PROTEINAS, 7

Autor: BARRIOS BARDAVÍO BEATRIZ.
Año: 2001.
Universidad: ZARAGOZA.
Centro de lectura: VETERINARIA .
Centro de realización: FAC. DE VETERINARIA - UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA.

Resumen: Los componentes del plasma seminal, particularmente las proteínas, desempeñan un papel crucial en todos los procesos relacionados con la capacidad fecundante des espermatozoide. Por ello, el estudio de su pérdida, redistribución y capacidad protectora frente al daño de membrana causado por el choque térmico, puede ser utilizado para la puesta a punto de protocolos más eficaces de congelación, con objeto de aumentar la difusión de la I.A., todavía muy limitada en la especie ovina. Del presente trabajo se obtienen las siguientes conclusiones: * La criopreservación de espermatozoides ovinos conlleva una pérdida de proteínas de membrana, ya en el proceso de refrigeración, y que no logra evitarse mediante el uso de los aditivos criprotectores comúnmente utilizados. * Las PPS ovino poseen capacidad protectora y reparadora frente al daño producido por el choque térmico por frío en la membrana espermática, recuperando parcialmente su integridad de membrana. Dicha capacidad recuperadora varía estacionalmente y parece residir en dos proteínas de 14 (RSVP-14) y 20 kDa (RSVP-20), ya que además la abundancia de ambas en el PS varía paralelamente de forma estacional. * Ambas proteínas se sintetizan exclusivamente en las células epiteliales de las vesículas seminales y se secretan mediante mecanismos mecrocrino y apocrino. * En la superficie espermática la RSVP-14 se localiza preferentemente en el dominio acosomal y pieza intermedia, y la RSVP-20 en acrosoma y flagelo completo. El "cold-shock" y la criopreservación provocan cambios en la distribución de ambas proteínas (pérdida de su localización acrosomal y en la pieza intermedia, y redistribución por toda la cabeza y segmento ecuatorial). Las dos proteínas se liberan en gran medida de la membrana en la criopreservación, siendo especialmente sensible la proteína de RSVP-14. * La capacitación y la reacción acrosómica provocan una pérdida parcial, especialmente de la RSVP-20, que se libera ya en los primeros pasos del proceso. Asimismo, se produce una redistribución en la superficie espermática, especialmente drástica para la RSVP-20, hacia la región postecuatorial y segmento ecuatorial. Por ello parecen poseer un papel descapacitante, y quizá se hallen también implicadas en la unión al ovocito al permanecer todavía una subpoblación importante asociada a la membrana tras la inducción de ambos procesos. * Su caracterización y secuenciación muestran a la RSVP-14 como una proteína altamente hidrofóbica, que no se halla glicosilada, pero sí fosforilada en Ser, y cuya secuencia amino terminal muestra una elevada homología con la proteína BSP A1/A2 perteneciente a las BSPs bovinas, poseyendo un fragmento del dominio de Fibronectina Tipo I. Ello ayudaría a explicar, mediante su capacidad de interacción con la matriz extracelular, su capacidad protectora de la integridad de membrana, realizando asimismo un papel descapacitante. La RSVP-20 es una proteína con menor carácter hidrofóbico, glicosilada, y desconocida hasta el momento, al no hallarse homologías reseñables con las proteínas recogidas en las bases de datos, pero que parece realizar un papel descapacitante por los resultados anteriores, lo cual explicaría asimismo su capacidad protectora y reparadora. La clonación futura de ambas proteínas para su utilización como aditivo en la congelación, es un objetivo futuro máximo interés.

Autor: PANICOT ANGLADA MIREIA.
Año: 2001.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: FARMACIA .

Resumen: Las poliaminas son moléculas nitrogenadas esenciales presentes en todos los organismos vivos. Las más comunes son la putrescina, la espermidina y la espermina. En la planta modelo Arabidopsis, la conversión de putrescina a espermidina en la ruta de biosíntesis de pliaminas está catalizadas por dos enzimas espermidina sintasa muy similares, denominadas SPDS1 y SPDS2. Mediante un rastreo de doble híbrido, se ha comprobado que SPDS2 interacciona con SPDS1 y con una nueva proteína, SPMS, homóloga a SPDS1 y SPDS2. La proteína SPMS interacciona con SPDS1 y SPDS2 en levadura e in vitro. A diferencia de SPDS1 y SPDS2, SPMS es incapaz de complementar la deficiencia de espermidina en un mutante de levadura spe*3. Las proteínas SPDS y SPMS no muestran homodimerización, pero forman heterodímeros in vitro. La co-expresión de combinaciones de dos de las tres proteínas en estudio SPDS1, SPDS2 y SPMS, marcadas con los epítopos HA y c-Myc en células de Arabidopsis ha confirmado la existencia de heterodímeros de SPDS1-SPDS2 y SPDS2-SPMS in vivo. Las proteínas SPDSs y SPMS marcadas con un epítopo co-purifican con complejos proteicos comprendidos entre 650 y 750 kDa. Estos datos demuestran la existencia de un metabolón que incluye como mínimo los dos últimos pasos de la ruta de biosíntesis de poliaminas en Arabidopsis.

