZ MATO ISABEL.
Año: 2001.
Universidad: NAVARRA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: DEPT. MEDICINA INTERNA, FACULTAD DE MEDICINA, UNIVERSIDAD DE NAVARRA.

Resumen: La metionina adenosiltransferasa (MAT) juega un papel central en el metabolismo celular, ya que sintetiza a partir de ATP y metionina, S-adenosilmetionina (AdoMet), el principal donante de metilos de la célula. La actividad de la MAT ha de ser regulada con precisión para asegurar la provisión de AdoMet pero evitar un consumo innecesario de ATP. La regulación de la MAT hepática aún no se conoce bien, pero se ha determinado, tanto in vivo como in vitro, que la enzima es inactivada por óxido nítrico, mediante la S-nitrosilación de la cisteína 121. En este estudio se demuestra que la sustitución por serina de residuos ácidos y básicos localizados en el microentorno de la cisteína 121, produce formas de la enzima que son menos sensibles a la S-nitrosilación e inactivación por óxido nítrico. Estos experimentos aportan la primera evidencia experimental de que los aminoácidos cargados del entorno a la cisteína diana gobiernan la S-nitrosilación de proteínas. Los individuos con mutaciones en el gen MAT 1A, que codifica la MAT hepática, presentan una reducción en la actividad de esta enzima, lo que les causa una hipermetioninemia persistente. El fenotipo de hipermetininemia asociado a estas mutaciones es heredado de forma autosómica recesiva, con la única excepción de la transición G-A en el nucleótido 791 del exón VII, una mutación que genera la variante R264H de la MAT y que presenta un patrón de herencia autosómica dominante. En este estudio, se demuestra que la mutación equivalente en la MAT de hígado de rata resulta en una forma monomérica de la enzima que carece de actividad de síntesis de AdoMet. Además, esta subunidad mutada es capaz de asociarse con subunidades nativas, secuestrándolas en un heterodímero incapaz de sintetizar AdoMet. Estos resultados proveen un mecanismo molecular que explica la herencia autosómica dominante del fenotipo asociado a esta mutación.

Autor: ODRIOZOLA MONCAYOLA LETICIA.
Año: 2001.
Universidad: NAVARRA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: Actualmente, el fármaco más utilizado en el tratamiento del SIDA es el AZT. Este compuesto, es un terminador de cadena, que al ser incorporado por la transcriptasa inversa (RT) al DNA en crecimiento, bloquea su enlongación. Sin embargo, la eficacia del tratamiento se ve reducida por la aparición de cepas de virus resistentes. Esta resistencia está asociada a la aparición de mutaciones en cinco codones de la transcriptasa inversa del HIV-1. Se ha encontrado una situación paradójica con este compuesto, ya que las RT mutadas aisladas de los virus resistentes muestran una sensibilidad al AZT similar a la RT silvestre en ensayos in vitro. A pesar de los múltiples estudios realizados no se ha llegado a encontrar diferencias significativas en el proceso de polimerización de las enzimas silvestres y mutadas, que pudieran explicar la elevada resistencia encontrada in vivo. Intentando buscar estas diferencias quisimos estudiar la reacción de polimerización y la inhibición por AZT, en presencia de distintos cationes divalentes. Mediante esta estrategia queríamos sacar a la luz posibles alteraciones del sitio catalítico de la enzima, provocados por las mutaciones. Hemos encontrado que la presencia de cadmio en el medio da lugar a un efecto diferencial entre enzimas, lo que indica que las mutaciones que confieren resistencia al AZT sí afectan al sitio catalítico de la enzima. Por otro lado, la ausencia de diferencias en la polimerización de las enzimas silvestre y mutadas ha llevado a los investigadores a estudiar otros mecanismos que pudieran afectar a la inhibición del AZT. Hasta ahora se pensaba que la incorporación de un terminador de cadena era un proceso irreversible. Sin embargo, se ha comprobado que el terminador puede ser eliminado mediante un proceso de fosforolisis mediado por pirofosfato o por un nucleótido, dando lugar al rescate de la cadena terminada. En un principio se achacó la resistencia a una mayor velocidad de pirofosforilisis encontrada en las enzimas mutadas, que daría lugar a una mayor eficacia en el rescate. Sin embargo, las diferencias encontradas son pequeñas y no justifican por si solas las diferencias encontradas in vitro. Por otro lado, en el caso de la fosforolisis mediada por ATP, las diferencias encontradas son pequeñas y no justifican por si solas las diferencias encontradas in vitro. Por otro lado, en el caso de la fosforolisis mediada por ATP, las diferencias entre enzimas son mayores, pero la velocidad de la reacción es significativamente menor. Estos datos hacen que todavía se desconozca el grado de participación de la fosforolisis en el mecanismo de inhibición del AZT, así como cual sería el sustrato relevante in vivo. A pesar de esto, hemos encontrado que la pirofosforolisis puede ser relevante in vivo disminuyendo la eficacia del inhibidor tanto en la enzima silvestre como en las mutadas. Además, hemos estudiado el efecto de los inhibidores no nucleosídicos en la fosforolisis, encontrando que estos inhibidores son capaces de eliminar este proceso de forma muy eficaz en la enzima silvestre. En el caso de la enzima mutada, hemos observado que los compuestos de primera generación son incapaces de inhibir la pirofosforolisis, sin embargo los compuestos de segunda generación lo hacen a muy bajas concentraciones. Estos datos son un arma importante a la hora de diseñar la terapia combinada, ya que, si la fosforolisis participa en el mecanismo de resistencia al AZT, su combinación con compuestos no nucleosídicos capaces de inhibir la fosforolisis en las enzimas mutadas podría revertir la resistencia y retrasar, e incluso evitar la aparición de cepas resistentes al AZT.

