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PROTEINAS, 8



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  • INHIBIDORES DE SERINPROTEASAS: ESTUDIOS ESTRUCTURALES DE COMPLEJOS TRIPSINA-INHIBIDOR .
    Autor: SANTIAGO GARCIA RAFAEL.
    Año: 2000.
    Universidad: OVIEDO.
    Centro de lectura: QUIMICA.
    Centro de realización: FACULTAD DE QUIMICA.
    Resumen: Mediante la aplicación de la difracción de Rayos X se han estudiado en este trabajo diversos complejos Proteína-Inhibidor. En todos los casos, la proteína objeto de estudio, que pertenece a la familia de las serinproteasas, es la Tripsina Bovina. Este enzima digestivo presenta un gran interés en los estudios estructurales debido a las semejanzas que presenta con otros enzimas de la misma familia, especialmente en los residuos que forman la zona catalítica del enzima y a su disponibilidad comercial. De esta forma, la tripsina bovina puede ser un punto de estudio inicial como subsitutivo de enzimas como el Factor Xa, dificil de obtener y con elevado precio comercial. Gracias a esta semejanza, se ha podido estudiar la unión de un inhibidor, aislado y purificado por primera vez, proveniente de semillas de girasol y que presenta una estructura biblica poco habitual. Se han desvelado la forma de unión del mismo a la tripsina bovina, así como su afinidad por otros enzimas de la misma familia. En colaboración con una empresa de Biotecnología británica se han determinado también las estructuras de diversos complejos Tripsina-Inhibidor, donde la molécula del inhibidor procede de los laboratorios de la compañía farmacéutica y se encuentran en su mayoría en vías de desarrollo como fármacos de próxima comercialización en la lucha contra enfermedades como asma o trombosis. Como complemento a estos estudios estructurales se ha estudiado también la unión de otras moléculas orgánicas en el centro activo del enzima, como punto de inicio del diseño de nuevos fármacos, más potentes que los conocidos. Para la realización de estos estudios se ha utilizado el difractómetro de ánodo rotatorio y detector tipo Image Plate de la Universidad de Bristol, con la que ha existido una colaboración muy estrecha, así como las instalaciones del SRS de Daresbury. Se ha puesto a punto el nuevo difratómetro de monocristal. Nonius Kappa CCD de la Universidad de Oviedo, obteniéndose resultados tanto de macromoléculas como de compuestos de menor tamaño. Se ha incluido, al final de la memoria, un resumen de algunos estudios estructurales sobre moléculas de tamaño medio realizados en el grupo de Rayos X de la Universidad de Oviedo de forma paralela a los estudios de macromoléculas por su elevado interés biológico.
  • ESTUDIO DE LA EXPRESION DE PROTEOGLICANOS EN MELANOMA HUMANO Y SUS IMPLICACIONES FUNCIONALES.
    Autor: TOVAB MALIKA.
    Año: 2000.
    Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
    Centro de lectura: VETERINARIA.
    Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y DE FORMACION CONTINUADA.