Autor: GÓMEZ TREVIÑO JESUS ALBERTO.
Año: 2001.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: FARMACIA.

Resumen: La glicoproteína fosogénica (F) del paramyxovirus SV5 media la entrada del mismo en la célula huésped y provoca la fusión de ésta con las células de alrededor. Este proceso desencadena la aparición de masas de células fusionadas, denominadas sincitios, y que conduce finalmente a la muerte celular a causa de trastornos metabólicos y lisis de la membrana citoplasmática. Se construyeron vectores adenovirales no replicativos para sobre-expresar la glicoproteína F de SV5 en distintas líneas celulares de origen tumoral en cultivo. Los resultados de los ensayos realizados muestran una alta citotoxicidad por parte de la glicoproteína F y que es comparable a la del sistema de terapia suicida timidina quinasa/ganciclovir. La inducción a la formación de sincitios se observa a las 48 horas post-infección, los cuales pierden viabilidad progresivamente. Se demostró también que la expresión de esta glicoproteína posee un potente efecto bystander hasta en razón de 1:100 sobre células no transducidas. Los estudios de microscopía confocal y electrónica muestran cambios morfológicos en las células transducidas que incluyen, vascuolización de mitocondrias, rarefacción del citoplasma, además de importanes daños en la membrana citoplasmática mientras se preserva la estructura nuclear. Estos daños en la membrana inducen una mayor difusión de metabolitos tóxicos al ensayar la expresión de la glicoproteína F de manera conjunta con sistemas de activación de pro-drogas como CYP2B1/ciclofosfamida o timidina quinasa/ganciclovir. Estos resultados indican que la sobre-expresión de la glicoproteína F del paramyxovirus SV5 induce la muerte celular por alteración de la estructura de la membrana celular y la formación de sincitios no viables, lo cual puede ser utilizado en la eliminación de células tumorales.

Autor: ATAYA ATAYA FARID SHOKRY.
Año: 2001.
Universidad: CORDOBA.
Centro de lectura: CIENCIAS .
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: En Chlamydomonas reinhardtii se encontró y purificó una proteína portadora de cofactor de molibdeno (MocoCP). Esta proteína funciona como donadora de cofactor de molibdeno (Moco) a la aponitrato reductasa (Witte et al., 1998). Se ha microsecuenciado esta proteína y se han diseñado oligonucleótidos degenerados que se han usado como cebadores para amplificar mediante PCR el gen que codifica para la MocoCP. Se ha aislado un clon de 1 kb correspondiente a la MocoCP y se ha estudiado la secuencia de este cDNA. El análisis de esta secuencia, mediante el programa GCG, mostró una región traducida correspondiente a una proteína de 165 aminoácidos con una masa molecular de 16,5 kDa y punto isoeléctrico de 6,1. Asimismo, se ha aislado el gen que codifica para la MocoCP (CrMcp1) y corresponde a un DNA de 2,5 Kb cuya fase abierta de lectura contiene 4 exones y 3 intrones. El promotor de CrMcp1 contiene muchas cajas posibles de regulación por luz (10) semejantes a diversas secuencias encontradas en promotores de genes de plantas, dos cajas de choque térmico y dos de control por nitrato. La MocoCP se ha clonado en el vector de expresión pGEX-KG y se ha expresado como proteína de fusión (glutatión transferasa-MocoCP) en E.coli. Esta proteína se ha purificado mediante cromatografía de afinidad (glutatión agarosa) hasta homogeneidad electroforética, de la que se liberó la MocoCP por digestión con trombina y se separó por cromatografía en la misma columna. La funcionalidad de esta proteína recombinante se ha demostrado mediante su capacidad de unión al Moco libre (procedente la xantina oxidasa). Un estudio a nivel bioquímico sobre la MocoCP recombinante indicó que ésta se ensambla en forma de heterómero y no une Moco bacteriano aunque puede unirse con alta afinidad al Moco extraído de XO de leche y complementar la actividad de la apoNR del mutante nit-1 del hongo N.crassa. La MocoCP recombinante protege al Moco unido frente a la inactivación por oxígeno y lo mantiene activo (70% después 24 h en aerobiosos), en tanto que el Moco libre pierde casi toda su actividad tras 5h en condiciones aeróbicas. El tetrámero mostró alta antigenicidad en conejo e indujo la producción de anticuerpos que se usaron para comprobar la presencia de la MocoCP en extractos de diversas plantas, hongos, e hígado de rata. Todos los extractos ensayados muestran proteínas que se reconocen por los anticuerpos generados contra la MocoCP recombinante.

Autor: CUADRADO LÓPEZ MYRIAM.
Año: 2001.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: INSTITUTO MICROBIOLOGÍA-BIOQUÍMICA.