Autor: POVEDA LARRUSA JOSÉ ANTONIO.
Año: 2001.
Universidad: MIGUEL HERNANDEZ.
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR.

Autor: SOLÍS FERNÁNDEZ JUAN.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: La glicoproteína humana HC está formada por una única cadena de aminiácidos. Está unida a un grupo cromóforo amarillo-marrón y forma complejos con la IgA. En el presente trabajo se ha estudiado el grado de glicación de HC así como la glicación "in vitro" de la proteína y la formación de productos de glicación avanzada. Estos productos han sido comparados con la proteína nativa. Se han localizado los sitios de glicación de la proteína y la posible relación de la glicación con el cromóforo ha sido analizada. El grupo cromóforo de HC ha sido estudiado en base a su fluorescencia características. Se ha investigado asimismo la unión del cromóforo a la proteína nativa. Se ha expresado en el sistema de baculovirus la proteína HC recombinante silvestre, mutada en la Cys34 y mutada en la Cys 169. El grupo cromóforo y las propiedades físico-químicas de las distintas proteínas recombinantes han sido analizadas. También se ha estudiado la capacidad de formación de complejo con la IgA de las tres proteínas.

Autor: GUERRERO ESTEO MERCEDES.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID.

Resumen: En el presente trabajo demostramos que endoglina interacciona físicamente con los receptores de TGF-beta tipos I y II. Esta asociación no se ve modificada por la presencia o ausencia de TGF-beta en el medio, ni por el estado de activación de los receptores. En la asociación endoglina/TbetaRs participan tanto el dominio extracelular como intracelular de las proteínas. Las características de la interacción endoglina/TbetaR-I y endoglina/TbetaR-II son distintas. El receptor tipo II interacciona con la región comprendida entre los aminoácidos 437-558 del dominio extracelular de endoglina, mientras que el receptor tipo I interacciona con al menos dos regiones del dominio extracelular de endoglina, una comprendida entre los aminoácidos 437-558 y otra por encima del aminoácido 437. Ambos receptores interaccionan también con el tallo citoplásmico de endoglina, pero mientras que TbetaR-I solo lo hace cuando su dominio quinasa está inactivo, TbetaR-II permanece asociado al tallo citoplásmico de endoglina independientemente del estado de activación del receptor. Además de existir una interacción directa, hemos demostrado que el tallo citoplásmico de endoglina es sustrato de la actividad quinasa de TbetaR-I y de TbetaR-II. Una vez fosforilato por TbetaR-II, el tallo citoplásmico de endoglina permanece asociado a él. Por otra parte, los resultados indican: A,- Que la presencia de endoglina en la célula disminuye la capacidad de autofosforilarse de TbetaR-II, resultando en una menor fosforilación del receptor tipo II in vivo. B,- El receptor tipo I se demuestra más fosforilado en células que expresan endoglina. C,- Este receptor tipo I más fosforilado aumenta su actividad quinasa sobre su sustrato Smad2, pero no sobre Smad3. Por ello concluimos que la interacción de endoglina con los receptores de TGF-beta modula la actividad señalizador de dichos receptores. Además, hemos demostrado que el tallo citoplásmico de endoglina interacciona con los dominios LIM de la proteína ZRP-1. El análisis del papel funcional de dicha interacción ha revelado que, mediante su asociación con ZRP-1, endoglina es capaz de regular la localización intracelular de ZRP-1, de forma que en ausencia de endoglina, ZRP-1 se localizan principalmente en los contactos focales, mientras que en su presencia, ZRP-1 está situada en todo el contorno celular y en forma de fibras por todo el citoplasma. Este cambio de localización de la proteína ZRP-1 debido a su interacción en endoglina, es el responsable de la aparición de numerosas fibras se actina por todo el citoplasma celular. Todos estos datos son muy interesantes, y nos ayudan a entender mejor el papel que endoglina juega en el complejo sistema de receptores de TGF-beta, y también abren una nueva vía de investigación sobre la función de endoglina y su asociación con el citoesqueleto.