    Resumen: En la presente tesis e ha estudiado la presencia de proteoglicanos en diferentes lineas celulares de melanoma humano. Uno de los proteoglicanos identificados en estas lineas es el versicano, un proteoglicano identificado anteriormente en fibroblastos. La presencia de versicano esta correlacionada con el grado de diferenciacion celular. Asi, en las lineas celulares menos diferenciadas se ha detectado tres isoformas del versicano mientras que en las celulas de diferenciacion intermedia solamente se expresan dos isoformas. Las lineas muy diferenciadas no presentan ninguna isoforma. A partir de aquí se ha llevado a termino un estudio de los efectos que provocan el versicano y otro proteoglicano especifico de melanoma(mel-CSPG) sobre lineas celulares de melanoma y astrocitoma. Por este mismo se llevaron a termino estudios de proliferacion, adhesion y migracion celular. En estos estudios se ha observado que los dos proteglicanos estimulan la proliferacion celular y que disminuyen la adhesion a diferentes sustratos. En el caso de la migracion, los efectos son diferentes. Asi, en el caso de versicano se observa solamente un aumento de migracion cuando se utiliza la proteina nucleo, mientras que no se observa ningun efecto utilizando el versicano entero. En cambio, en el caso del proteglicano especifico de melanoma mel-CSPG tanto la proteina nucleo como el proteoglicano entero estimulan la migracion celular. Finalmente, en la ultima parte del trabajo, hemos descrito la localizacion y la intensidad de expresion de los proteoglicanos versicano y mel-CSPG en una serie de lesiones melanociticas benignas y malignas. Asi pues en los nevus benignos no hemos detectado ninguna expresion ni de versicano ni de mel-PG, en cambio, en los nevus displasicos, el comportamiento de estos dos antigenos es diferentes. Asi pues, en el caso de versicano, la intensidad de expresion depende del grado de atipia, mientras que la expresión de mel-PG es más amplia y se observa en los tres tipos de nevus displásicos de forma similar. En los melanomas malignos primarios y metastaticos, hemos encontrado un aumento claro en la intensidad de expresion tanto para versicano como para mel-PG. Estos resultados concuerdan con los anteriores confirmando que la expresion de versicano correlaciona con el grado de diferenciacion celular. Los resultados obtenidos en el presente trabajo, tanto los que indican que versicano y mel-PG participan en el control de la adhesion, migracion y proliferacion celular, como los resultados unmunohistoquimicos que revelan el incremento de la expresion de estos dos proteoglicanos en los melanomas malignos y metastaticos, sugieren que tanto versicano como mel-PG podrian tener un papel en la progresion tumoral de las lesiones melanociticas. Como resumen podemos concluir que la expresion de mel-PG y versicano aumenta con la progresion de los melanomas malignos. Por esta razon, y porque se ha obsrvado que in vitro estos dos proteoglicanos tienen varias propiedades que podrian relacionarse con el fenotipo maligno, es probable que la expresión de estos marcadores podría tener un valor diagnóstico y pronóstico.
  • STRUCTURE-BASED PREDICTION OF PROTEIN FUNCTION.
    Autor: ALOY CALAF PATRICK.
    Año: 2000.
    Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
    Centro de lectura: CIENCIAS.
    Centro de realización: EDFC.
    Resumen: Esta tesis esta basada en el campo de la biologia carpitacional. En ella se desarrollan diversos metodos automaticos, que pueden ser aplicados a genomas completos, para el estudio de las relaciones entre la seguencia, la estructura y la funcion de las proteinas.
  • THEORETICAL CALCULATIONS APPLIED TO THE BIOINORGANIC MODELING OF COPPER PROTEINS .
    Autor: CUCURULL SANCHEZ LOURDES.
    Año: 2000.
    Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
    Centro de lectura: CIENCIAS.
    Centro de realización: ESCOLA DEL DOCTORAT I FORMACIO CONTINUADO.
  • PROTEIN ENGINEERING OF POTATO CARBOXYPEPTIDASE INHIBITOR (PCI). ANALYSIS OF THE STRUCTURAL DETERMINANTS IMPORTANT FOR ITS FOLDING AND FUNCTION; CONSTRUCTION OF BIFUNCTIONAL INHIBITORS.
    Autor: VENHUDOVA GABRIELA.
    Año: 2000.
    Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
    Centro de lectura: CIENCIAS.
    Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y DE FORMACION CONTINUADA.
  • IODACIÓN DE BIOMOLÉCULAS; ESTUDIO DE UN NUEVO MÉTODO DE IODACIÓN DE PÉPTIDOS Y PROTEÍNAS CON EL REACTIVO IPY2 BF4 .
    Autor: ESPUÑA NOVELL GEMMA.
    Año: 2000.
    Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
    Centro de lectura: MEDICINA.
    Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y DE FORMACIÓN CONTINUADA.