Resumen: La metilación del DNA en mamíferos es una modificación covalente del carbono 5 de la citosina que se produce fundamentalmente en el dinucleótido CpG. El 80-90% de estos dinucleótidos están metilados y el resto se localiza en regiones de 1 Kb de tamaño que se denominan islas CpG, la mayoría de las cuales se localizan en el extremo 5' de aproximadamente el 50% de los genes de mamíferos. Una característica importante de las islas CpG es que siempre se encuentran sin metilar incluso en aquellos tejidos en los que el gen no se expresa. La metilación anormal de la isla bloquea la expresión del gen asociado a ella, lo que provoca una pérdida de función que podría contribuir a la progresión tumoral cuando el gen afectado es un supresor tumoral. De hecho, alguno de los casos descritos afecta a genes de este tipo como son el gen Rb, VHL o p16. El primer objetivo de esta tesis fue determinar si en el proceso de metilación accidental de islas CpG que se produce durante la progresión tumoral se ven afectados otros genes además de los genes supresores tumorales. Para ello, analizamos mediante la técnica del bisulfito sódico el patrón de metilación de la isla CpG asociada al gen supresor tumoral p53, a los genes de expresión constitutiva ADA y al componente RNA de la Telomerasa y también analizamos el gen específico de tejido alfa-globina humano en DNA obtenido de muestras de leucemias mieloides agudas, de líneas celulares humanas y de sangre periférica de individuos sanos. Como resultado de este análisis observamos que la metilación de novo de islas CpC que tiene lugar en la progresión tumoral puede afectar a todas las islas CpG del genoma humano y no exclusivamente a aquellas asociadas a genes supresores tumorales. Además el extremo 5' de las islas CpG es más resistente a esta metilación accidental que el extremo 3'. Nuestro segundo objetivo fue determinar qué relación hay entre islas CpG y el promotor del gen asociado a ella, y además analizar si los promotores de genes homólogos asociados a islas CpG están conservados entre humanos y ratón. Para responder a estas preguntas, analizamos por footprinting in vivo la región 5' de las islas CpG de los genes APRT, ADA y RNA-Telomerasa en humanos y ratón y del gen alfa-globina humano. En todos ellos las interacciones DNA- proteína se detectaron en la región de DNA comprendida entre el extremos 5' de las islas CpG y el punto de inicio de la transcripción del gen. Además el patrón de interacciones DNA-proteína y la organización general de los promotores no está conservada en los genes homólogos humanos y de ratón analizados. Esta deivergencia evolutiva en las regiones reguladoras contrasta con el alto nivel de conservación de las regiones codificantes. DESCRIPTORES: Metilación del DNA/islas CpG/promotor/transcripción/evolución

Autor: PÉREZ MANCERA PEDRO ANTONIO.
Año: 2001.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA/CENTRO INVESTIGACIÓN CANCER.

Resumen: La traslocación cromosómica t(12;16)(q13;p11), que produce el gen de fusión que codifica la proteína quimérica FUS-CHOP, está asociada al liposarcoma mixoide humano. En nuestro grupos se generó un modelo de ratón transgénico FUS-CHOP, el cual expresaba de manera ubicua el transgén bajo el control del promotor del factor de elongación 1alfa. El análisis de estos ratones mostró que, a pesar de la expresión ubicua del transgén, únicamente desarrollaron liposarcomas mixoides, indicando que FUS-CHOP estaba íntimamente relacionado con la patogénesis del liposarcoma mixoide. Posteriormente, pudimos comprobar que el dominio FUS desempeñaba un papel esencial en las acciones mediadas por FUS-CHOP, ya que los ratones transgénicos CHOP no desarrollaron ningún tipo de tumor y tenían un desarrollo del WAT esencialmente normal, y la destrucción del dominio quimérico resultante de la fusión génica en ratones transgénicos CHOP-FUS no produjo cambios en el fenotipo de estos ratones. Para completar este estudio, en el presente proyecto doctoral, nosotros hemos demostrado que ambos dominios son imprescindibles para la génesis del liposarcoma, ya que los ratones transgénicos FUS no desarrollan liposarcomas y tienen un desarrollo del WAT normal, y que además, los dominios FUS y CHOP actuan de manera independiente, ya que la generación de animales doble transgénicos FUSxCHOP presentan el mismo fenotipo que los ratones transgénicos FUS-CHOP. Por otra parte, mediante un estudio genómico-funcional hemos comprobado que el bloqueo de la diferenciación a dipocítica que sufren los ratones transgénicos FUS-CHOP podría ser producido por un descenso en el tejido adiposo blanco de los niveles de PPARgamma1, RXTalfa y C/EBPalfa. Además hemos demostrado a nivel funcional que la represión de la expresión de p21 y trombospondina-1 por FUS-CHOP tiene un papel fundamental en el fenotipo que presentan los ratones transgénicos FUS-CHOP.

Autor: GRANDA ARIAS BEGOÑA .
Año: 2001.
Universidad: SALAMANCA.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.