Autor: HOZ RASTROLLO ANA BELEN DE LA.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID.

Resumen: El plásmido de bajo número de copias y amplio rango de huésped pSM19035 de Streptococcus pyogenes codifica una proteína de 71 aa, que recibe el nombre de omega, la cual regula la replicación y la segregación del plásmido. Dicho gen se encuentra ubicado entre los génes *y*, formando parte del operón ***. La proteína omega reprime, tanto in vivo como in vitro, la transcripción desde los promotores PcopS, P* y Pomega. Cuando el gen omega está presente en una célula, la cual porta un minireplicación que contiene la región rep del plásmido pSM19035, el número de copias de este se ve incrementado. Esto es debido a la represión del gen copS, cuyo producto regula negativamente la replicación. La proteína omega está involucrada en la segregación y el mantenimiento del plásmido en la progenie, mediante la regulación negativa de los genes *,* y*. La proteína omega inhibe la expresión de los genes copS, * y omega, sin impedir que *A RNAP de B.subtilis interacione con las secuencias promotoras . Ambas proteínas permanecen unidas al ADN, viéndose aumentada la afinidad de omera por el ADN cuando la *A RNAP está acomplejada con este. La proteína omega, que pertenece a la superfamilia Arc/MetJ, es un -- en solución. La proteína omega posee un NH2-terminal flexible y un dominio RHH (1 mina-hélice-hélice). Las dos alfa -hélices de cada -- forman un núcleo hidrofóbico, mientras que las dos 1 minas-beta en orientación antiparalela quedan en la superficie, siendo este el dominio de interacción con el ADN, a través del surco mayor. La estructura secundaria de omega no se ve afectada por variaciones en la fuerza iónica, pero un incremento en la concentración de sal si aumenta su estabilidad tanto térmica como a agentes caotrópicos. La desnaturalización de omega es frecuentemente dependiente de la concentración de proteína, tal y como cabría esperar para proteínas que oligomerizan. A su vez la estabilidad térmica de la proteína se ve incrementada cuando para proteínas que oligomerizan. A su vez la estabilidad térmica de la proteína se ve incrementada cuando este unida al ADN. Cada -- de proteína omega se une a una secuencia heptamérica introduciendo microdistorisiones en el ADN. La proteína omega se une cooperativamente a una secuencia de site para de bases (5

Autor: PÉREZ FERREIRO CARMEN M..
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: La clonación de cDNAs humanos que codifican para diferentes isoformas de la proteína 4.1R nos ha permitido analizar comparativamente la composición exónica de los mismos, la localización subcelular de sus productos proteicos así como definir regiones específicas implicadas en la diferente distribución subcelular de 4.1R. En estudios previos del laboratorio se han identificado dos regiones implicadas en la distribución nuclear de las isoformas de 4.1R. En este trabajo hemos caracterizado dos regiones que impiden dicha localización nuclear: una NES codifica por el exón 5 alternativo, y el dominio HP de 209 aminoácidos característico de las isoformas de 4.1R traducidas desde el ATG-1. El hecho de que las isoformas de la proteína 4.1R posean diferentes señales que modulan su localización subcelular, indica la existencia de mecanismos que regulen específicamente la distribución de las mismas. Con el propósito de abordar las funciones que desempeñan las distintas isoformas de 4.1R en células no eritroides, empezamos por caracterizar posibles interacciones entre isoformas específicas de la proteína 4.1R y otras proteínas. En trabajos anteriores llevados a cabo por nuestro grupo se ha descrito que una isoforma de 4.1R interacciona en el núcleo con el factor U2AF35 implicado en el procesamiento del pre-mRNA. En este trabajo demostramos que isoformas de 4.1R traducidas desde el ATG-1 e isoformas traducidas desde el ATG-2 son capaces de interaccionar con los microtúbulos de células T en interfase. Sin embargo, la sobreexpresión de alguna de ellas provoca la desorganización de la red de microtúbulos en células COS-7, sugiriendo que 4.1R puede desempeñar diferentes papeles en función del tipo celular donde se exprese. La región core de 4.1R está implicada en la interacción de 4.1R con los microtúbulos de células T y en la interacción in vitro entre distintas isoformas de la misma.

Autor: SÁNCHO VEGA ANA ISABEL.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: INSTITUTO DE FERMENTACIONES INDUSTRIALES (CSIC) E INSTITUTE OF FOOD RESEARCH (NORWICH, UK).