    Resumen: En este trabajo se establecen las bases de un nuevo método de iodación de péptidos con el reactivo tetrafluoroborato de bis(piridina)iodonio (I) (IPy2BF4), que podría llegar a ser una alternativa a los métodos de radioiodación actuales. El reactivo se ha aplicado para la iodación de tirosina en péptidos anclados en un soporte sólido. Esta iodación representa la primera sustiución electrofílica aromática en fase sólida y permite la iodación selectiva de una tirosina en péptidos que contienen diversas tirosinas, mediante el uso de estrategias de protección ortogonal del hidroxilo fenólico. Se ha conseguido un control de la extensión de la iodación que da lugar a derivados monoiodados de la tirosina cuantitativamente y la iodación directa de Phe en secuencias peptídicas. Se describen también unas primeras aplicaciones del reactivo en la química de proteínas.
  • PROTEINAS DE DEFENSA COMO POTENCIALES PANALERGENOS VEGETALES: QUITINASAS DE CLASE I Y PROTEINAS DE TRANSFERENCIA DE LIPIDOS.
    Autor: DIAZ PERALES ARACELI.
    Año: 2000.
    Universidad: POLITECNICA DE MADRID.
    Centro de lectura: INGENIEROS AGRONOMOS.
    Centro de realización: ETSI AGRONOMOS DE MADRID.
    Resumen: La alergia a alimentos vegetales ha aumentado en los años. Para poder solucionar este problema, es necesario la identificación y caracterización de los agentes responsables de ello. En este trabajo, se han caracterizado a las quitinasas de clase I como los panalergenos responsables de las reacciones cruzadas entre el latex y algunos alimentos. La base de dichas reacciones radica en la homología entre el dominio aminoterminal de las enzimas mencionadas y el alergeno mayoritario del latex, la heveína. Por otra parte, estos alergenos pertenecen al grupo de las proteinas de defensa y por tanto, son inducibles tanto por estrés biotico como abiotico. En este trabajo se ha demostrado que algunos tratamientos que se emplean de forma comercial para acelerar la maduración de frutos en camaras podrían estar aumentando los niveles de alergenos en el alimento. Ademas, las quitinasas de clase I pierden su reactividad alergenica por calor, lo cual explicaria por que los alimentos más asociados con alergia al latex son aquellos que se consumen crudos. Por otra parte, la consensibilización a frutas de rosaceas, semilla de castaña y polen de artemisia es debida, al menos en parte, a miembros de la familia de las proteinas de transferencia de lipidos. Estas proteinas tambien son proteinas de defensa,y por ellos, el demostrar su reactividad alergenica tanto "in vivo" como "in vitro", podría ser beneficioso tanto para el diagnostico de la alergia a manzana y melocotón, como prevenir dicha alergia.
  • ESTUDIO BIOCOMPUTACIONAL DE SECUENCIAS DE BETA-GLUCOSIDASAS Y GLICOSIL HIDROLASAS ESTRUCTURALMENTE RELACIONADAS .
    Autor: ROJAS PÉREZ ANTONIO.
    Año: 2000.
    Universidad: ROVIRA I VIRGILI.
    Centro de lectura: QUÍMICA .
    Centro de realización: FACULTAD DE QUÍMICA.
    Resumen: Las b-glucosidasas (EC 3.2.1.21) son enzimas que catalizan la hidrólisis de alquil y aril B-D-glueósidos y glicósidos como el disacárido celobiosa que contienen sólo resíduos de carbohidrato. Estas enzimas son miembros de las familias 1 y 3 de la super-familia de las glicosil hidrolasas, de la que se han descrito 81 familias en base a similaridades de secuencias de aminoácidos. Además de las b-glucosidasas, las familias 1 y 3 incluyen otras flicosil hidrolasas de diferentes actividades enzimáticas. El objetivo de este estudio es contribuir al conocimiento de las relaciones evolutivas moleculares existentes entre las enzimas de estas familias, meidante el análisis combiando de sus secuencias de aminoácidos y de sus correspondientes DNA codificantes. A apartir de las bases de datos se obtuvo un conjunto de secuencias de proteínas : 115 para la familia 1 y 66 para la familia 3. Los multialineamientos se llevaron a cabo usando los programas: PILEUP, disponible en el software del paquete informático GCG y CLUSTALW. El servidor on-line PREDICT-PROTEIN se utilizó para calcular la propensión de los resíduos al estado de hélice a, lámina b o lazo, para cada secuencia de aminoácidos.Este