Resumen: El desarrollo del Sistema Nervioso Central es un proceso muy complejo que requiere la participación de múltiples señales perfectamente coordinadas. La albúmina está presente en el cerebro y el líquido cefalorraquídeo específicamente durante el desarrollo. En este sentido, se ha descrito la existencia de un mecanismo específico que transfiere la albúmina desde la sangre hasta el líquido cefalorraquídeo que es activo solamente durante el desarrollo. Es evidente, pues, que la presencia de albúmina en este momento tiene una función determinada. Por ello, el objetivo de este trabajo fue estudiar el papel de la albúmina en el complejo proceso del desarrollo cerebral. Para ello empleamos cultivos primarios de astrocitos y neuronas. El cultivo de astrocitos se realizó a partir de cerebro de rata de un día de vida postnatal y el de neuronas a partir de cerebros de fetos de 17,5 días de gestación. Nuestros resultados indican que la albúmina es internalizada por las principales células presentes en ese momento del desarrollo, los astrocitos y las neuronas, sufriendo posteriormente un proceso de transcitosis. Asimismo, en neuronas, la albúmina promueve la supervivencia neuronal por un mecanismo que implica la secrección de glutamato y de NGF. Por otro lado, la albúmina promueve la síntesis y exportación al medio de ácido oleico, en astrocitos, el cual, acompañado de albúmina es captado por las neuronas promoviendo su diferenciación mediante la inducción de la proteína asociada al crecimiento, GAP-43. El efecto del ácido oleico sobre la expresión de la GAP-43 es un efecto directo mediado por la proteína kinasa C. En resumen, en los primeros estadíos del desarrollo la albúmina promueve la supervivencia neuronal. En un momento posterior del desarrollo, durante el período perinatal, la albúmina promueve en los astrocitos la síntesis y liberación de ácido oleico que es captado por las neuronas provocando su diferenciación.

Autor: MARTÍN DE LA VEGA HERNÁNDEZ CRISTINA.
Año: 2001.
Universidad: ALCALA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: SºBIOQUÍMICA/ DPTº DE INVESTIGACIÓN HOSPITAL UNIVERSITARIO RAMÓN Y CAJAL.

Resumen: La isquemia cerebral se origina por la disminución del flujo sanguíneo hasta un nivel que interfiere con la función del sistema nervioso, la reducción del fujo de todo el cerebro origina una isquemia global. La isquemia provoca un fallo energético en la célula siendo la inhibición global de la síntesis de proteínas una de las principales consecuencias. Esta inhibición se produce además durante la reperfusión sanguínea, a pesar de que se restablece el nivel energético celular. La inhibición de la biosíntesis proteica es el parámetro bioquímico que mejor correlaciona con la recuperación del tejido isquémico puesto que sólo se revierte en las regiones cerebrales que sobreviven al daño isquémico (corteza cerebral) permaneciendo inhibida en las regiones que sufren una muerte neuronal retardada (región CA1 del hipocampo). Puesto que conocer los mecanismos implicados en la inhibición de la síntesis de proteínas es fundamental para la recuperación del tejido isquémico, éste ha sido el objetivo del presente trabajo. Para ello se ha utilizado un modelo de isquemia cerebral global y transitoria en la rata, obteniéndose las siguientes conclusiones: 1- La síntesis de proteínas se inhibe durante la reperfusión sanguínea, estudiada desde su inicio hasta las 6 horas de reperfusión, al nivel de la fase de iniciación. 2,- En la isquemia se produce la desfosforilación de la proteína 4E-BP1 lo que origina un aumento del complejo eIF4E-4E-BP1 y la disminución del complejo activo 4F. 3,- La fosforilación del eIF2alfa se origina al inicio de la reperfusión sanguínea por la pérdida del equilibrio entre la actividad eIF2alfa-quinasa/fosfatasa debido a la inhibición de la actividad alfa-fosfatasa. Este mecanismo, por el que se inhibe la actividad del eIF2B, es reversible y común entre regiones de diferente vulnerabilidad isquémica. 4,- La actividad S6-quinasa se inhibe en la isquemia y al inicio de la reperfusión, únicacmente. 5,- La región CA1 del hipocampo presenta una tasa de reiniciación inferior a la tasa de corteza cerebral y del resto de las regiones del hipocampo a las 6 horas de reperfusión. A pesar de no haber identificado un único mecanismo responsable, esta diferencia puede ser debido a la disminución de los niveles del EIF4E y eIF4G. Podemos indicar por tanto, que la inhibición de la traducción es multifactorial y además, un proceso dinámico ya que los mecanismos descritos presentan un tiempo de aparición y una evolución específica durante la isquemia cerebral transitoria.

Autor: OLIVA MARTÍNEZ JOSÉ LUIS.
Año: 2001.
Universidad: ALCALA.
Centro de lectura: CIENCIAS .

Resumen: La Tesis doctoral, estudia el efecto de la mutación P34G en la proteína Ras sobre la activación de los diversos efectores de esta proteína. Los datos presentado van más allá de un estudio general sobre la función de la proteína Ras, y ahonda en el papel funcional las diferentes isoformas de esta proteína, H-Ras K-Ras y N-Ras. Este tema de gran actualidad, ya que hasta hace poco se pensaba en las diferentes isoformas ejercían el mismo papel biológico. Sin embargo, los datos presentados muestra que H-Ras actúa de una forma diferente a las obras isoformas sobre las transformación celular ya que la mutación P34G afecta de forma diferente la función de las distintas vías señalización inducidas por las proteínas Ras. H-Ras P34G no afecta la vía de la proteína Ra1GDS, mientras que las otras dos isoformas reduce su actividad. Por otra parte, la Tesis muestra el papel de la proteína adaptadora Sur-8 sobre la transformación celular mediada por las diferentes isoformas de Ras. Los datos presentados demuestran de nuevo un papel diferente de la proteína H-Ras respecto a las proteínas K-Ras, N-Ras. La proteína Sur -8 sinergiza con K-Ras y N-Ras. Para aumentar la transformación celular, mientras que no presenta ningún efecto adicional al ejercicio de la proteína H-Ras. Por último se presenta una nueva vía de activación diferencial de las proteínas Ras. Así, el metabolito fisiológico ciclopentenona 15-d-PGJ2, es un nuevo activador específico de H-Ras o N-Ras.