Resumen: En esta memoria se han estudiado ciertas proteínas (cinamil esterasas e inhibidores proteicos de la actividad xilanasa) implicadas en la despolimerización del almidón y de los arabinoxilanos constituyentes de cereales. Se ha purificado una proteína en cebada que inhibe la actividad xilanasa microbiana. Otra proteína purificada en trigo (XIP-1) poseía la capacidad de inhibir las actividades xilanasa microbiana y alfa-amilasa de cebada. La inhibición de la actividad xilanasa por el inhibidor en cebada y la de alfa-amilasa por XIP-1, no seguía un modelo clásico de inhibición. Se describe la determinación de la actividad cinamil esterasa en granos de cebada de diferentes variedades. Se ha optimizado un método de preparación de los extractos de cebada, y de detección, por HPLC, de los productos liberados por la acción de la cinamil esterasa. Se han determinado los parámetros cinéticos, usando sustratos sintéticos y naturales procedentes de las paredes celulares de cereales, y algunas características físico-químicas (temperatura y pH óptimos) de la actividad cinamil esterasa. También se ha estudiado su estabilidad, evolución durante la germinación y acción de inhibidores específicos. Se ha investigado la posible relación entre la actividad cinamil esterasa con el contenido total del ácido ferúlico en el grano de cebada, y con algunos otros factores genéticos y geográficos. Se han aplicado extractos de cebada con un alto contenido en actividad xilanasa y en actividad cinamil esterasa en la liberación de ácido ferúlico a partir de residuos agroalimentarios de cereales (bagazo cervecero y salvado de trigo).

Autor: SERNA RICO ALEJANDRO.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGÍA MOLECULAR "SEVERO OCHOA".

Resumen: Para la realización de esta tesis, se analizo la ORF16.7 del bacteriófago 029 con los siguientes objetivos: Determinar si la ORF16.7 constituye un gen y analizar la síntesis de la proteína p16.7 durante el ciclo viral. Determinar el sitio de la célula infectada en la que se localiza la proteína p16.7 y determinar la región de la proteína p16.7 responsable de esta localización. El análisis de la conformación global de la proteína p16.7 de 029 en solución. Determinar su grado de oligomerización y las regiones de la proteína responsables del estado de asociación de la misma. Estudio de la función de la proteína p16.7 en la replicación in vivo e in vitro así como las interacciones de la proteína p16.7 con los componentes presentes durante el ciclo infectivo del bacteriófago 029. Determinar las regiones de la proteína p16.7 responsables de las distintas funciones de la misma. Con el trabajo realizado y que se muestra en la tesis se demostró que: La ORF16.7 codofica una proteína de 130 aminoácidos denominada p16.7. Dicha proteína se expresa en cantidades altas a tiempos tempranos de la infección y permanece estable durante todo el ciclo infectivo de 029. La p16.7 es una proteína integral de membrana. Los 20 aminoácidos del extremo N-terminal son los responsables de la localización de la proteína en la membrana celular. La eficiencia de la replicación del DNA de 029 in vivo está afectada en ausencia de la proteína p16.7, especialmente a tiempos tempranos del a infección. La proteína p16.7ª interacciona con la proteína terminal (TP) in vitro. Dicha interacción no se produce cuando la TP está formando un heterodímero con la DNA polimerasa. La proteína p16.7ª tiene afinidad por DNA, siendo la afinidad por ssDNA unas veinte veces mayor que poe dsDNA. La proteína p16.7ª se une a la banda simple desplazada de los intermedios replicativos generados durante la replicación del DNA de 029 y puede sustituir funcionalmente a la SSB p5 de 029 en ensayos de amplificación de DNA in vitro. La proteína p16.7ª forma dímeros en solución. Además, p16.7 tiene capacidad de oligomerizar, estando los últimos 10 aminoácidos del extremo C-terminal implicados en dicha oligomerización. Así la proteína p16.7 localiza el DNA de 029 que se está replicando en la membrena de la célula infectada ayudando a la compartimentalización del a replicación del DNA in vivo.

Autor: LÓPEZ TORREJÓN GEMA.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.

Resumen: Los temas de estudio llevados a cabo en esta Tesis Doctoral se pueden resumir en los siguientes puntos: 1,- Para tratar de entender cómo ocurre la formación del complejo sináptico y el posterior intercambio de cadenas se ha estudiado la topología de las reacciones de resolución e inversión mediadas por la proteína b. Se ha llegado a la conclusión de que el intercambio de cadenas sigue el Modelo de Rotación Simple propuesto para las demás recombinasas de la familia. El complejo sináptico es mantenido por interacciones proteína-proteína entre protómeros de b que están en los subsitios de recombinación y por la presencia de la proteína Hbsu que se sitúa entre los subsitios y proporciona estructuras mas curvadas del ADN. 2,- Se ha visto que la reacción de recombinación específica de sitio catalizada por la proteína b se puede ver alterada por la presencia de otras proteína que modifican la arquitectura del ADN. Por un lado, se ha caracterizado la proteína g del plásmido pSM19035 de S.pyogenes y se ha visto que es una topoisomerasa tipo III, que relaja el ADN. Al analizar esta proteína dentro de la recombinación mediada por la proteína b, se ha visto que produce moléculas de ADN mas relajadas que derivan en productos de recombinación propios de la inversión. Por otro lado, la proteína LrpC de B.subtilis produce estructuras del ADN complicadas que son incapaces de formar complejos sinápticos productivos, viéndose la reacción de resolución inhibida en presencia de altas concentraciones de LrpC. 3,- Se ha llegado a definir el dominio estructural de unión a ADN de la proteína Hbsu de B.subtilis. Se ha visto que el residulo treonina 65 es el más importante en la unión a ADN. 4,- Se ha caracterizado bioquímica y genéticamente la proteína LrpC de B.subtilis. Con los resultados obtenidos podemos encuadrar la proteína LrpC en la familia de proteíns que producen el papreamiento de moléculas de ADN homólogas, en el procaso de recombinación homóloga.