estudio computacional aporta un sumario de propiedades estructurales de estas enzimas, a través de los correspondientes multialineamientos y árboles filogenéticos. Se demuestra que el mecanismo evolutivo para ambas familias enzimáticas 1 y 3, es un proceso de divergencia parsimoniosa a partir de un antecesor común y se desarrolla un nuevo enfoque analítico en filogenia de proteínas, en orden a la correción de la degeneración del código genético. Se describen diversos "frameshfts" en genes de B-glucosidasas de: Erwinia herbicola, Cellulomonas fimi, Triflium repens, Clostridium stercoraium y C. Thermocellum. Los resultados de la investigación ponen de manifiesto que el fen de la B-glucosidasa de Kluyveromyces failis ha sido adquirido vía un episodio de transferencia génica, siendo el donante una especie del tipo Agrobacterium. Mediante el estudio de motivos conservados en las regiones N- y C-terminales de las enzimas de la familia 3 son detectadas y analizadas permutaciones circulantes ocurridas en las B-glucosidasas de Buyrivibrio fibrisolvens y Ruminococcus albus, la existencia de las cuales unida al hecho concreto del resíduos invariantes, permite postular una arquitectura modular para las B-glucosidasas de la familia 3, basada en una topología de tres dominios: un barril (b/a) 8 catalíticamente autónomo en la región N-terminal, un dominio (a/b)6 y una región "todo beta" n la zona C-terminal.
  • MAPEO EPITÓPICO DEL ALERGENO PRINCIPAL DEL POLEN DE OLIVO .
    Autor: GONZÁLEZ FERNÁNDEZ EVA M..
    Año: 2000.
    Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
    Centro de lectura: QUÍMICA.
    Centro de realización: FACULTAD DE CC. QUÍMICAS.
    Resumen: El trabajo de investigación presentado en esta memoria ha tenido como objetivo la localización de los determinantes antigénicos del alergeno principal del polen de olivo, Ole e 1. Este estudio se ha abordado mediante el empleo de diversas estrategias y herramientas inmunológicas. Los estudios con anticuerpos monoclonales y policlonales específicos de Ole e 1 han permitido la detección de diferentes determinantes antifénicos de la proteína algunos de los cuales solapan con las regiones de unión de los anticuerpos IgE presentes en los sueros de pacientes alérgicos a olivo. La mayor parte de estos determinantes presentan un carácter discontinuo cómo se ha demostrado mediante estudios inmunológicos sobre la proteína modificada químicamente. El alto poliformismo detectado en la secuencia de aminoácidos de Ole e 1 así como la existencia de proteínas homólogas a ella en los pólenes de otras oleáceas, tales como la lila y el aligustre, ha permitido la utilización de otras aproximaciones en este estudio. La producción de estas proteínas homólogas y de diversas isoformas de Ole e 1 como moléculas recombinantes en la levadura Pichia pastoris nos ha permitido disponer de moléculas homogéneas y en grandes cantidades para la realización de estudios comparativos, tanto in vivo como in vitro, de las propiedades inmunológicas de estas moléculas. De estos estudios se ha deducido por un lado, una gran variabilidad de los epítopos reconocidos por los distintos pacientes sobre Ole e 1, y por otro, se han identificado isoformas de Ole e 1 que presentan una reactividad disminuida frente a los sueros de pacientes alérgicos, lo cual es de especial relevancia para fines terapéuticos. Por último, la obtención depéptidos sintéticos y recomibantes de Ole e 1 ha facilitado la localización de diversos determiantes antigénciso en la secuencia de la proteína, así como la identificación de un epítopo alergénico localizado en el extremo C-terminal de la molécula. Los péptidos recombinantes producidos presentan una escasa capacidad de unión a las IgE de pacientes sensibles a olivo, reteniendo sin embargo buena parte de los epítolos IgG de la molécula lo que los convierte en potenciales candidatos en el diseño de nuevas formas de terapia de sensibilización a Ole e 1. Los resultados obtendios en este trabajo han permitido profundizar en el conocimiento de la alergenicidad de Ole e 1, así como abrir el paso al diseño de futuras estrategias en la diagnosis y terapia de la sensibilización al polen de olivo.