Autor: TRAVÉS POLO CARMEN .
Año: 2001.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: BIOLOGÍA.
Centro de realización: UNIVERSIDAD DE BARCELONA.

Resumen: La apolipoproteína A-IV (APO-A-IV) humana es una proteína sintetizada exclusivamente en el enterocito y liberada al torrente circulatorio lo que permite su cuantificación en plasma o suero. La APO A-IV humana se ha purificado a partir de plasma humano, posteriormente se han obtenido anticuerpos policlonales en conejo y se ha puesto a punto un sistema de cuantificación y detección en plasma o suero, así como en biopsia intestinal de un paciente. Estos métodos han sido Western blot y Elisa tipò Sandwich, además de inmunolocalización. Se estudió el papel de la APO A-IV como marcador del estado de la superficie absortiva efectiva en diferentes situaciones clínicas principalmente pediátricas, donde se han descrito una alteración de la mucosa intestinal. Las situaciones clínicas estudiadas han sido la prematuridad, el síndrome alcohólico fetal, la celiaquía infantil y la nutrición parenteral en adultos. La conclusión general es que en cualquier edad de un individuo, la concentración de dicha proteína en el plasma o suero postabsortivo, puede ser un óptimo indicador del estado de la muscosa intestinal total en la evolución del paciente.

Autor: SERRANO GONZÁLEZ ALICIA.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y DE FORMACIÓN CONTINUADA.

Resumen: El trabajo recoge los principales aspectos de la producción recombinante de una lipasa del hongo Rhizopus oryzae (ROL) expresada en la levadura Pichia pastoris. El sistema de expresión empleado está basado en la utilización del promotor de la alcohol oxidasa (P AOX1) de la levadura y, por lo tanto es dependiente de la utilización de metanol como substrato inductor. El trabajo recoge una serie de estudios de producción en bioreactor, operando en fed-batch, en los que la productividad del sistema se incrementa hasta en un factor de 11, mediante el estudio de la estrategia de adición del metanol a lo largo de la etapa de producción. Asimismo, estos cultivos se han realizado utilizando un medio de composición sintética, mucho más económico que el complejo. La optimización de la producción también se ha abordado mediante la construcción de cepas multicopia para el gen ROL, estudiando igualmente, el efecto de la expresión recombinante de la lipasa sobre la cepa hospedadora. Por otro lado, se han construido vectores de expresión basados en la utilización de promotores independientes de la utilización del metanol. Se han obtenido cepas de P.pastoris que expresan la ROL de forma constitutiva y mediante inducción por fuente de nitrógeno. El trabajo recoge en último lugar un protocolo para la recuperación de la ROL recombinante desde el caldo de cultivo hasta la obtención de un extracto liofilizado de lipasa ROL. La purificación de la lipasa se ha llevado a acabo a través de la combinación de dos pasos de cromatografía, de intercambio catiónico e interacción hidrofóbica. El grado de pureza obtenido es el adecuado para utilización de la enzima como biocatalizador en reacciones de química fina y para la obtención de anticuerpos contra la misma.

Autor: RIERA BONET MARTA.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y DE FORMACIÓN CONTINUADA.