Autor: BAGNAT MICHEL.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: EMBL (LABORATORIO EUROPEO BIOLOGÍA MOLECULAR), HEIDELBERG, ALEMANIA.

Resumen: El establecimiento y mantenimiento de los distintos compartimentos celulares requiere la existencia de mecanismos que aseguren el correcto transporte y distribución de proteínas. En células epiteliales MDCK los glicoesfingolípidos son transportados a la membrana apical. Esto dio lugar a la propuesta de que complejos de glicoesfingolípidos forman plataformas para el transporte polarizado de proteínas. Estas plataformas lipídicas se forman por el estrecho empaquetamiento de los ácidos grasos delos glicoesfingolípidos, mayormente saturados, con colesterol a las que distintas proteínas se asocian específicamente. Poco es lo que se conoce acerca de los factores y mecanismos que regulan este proceso. En este trabajo he utilizado la levadura Saccharomyces cerevisiae como modelo experimental para estudiar la biogénesis y función de las plataformas lipídicas. Los resultados aquí presentados demuestran la existencia de plataformas lipídicas en levaduras. En este organismo las plataformas lipídicas estan compuestas de esfingolípidos y ergosterol. El ensamablaje de las plataformas lipídicas en levaduras empieza en el retículo endoplasmático, a diferencia de los mamíferos donde ocurre en el complejo de Golgi. En esta tesis demuestro el papel fundamental de las plataformas lipídicas en el transporte a la superficie celular de Pma1p, la proteína más abundante de la membrana plasmática. La asociación de Pma1p con las plataformas lipídcas es mediada por la unión de la proteína Ast1p que determina la formación de un complejo que luego es transportado a la superficie. Las plataformas lipídicas están implicadas en la generación y el mantenimiento de la polaridad celular. Cuando levaduras haploides perciben la presencia de feromonas secretadas por otra célula se produce un crecimiento polarizado de ambas en la dirección de la otra célula. Durante esta respuesta se produce una reorganización de la membrana, dependiente de plataformas lipídicas, que resulta en la retención de determinadas proteínas en la punta de las proyecciones. En esta tesis presenta evidencia que demuestra el papel de la interacción con plataformas lipídicas en el transporte de proteínas y en establecimiento de polaridad celular.

Autor: DOMÍNGUEZ CÁCERES M. AURORA.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS CSIC.

Resumen: La proliferación celular inducida por prolactina (PRL), requiere de la unión de una molécula de hormona a dos de receptor. El receptor de PRL (PRLR) pertenece a la familia de receptores de citoquinas Tipo I, que carecen de actividad quinasa intrínseca y poseen un único dominio transmembrana. La tirosina quinasa Jak2 que se encuentra asociada de forma constitutiva al receptor, a nivel de la Caja 1, desempeña un papel crítico en la transducción de señales. Tras la unión del ligando se produce la fosforilación y activación de las Jaks asociadas que a su vez fosforilan al receptor en tirosina, creando lugares de anclaje para posibles proteínas citosólicas con dominios SH2. Así mediante la asociación y activación de varias moléculas señalizadoras se desencadenan una serie de cascadas de transducción de señales como es el caso de las vías Jak2/Stat5, Ras/Mapk y PI3K, que promueven la proliferación celular. La familia de tirosinas quinasas Src (FKS), también es activada por PRL. En el presente trabajo, hemos tratado de analizar la impliación de la FKS en la proliferación celular estimulada por PRL. Para ello, estudiamos diferentes rutas implicadas en la señalización que promueven proliferación. Así nuestros resultados demuestran que la FKS es activada por PRL y dicha activación es necesaria para la transición de la fase G1 a la fase S, en el ciclo celular, y está implicada en la activación de la expresión de los genes de inducción temprana c-fos, c-myc, c-jun y odc. También se ha observado que FKS media la activación de la fosforilación de la fosfatasa Shp2, así como la estimulación de diferentes quinasas citoplasmáticas dependientes de la vía PI3K. La activación de esta ruta de transducción de señales por PRL, en células linfocitarias W53, es responsable de inducción de la expresión de c-myc, la cual se produce a través de la proteína serin-treonin quinasa Akt, de manera.