Resumen: INTRODUCCIÓN La proteína quinasa CK2 es una ser/trhr quinasa ubicua y altamente conservada entre especies. Se ha descrito en todas las células eucariotas estudiadas, no obstante, se desconoce tanto su función biológica como su mecanismo de regulación. En humanos presenta una estructura heterotetramerica formada por dos tipos de subunidades: las subunidades catalíticas CK2 alfa y las reguladoras CK2 beta, aunque en maíz hasta el momento de empezar esta tesis no se había descrito existencia de subunidades CK2 beta. En plantas CK2 tiene un efecto pleiotropico dentro de la célula ya que se encuentra implicada en multitud de procesos esenciales para la viabilidad del organismo. Entre los sustratos de CK2 descritos en maíz se encuentra la proteína Rab17. Rab17 es una paroteína de tipo LEA (Late Embryogenesis Abundant) que se acumula en embrión maduro y en respueta a aestrés abiótico y a ABA. Aunque no se ha demostrado su función experimentos previos indicaban una posible función de Rab17 en situación de estrés osmótico regulada por fosforilación por CK2. RESULTADOS La tesis se divide en tres capítulos. El primero consta de dos publicaciones internacionales: Maize protein kinase CK2: regulation and functionality of three beta subunits. Marta Riera, Giovanna Peracchia, Eulalia de Nadal, Joaquin Ariño and Montserrat Pagès. Plant Journal (2001) 25 (4) 365-374 y Distinctive features of plant protein kinase CK2. Marta Riera, Giovanna Peracchia, Montserrat Pagès. Mol. Cel. Biochem. (2001) 227:119-127. En estas publicaciones se describe la caracterización molecular de la proteína quinasa CK2 incluyendo el aislamiento de tres subunidades reguladoras CK2 beta de maíz y una nueva subunidad catalítica. También se incluye una caracterización del holoenzima CK2 de maíz a nivel bioquímico. En el segundo capítulo se estudia la regulación de la función de la proteína Rab17 por fosforilación por la proteína quinasa CK2. Se demuestra que Rab17 interacciona específicamente con las subunidades reguladoras CK2 beta1 y beta3. Además se estudia la localización subcelular de la proteína Rab17 así como de las subunidades CK2 y se comprueba que existe una relocalización de Rab17 en la célula dependiendo de su estado de fosforilación por CK2. También se demuestra una localización subcelular nucleolar de las subunidades beta quedan excluidas de este compartimento. Por último, en el tercer capítulo se aíslan proteínas que interaccionan con la subunidad reguladora CK2 beta1 de maíz. Se trata de proteínas de localización nuclear implicadas en diversos procesos de regulación génica como varios tipos de factores de transcripción, proteínas de reparación del DNA, de unión a RNA, entre otras demostrando que la proteína quinasa CK2 de maíz esta implicada en procesos esenciales para la viabilidad del organismo.

Autor: BRONSOMS FABRELLAS SÍLVIA.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y DE FORMACIÓN CONTINUADA.

Resumen: El PCI, la hirudina y el LCI forman parte de la familia de proteínas pequeñas y ricas en puentes disulfuro, que contiene un gran nombre de biopéptidos con potenciales aplicaciones biotecnologícas, como son los factores de crecimiento, las toxinas, las desintegrinas o los inhibidores de proteasas. La presencia de los puentes disulfuro provoca que la expresión recombinante de estas proteínas sea compleja. En el primer trabajo de la tesis se estudian tres sistemas de producción recombinante: un sistema eucariota (Pichia pastoris) y dos sistemas procariotas (Escherichia coli). Se optimizan varios parámetros para la mejora de su nivel de producción y se buscan sistemas que permitan simplificar su proceso de purificación. E.coli con una producción final de proteína que es 10 veces superior al sistema de partida. En el segundo trabajo se analiza el papel de las regiones precursora del PCI en el plegamiento de la forma madura. Se analiza el proceso de replegamiento oxidativo in vitro de las distintas pro-formas del PCI para caracterizar su influencia sobre la velocidad o eficiencia de plegamiento de la forma madura. También se estudia la influencia de la pro-región N-terminal sobre el proceso de plegamiento in vivo en E.coli del PCI maduro y de una serie de mutantes que presentan un mal plegamiento o un bajo nivel de expresión recombinante. Finalmente se lleva a cabo una caracterización estructural de la forma correspondiente al PCI con la pro-región N-terminal a través de estudios de intercambio protón/deuterio, exoproteólisi limitada, dicroísmo circular y resonancia magnética nuclear. En el último trabajo se analiza el proceso de plegamiento proteico de la hirudina y del LCI mediante el estudio de las reacciones de intercambio protón/deuterio seguidas por espectrometría de masas MALDI-TOF. Se caracteriza la adquisición de estabilidad conformacional durante el proceso de plegamiento de las dos proteínas. Se aíslan un grupo de intermediarios de plegamiento y se determina su estabilidad, la cual cosa permite estudiar las diferencias existentes entre las vías de plegamiento de las dos proteínas. Finalmente se estima la contribución de las interacciones covalentes y no-covalentes en la estabilidad final de la proteína nativa.

Autor: ROHER ARMENTIA NEREA.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y DE FORMACIÓN CONTINUADA.