Autor: GONZÁLEZ SAGRADO MANUEL.
Año: 2001.
Universidad: VALLADOLID.
Centro de lectura: MEDICINA .
Centro de realización: HOSPITAL "DEL RIO HORTEGA".

Resumen: La realización de una ecocardiografía de estrés con dobutamina (EDOB) en 63 pacientes con Enfermedad de la Arteria Coronaria da lugar a la aparición de daño miocárdico demostrable bioquímicamente mediante la elevación de troponina T cardiaca (cTnT) en al menos, el 25% de los casos. El daño miocárdico asociado a la prueba no alcanza el rango de IAM definido (bioquímica, clínica o electrocardiográficamente) por los criterios diagnósticos tradicionales de la OMS. Por el contrario, puede ser definido bioquímicamente como Daño Miocárdico Mínimo (DMM), distinguiéndose en su aparición dos tipos de cinéticas: una precoz (con pico máximo entre las 3 y las 6 horas, 81% de los casos) y otra tardía (entre las 12 y las 24 horas, 19% de los casos). La determinación aislada de cTnT a las 6 a las 12 horas permitirá detectar en la práctica clínica la mayoría de los picos máximos del marcador con una pérdida mínima de información respecto a las múltiples determinaciones de una cinética completa. Respecto a las variables clínicas analizadas (edad, sexo, pauta de dobutamina, antecedentes coronarios y factores de riesgo cardiovascular), ninguna de ellas ha podido ser relacionada con el resultado de la EDOB, en tanto que la existencia de IAM (antiguo o reciente), se ha asociado con el resultado positivo de la cTnT. La concordancia entre los resultados "positivos" y "negativo" de la EDOB y de la troponina T se ha producido en el 67% de los casos. Esta coincidencia ha estado fundamentada en una buena correlación de los parámetros que definen la positividad de la cTnT (incremento absoluto y relativo del marcador) con el resultado "positivo" de la EDOB. El significado diagnóstico y/o pronóstico de la elevación de la cTnT en la EDOB deberá establecerse mediante estudios prospectivos en los que sean utilizados como "patrón oro" la coronariografía y el índice de eventos coronarios adversos a diferentes plazos. Finalmente, el alto número de casos "dudosos" para el resultado de la cTnT (incremento no significativo del marcador) ha podido asociarse a situaciones que dificultan la interpretación bioquímica, tales como la presencia de un DMM basal (edad avanzada con alta prevalencia de ICC, casos de IRC) o de valores situados por debajo del límite de sensibilidad funcional de la técnica.

Autor: CERA MARTÍNEZ TAMARA DE LA .
Año: 2001.
Universidad: OVIEDO.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.

Resumen: La glucosa regula la utilización del carbono principalmente inhibiendo o activando la transcripción de numerosos genes mediante el mecanismo conocido como represión por glucosa. Aunque varios de los genes implicados en esta vía han sido identificados, todavía no se conoce el complejo mecanismo por el que la célula de Saccharomyces cerevisiae detecta y responde a los niveles de glucosa. Esta Tesis constituye una aportación a este desconocido mecanismo mediante el estudio del papel que ejerce la proteína hexoquinasa 2 en esta vía de señalización por glucosa. En presencia de glucosa la proteína hexoquinasa 2 (Hxk2), normalmente residente en el citosol, es translocada al núcleo donde impide la activación de la transcripción de los genes reprimibles por glucosa HXK1, GLK1 y SUC2 y promueve la activación de la transcripción de los genes inducidos por glucosa HXK2 y HXT1. Además se demuestra el papel de un motivo heptamérico, llamado sitio MED8 encontrado en numerosos genes regulados por glucosa, en la unión directa con la proteína mediadora de la transcripción Med8, tanto como monómero y como homodímero. Debido a que este sitio había sido previamente involucrado en la regulación de la transcripción génica inducida por glucosa dependiente de Hxk2, también se demostró una posible interacción entre ambas proteínas, Hxk2 y Med8. Nuestros resultados muestran que las proteínas Hxk2 y Med8 están físicamente asociadas y que la interacción Hxk2-Med8 es de gran significancia fisiológica porque ambas proteínas han sido encontradas interaccionando juntas con fragmentos de ADN conteniendo el sitio MED8. Concluimos que Hxk2 opera a través del sitio MED8, por interacción con Med8 en la vía de transducción de la señal por glucosa en Saccharomyces cerevisiae. También se ha llevado a cabo un estudio paralelo de interacción de Hxk2 con otros factores que forman parte del sistema de transducción de la señal glucosa dependiente de Hxk2 concluyendo una interacción entre Hxk2 y el represor transcripcional Mig1.