Resumen: La proteína quinasa CK2 es una serina/treonina quinasa muy conservada y ubicua en organismos eucariotas, implicada en diversos procesos celulares importantes como proliferación y tumorigénesis. El enzima de mamíferos está formado por 2 subunidades catalíticas (alfa y/o alfa') y dos subunidades reguladoras (beta) aunque también se ha descrito la existencia de subunidades catalíticas libres. La regulación de la actividad CK2 no es una regulación clássica mediante segundos mensajeros o fosforilación, de echo la subunidad catalítica tiene actividad constitutiva. Se postula que la regulación se podria llevar a cabo por variación de la localización subcelular mediante interacción con proteínas adscritas a compartimentos subcelulares concretos. La proteína chaperona grp94 (94 kDa-glucose regulated protein) es una proteína de estrés que pertenece a la familia de las hsp90, que se localiza en el Retículo Edoplásmico (RE) de todas las células eucariotas. Se expresa constitutivamente en condiciones normales y se sobreexpresa en situaciones de estrés como depleción de calcio, inhibición de la glicosilación, infección vírica, agentes reductores, etc. Mediante técnicas de Resonancia Plasmónica, Far Western y Pull down demostramos que el dominio carboxilo terminal de grp94 interacciona con la subunidad catalítica de CK2 (CK2alfa) pero no con la subunidad reguladora ni con el holoenzima (alfa2beta2). Se ha podido mapear la región de interacción entre ambas proteínas utlizando diversos mutantes de CK2alfa, así la región se ha delimitado a una región de lisinas (K74-77) muy conservada entre las CK2alfa de distintas espècies. Por otro lado se ha demostrado que grp94 tiene actividad chaperona in vitro sobre CK2alfa y citrato sintasa (CS). Utilizando ensayos de agregación inducida por choc término y técnicas de microscopia electrónica se ha determinado que grp94 es capaz de inhibir la agregación de CK2alfa y CS. La actividad chaperona depende fuertemente del estado de oligomerización de grp94 de forma que en condiciones reductoras en que grp94 pierde su estructura cuaternária su capacidad de inhibir agregación de proteínas está disminuida. Se ha estudiado también la distribución subcelular de CK2 y grp94 en un modelo animal de ratas genèticamente obesas (fa/fa). Estas ratas son hiperinsulinèmicas y resistentes a insulina debido a una down-regulation del receptor de insulina. Se había descrito en celulas en cultivo que el tratamiento con dosis altas de insulina inducía la síntesis de grp94. Se ha observado que no hay variación ni con los niveles ni en la distribución subcelular de grp94 pero si hay variación tanto en los niveles como en la distribución de CK2 que disminuye marcadamente en citosol y aumenta en la fracciones membranosas.

Autor: MOTOS GALLARDO AGATA.
Año: 2001.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y DE FORMACIÓN CONTINUADA.

Resumen: El objetivo principal de ésta tesis fue el desarrollo y aplicación de una metodología mediante espectrometría de masas que permitiera la localización y caracterización de mutaciones en las cadenas de globina que conforman la hemoglobina. De este modo se hizo posible el desarrollo, validación e instauración de un programa inter-hospitalario para la detección de hemoglobinopatías en adultos y neonatos. El método establecido permitió la detección y caracterización de 3 hemoglobinas anómalas. Dos de las cuales se describían por primera vez, dando origen a las siguientes publicaciones: * Estudio de los componentes moleculares de la hemoglobina mediante electrospray (ESI) acoplado a espectrometría de masas (EM). Aplicación a la detección del aminoácido responsable de la mutación en la hemoglobina S. Química Clínica 2001; 20(2):57-63. * Direct peptide mapping of real samples containing sickle cell and fetal hemoglobin by electrospray mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry 2000, 14, 2328-2329. * Identification and characterization by high-performance liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry of a new variant hemoglobin, Mataró [beta134(H12) Val> Ala]. Journal of. Mass Spectrometry 2001;36:943-949. * Characterization of a new hemoglobin variant: Hb Badalona [beta 31(B13) Leu > Val]. Annals of Hematology 2002; 38;59-68.

Autor: CARRILLO DE LA FUENTE JUAN JOSÉ.
Año: 2000.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FARAMCIA.
Centro de realización: DPTO. DE BIOQUIMICA. FACULTAD DE MEDICINA.UAM.

Resumen: Los hepatocitos de rata en cultivo primario sufren un proceso de desdiferenciación. Por ello, en una primera etapa estudiamos el perfil fenotípico de la vía glucolítica/gluconeogénica en hepatocitos en cultivo. Así, observamos que se producía una rápida disminución de los nivels de actividad y mRNA de los enzimas clave de la vía gluconeogéncia durante la evolución del cultivo. Estos cambios llevan a una marcada disminución de la capacidad gluconeogénica de los hepatocitos en cultivo en un plazo de 24 horas. Por otra parte se estudió la resitencia a insulina, tanto a corto como a largo plazo, en cultivo primario de hapatocitos de ratas obesas Zucker (fa/fa). Estos mantienen en cultivo primario su fenotipo característico a nivel de la vía glucolítica/gluconeogéncia, durante al menos 24 horas. Además, presentan resistencia de la vía glucolítica/gluconeogéncia a la modulación por sinsulina en sus acciona a corto plazo, fque se manifesta en ausencia de inhibición significativa por insulina de la gluconeogénesis y de la producción hepática de glucosa (glucogenolisis más gluconeogénesis), acompañada de una falta de activación de la PFK-2 y ausencia de cambios en la concentración de F-2,6-P2. En cuanto a las acciones a largo plazo de la insulina, se observó resistencia a la modulación de la actividad PEPCK y la expresión de su correspondiente mansajero. Por último, se estudiaron las vías de señalización implicadas en la activación a corto plazo de la PK-L por insulina. Así, se observó que en este proceso se requiere la activación de las vías de señaización de la p44/p42 MAPK y de la PI3-K. Además, es posible que sea necesaria la activación de la PKB, mientras que podemos descartar la participación de la p70 S6-K.

Autor: MAESTRO GARCIA-DONAS BEATRIZ.
Año: 2000.
Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
Centro de lectura: FARMACIA.
Centro de realización: CENTRO DE INVESTIAGIONES BIOLOGICAS.