Autor: ÁLVAREZ-RÚA ÁLVAREZ M. CARMEN.
Año: 2001.
Universidad: OVIEDO.
Centro de lectura: QUÍMICA .
Centro de realización: FACULTAD DE QUÍMICA.

Resumen: Los métodos vectoriales fueron desarrollados a mediados del siglo pasado para la resolución estructural de moléculas de pequeño tamaño mediante cristalografía de rayos X. Sin embargo, la disponibilidad de datos de difracción hasta alta o moderada resolución ha permitido también su utilización en cristalografía macromolecular. En este contexto, se ha estudiado la aplicación de estos métodos en la etapa de rotación del método del reemplazo molecular. Para ello, se ha tomado como base la función de rotación que se evalúa en un programa de cálculo llamado OVIONE. La metodología utilizada en dicho programa se ha mejorado con la incorporación de un procedimiento de refinamiento de las soluciones de la función de rotación. Asimismo, se ha desarrollado un algoritmo para el tratamiento del problema de varios cuerpos en reemplazo molecular. Finalmente, se ha estudiado la aplicación de esta metodología a la detección de fragmentos de pequeño tamaño así como de motivos estructurales genéricos (como hélices alfa ideales), utilizados como modelos en la evaluación de la función de rotación.

Autor: SÁNCHEZ COBOS EVA.
Año: 2001.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: Esta Tesis se ha centrado en la caracterización de la estabilidad y desplegamiento de dos pequeñas proteínas globulares de tamaño similar (alrededor de 70000 Daltons) inducido por un aumento en la temperatura o en presencia de agentes desnaturalizantes, empleando para ello técnicas de equilibrio como la calorimetría diferencial de barrido (CDB) y el dicroísmo circular (DC) y técnicas cinéticas como la de flujo detenido. Las proteínas objeto de dichas investigaciones han sido AS-48, una proteína circularizada en la naturaleza y el mutante Best5I25V del dominio SH3 de alfa-espectrina. En el caso de AS-48 se ha demostrado que presenta una elevada resistencia a la desnaturalizantes. El mutante Best5I25V, en el que se ha modificado el núcleo hidrofóbico del dominio SH3 de alfa-espectrina, presenta una mayor estabilidad que la del dominio silvestre, aunque su estado de transición no varía en comparación con el descrito en la bibliografía para el descrito para la familia SH3. Según esto, las conclusiones más importantes que se han obtenido son: * El estudio por CDB de la proteína AS-48 muestra que la desnaturalización térmica tiene lugar a muy alta temperatura y se describes según el modelo sencillo de dos estados a baja fuerza iónica y pH 2.5, mientras que a pH neutro y alcalino se produce la agregación irreversible. * La razón de esta alta estabilidad parece deberse a un efecto entrópico favorable producido por la circularización de la cadena polipeptídica. * El valor del cambio de energía de Gibbs calculado a 25ºC a partir de los datos obtenidos en presencia de urea es superior al encontrado para otras proteínas de tamaño similar, aunque se correlaciona muy bien con el determinado por CDB. * Los resultados del análisis termodinámico de los datos obtenidos en presencia de guanidina indican la doble acción de este agente: como desnaturalizante, desestabilizando la estructura cuando se encuentra a altas concentraciones y como estabilizante, predominando este efecto cuando se encuentra a bajas concentraciones. * A la vista de los resultados obtenidos por los estudios de CDB y DC la estabilidad de AS.48 se explica mediante la distribución asimétrica de las cargas en su superficie, indispensable para realizar su función biológica y mediante la ganancia entrópica originada por la circularización de la cadena polipeptídica. * La caracterización termodinámica del mutante Best5I25V mediante CDB muestra una elevada estabilidad frente a la especie silvestre determinada en la bibliografía. La razón de dicha estabilidad es de naturaliza entrópica, resultado del cambio en el núcleo hidrofóbico de la proteína. * La caracterización del estado de transición de Best5I25V muestra que dicho estado es más homogéneo que el encontrado para la especie silvestre, debido al cambio de los restos hidrofóbicos realizado en este mutante, que pueden dar lugar a interacciones no específicas entre estos restos que ayudan a compensar el coste entrópico que supone el plegamiento. * También se ha observado un aumento en las constantes de volocidad de los procesos de plegamiento y de desplegamiento, indicando que el estado de transición de Best5I25v se encuentra estabilizado respecto a los estados nativo y desnaturalizado, consecuencia de la mayor reorganización de los restos del núcleo hidrofóbico. * A pesar de estas diferencias, la topología de Best5I25V comparada con la de la especie silvestre se mantiene, indicando que aunque hasta el momento está se ha considerado un factor muy importante en el proceso de plegamiento, su papel puede verse modulado por la presencia de otros efectos, como la presencia de las interacciones no específicas que parece tener lugar entre los restos hidrofóbicos del núcleo de la proteína.

Autor: RUIZ ARROYO RAQUEL.
Año: 2001.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: ESTACIÓN EXPERIMENTAL DEL ZAIDÍN (CSIC).

Resumen: Las bacterias del género Pseudomonas poseen una gran variabilidad metabólilca y son capaces de mineralizar una amplia variedad de compuestos aromáticos, muchos de ellos contaminantes ambientales. En muchos casos, los enzimas implicados en el metabolismo de estos compuestos están codificados por genes de localización plasmídica. Uno de los plásmidos catabólicos mejor caracterizados es el plásmido TOL pWWO de Pseudomonas putida, responsable de la degradación de tolueno y xileno. En este plásmido, los genes catabólicos están organizados en dos operones, el operón "upper" codifica los enzimas necesarios para la oxidación de hidrocarburos aromáticos hasta sus correspondientes ácidos carboxílicos, los cuales son degradados hasta intermediarios del ciclo de Krebs por los enzimas codificados con el operón meta. Este trabajo se ha centrado en el estudio de uno de los elementos que intervienen en la regulación de la ruta meta: la proteína XylS, y más concretamente en su extremo N-terminal, implicado en la interacción y reconocimiento de moléculas efectoras.

Autor: LÓPEZ FERRER ANNA.
Año: 2001.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.

Resumen: La presencia de alteraciones en los patrones de glicosilación es uno de los hechos implicados en el proceso de transformación neoplásica de las células epiteliales. Los glicoconjugados que se forman en el proceso de O-glicosilación están asociados de mayoritariamente a las glicoproteinas que forman el moco, siendo las mucinas el componente básico de su composición. Estas proteínas presentan repeticiones en tándem en su secuencia primaria, diferentes para cada mucina y que les confiere el elevado grado de glicosilación que presentan. Estas secuencias son ricas en serina y treonina, residuos donde se inicia el proceso de O-glicosilación, de modo que la parte glicosídica de estas proteínas puede representar hasta el 80% del su peso molecular. Hasta el momento, se han clonado 13 genes de mucinas humanas con patrones de distribución celular i tisular característicos. El estudio de su patrón de expresión y glicosilación ha sido uno de los objetivos de esta tesis. El epitelio gástrico normal presenta dos poblaciones de células mucosecretoras que sintetizan mucinas diferentes: las células del epitelio superficial expresan MUC5AC en asociación con antígenos Lewis de tipo 1 y FUT2, mientras que las células de las glándulas expresan MUC6, antígenos Lewis de tipo 2 y FUT1. Estos patrones de asociación se pierden en las primeras etapas de la carcinogénesis gástrica. Algunos de estos patrones anormales también han sido detectados durante el desarrollo fetal de la mucosa gástrica. Con el fin de establecer una asociación directa entre el patrón de expresión de mucinas y su patrón de glicosilación hemos establecido un modelo in vitro utilizando células HT-29/M3 de cáncer de colon humano, que expresan MUC1, MUC5AC, antígenos Lewis de tipo 1 y FUT2 pero no antígenos Lewis de tipo 2 ni FUT1, reproduciendo el patrón de expresión de las células del epitelio superficial del estómago. La transfección de esta línea celular con el cDNA de FUT1 humana induce la expresión de novo de antígenos Lewis de tipo 2, que hemos visto directamente asociados a MUC1 y MUC5AC, demostrando que la expresión de fuociltransferasas a nivel celular determina el patrón de glicosilación de apomucinas. En otras patologías como los tumores de pulmón de no-célula pequeña y la displasia de cervix, hemos determinado que las mucinas también pueden actuar como moléculas marcadoras de alteraciones preneoplásicas y neoplásicas. Así, hemos demostrado la implicación de MUC4 en el proceso de transformación neoplásica del epitelio cervical y de MUC5AC con la aparición de fenotipos tumorales mucosecretores.

Autor: FARO TOMÁS MERCEDES.
Año: 2001.
Universidad: ZARAGOZA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS DE LA UNIV. DE ZARAGOZA.

Resumen: Las Reacciones de transferencia de electrones entre proteínas constituyen al base de multitud de procesos biológicos esenciales en los que se producen transformaciones de energía así como en rutas de biosíntesis de compuestos de interés fisiológico. La ferredoxina-NADP reductasa (FNR), es la flavoenzima responsable del almacenamiento de la energía luminosa capturada durante el proceso fotosintético en forma de equivalentes de reducción. A partir de la caracterización bioquímica, estructurales y energéticos a la eficiencia del proceso global de reconocimiento molecular y posterior transferencia de electrones entre la FNR y sus sustratos. Este estudio permite ahondar en el mecanismo catalítico de la FNR, esencial para una modificación racional de la falvoenzima con fines industriales o terapéuticos.