Resumen: El plásmido pPS10, aislado originalmente de Pseudomonas syringae pv sabastanoi, es también capaz de replicarse eficientemente en estripes relacionadas como P.aernuginosa y P.putida. Sin embargo, no es capaz de replicarse en especie diferentes como Escherichia coli. El inicio de la replicación de pPS10 implica la acción concertada de factores plasmídicos, tales como la proteína de replicación RepA y las secuencias nucleicas (iterones) del origen de replicación, así como de otros factores del huésped. En esta Tesis Doctoral se ha profundizado enla identificaión de factores plasmídicos y factores codificados por la bacteria hospedadora que determinan el rando de huésped de pPS10. A tal fin, se han realizado experimentos de mutagénesis al azar de pPS10 y del cormosoma de Escherichia coli, aislándose mutantes que permiten el establecimeinto efectivo del plásmido en este microorganismo. Nuestros resultados indican que la modificaicón del rango de huésped de pPS10 puede conseguirse a través la mutación de RepA y del operador que regula su expresión, así como, al menos, a través de la proteína DnaA del huésped, lo que indica que el rango de huéspede de los plásmidos está regulado por múltiples factores que favorecen, en última instancia, la formación del complejo iniciador de la replicación. Por último, los derivados mutantes de pPS10 son capaces de establecerse en otras especies además de E. Coli, como Alcaligenes faecalis y Agrobacterim tumerfaciens, lo que abre nuevas perspectivas sobre la utilizaciónd e estos derivados con aplicaciones biotecnológicas.

Autor: MORAL NARANJO M. TERESA .
Año: 2000.
Universidad: MURCIA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGÍA.

Autor: BORGE ÁLVAREZ JOSÉ JAVIER.
Año: 2000.
Universidad: OVIEDO.
Centro de lectura: QUIMICA.
Centro de realización: FACULTAD DE QUÍMICA.

Resumen: Las funciones buscadoras de imágenes son herramientas muy útiles en cristalografía macromolecular. Se ha estudiado su aplicación en elmétodo del reemplazo molecular. Una función buscadora de imágenes puede utilizarse como un criterio de ajuste entre el mapa de Patterson del cristal y un conjunto de vectores obtenido de un mapa de Patterson calculado a partir del modelo. Se ha jobservado que existe una fuerte dependencia entre el comportamiento de las funciones buscadoras de imágenes y los valores de ciertos parámetros estadísticos de ambos mapas. Se ha establecido un algoritmo que permite obtener eficazmente el conjunto apropiado de bectores del modelo. Como consecuencia de la combianción de los dos resutlados precedentes, se ha propuesto una nueva función de rotación basada enprocedimientos vectoriales. Esta metodología se ha implementado en un programa de cálculo llamado OVIONE.

Autor: GUTIÉRREZ RODRÍGUEZ ÁNGEL.
Año: 2000.
Universidad: OVIEDO.
Centro de lectura: QUIMICA .
Centro de realización: FACULTAD DE QUÍMICA.

Resumen: La azurina es una protéina pequeña que forma parte de la cadena respiratoria de algunas células, función que realiza mediante un ión cobre (II) capaz de almacenar un electrón modificado así su estado de oxidación. Este ión se encuentra próximo a la superficie de la molécula rodeado por una zona que tiene unmarcado carácter hidrofóbico, lo que parece tener relación con la transferencia del electróna otras moléculas de azurina. La determinación de la estructura de azurinas conmutaciones en esa zona permite estudiar la relación entre la estructura y su función. Han sido cristalizados varios mutantes de azurina mediante la técnica de jdifusión de vapor y la aplicación de siseños factoriales en la búsqueda de las condiciones óptimas de critalización. Adicionalmente, las mismas técnicas han permitido la obtención de cristales de dos formas de creatina quinasa. Se ha determinado la estructura mediante difracción de rayos X de monocristal de dos mutantes de azurina, uno de la zona hidrofóbica (Met44Phe) y otro de sus alrededores (Glu91Gln). Ambas estructuras han sido resueltas utilizando la técnica de reemplazo molecular y refinadas tanto mediante el refinamiento convencional como con temple simulado. La reducción de datos cristalográfica puede ser considerada como un proceso clave enla determinación estructural si se tiene encuenta que los datos generados son utilizados por el resto de las etapas de resolución y refinamiento. El hecho de que durante el experimento se pierda la mitad de la información (en forma de fases de los factores de estructura) aumenta la importancia de la calidad de los datos que puedan ser obtenidos en este proceso (en forma de módulos de los factores de estructura, ya que toda inforamciónposterior sobre las fases se va obtener de las mgnitudes de los mismos. El programa THE REFLEX lleva a cabo el proceso conocido como reducción de datos a partir de un fichero generado por un difractómetro Nonius CAD4. Esto incluye el análisis de perfiles, integración, correción de deriva, corrección de Lorentz y de polarización y genera un fichero de reflexiones que puede ser utilizado por los progrmas más usuales de resolución y refinamiento. El programa realiza igualmente muchas funciones útiles durante el proceso de tratamiento de datos experimentales. Se ha concebido como un programa versátil y fácilmente modificable por su estructura modular.