  • IMPLICACIONES FUNCIONALES DE LA ASOCIACIÓN DE PROTEÍNAS QUE CONTIENEN DOMINIO SH2 CON UN MOTIVO DE ACTIVACIÓN PRESENTE ENLA SUBUNIDAD CD3-EPSILON DEL RECEPTOR PARA EL ANTÍGENO DE LOS LINFOCITOS T.
    Autor: GUIRADO TORRES MARIA.
    Año: 2000.
    Universidad: GRANADA.
    Centro de lectura: INSTITUTO DE PARASITOLOGÍA Y BIOMEDICINA.
    Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.
    Resumen: En el receptor para el antígeno del linfocito T, TCR/CD3, se encuentra un módulo de señalización formado por las cadenas polipeptídicas CD3-gamma, -epsilon, -delta, -zeta. Estas proteínas contienen motivos de activación basados en tirosina (ITAM), con una secuencia consenso YXX(I/L)X 6-8 YXX(L/I), donde X corresponde con los residuos variables. La fosforilación de estos residuos de tirosina son suficientes para la transducción de la señala a través del TCR. Nuestro proyecto se basa en el estudio señalizador de CD3-epsilon. Esta proteína tiene una secuencia YXXIX7YXXL. Nuestros resultados aprueban la diferencia existente entre las dos tirosinas del ITAM viendo fosforilaciones una vez estimulada la célula, como en las asociaciones de determiandas proteínas señalizadoras, Lck, p85 (PI3-K), Shc tienen una mayor afinidad de unión por la tirosina que se encuentra en el extremo N-terminal, mientras que ZAP-70 se une preferentemente cuando las dos tirosinas del ITAM se encuentran fosforilada. En cuanto a la foaforilación en células estimuladas por medio de anticuerpos específicos podemos decir que existe una regulación distinta, ya se trate de la fosforilación de la tisosina amino o carboxi-terminal, es decir la tirosina carboxi terminal necesita a de la fosforilación de la amino-terminal o también podemos deducir de nuestros resultados que la fosforilación de esta tirosina puede ser rápidamente desfosforilada por la presencia de tirosínfosfatasas. La fosforilación parcial del ITAM de CD-3 durante un tiempo prolongado puede ejercer efectos inhibitorios sobre la señalización mediada por el TCR/CD3. Este efecto es mucho más fuerte cuando las tirosinas implicadas es la N-terminal /Y170F: La fosforilación en tirosina está disminuida, al igual que la fosforilación de Erk y la liberación de calcio; por el contrario la tirosina en posición C-terminal /Y181) solo disminuye la liberación de calcio. La estimación de células Jurkat transfectadas con la quimeras CD-8, la estimulación a través del receptor quimérico induce la agregación y la acumulación de las quiméricas en un solo polo de la células. Esta acumulación es mucho más frecuente en células tipo salvaje CD8 wt que presentan las dos tirosinas del ITAM, y en la quimera que tiene la 2ª tirosina del ITAM mutada, Y181F, que las quimeras que tienen las dos tirosinas mutadas Y181F/Y170Fo la 1ª tirosina mutada Y170F. Igualmente la estimulación de las células CD8-e en las condiciones indicadas anteriormente induce la redistribución de la tisosina Lck en agregados discretos con el mismo patrón de distribución que de las quimeras. Igualmente induce la translocación parcial de la tirosina quimasa ZAP-70 a la membrana celular, en zonas discretas que coinciden con las zonas de acumulación de las quimera, en particular en aquellas células en las que las quimeras se agregan en un solo polo.
  • ESTUDIO Y CARACTERIZACIÓN DE LA AGLUTAMATO DESHIDROGENASA DE STREPTOMYCES CLAVULIGERUS .
    Autor: MIÑAMBRES RODRÍGUEZ BALTASAR.
    Año: 2000.
    Universidad: LEON.
    Centro de lectura: VETERINARIA.
    Centro de realización: FACULTADES DE BIOLOGÍA Y VETERINARIA.
    Resumen: En el presente trabajo se ha descrito, por primera vez, una nueva clase de glutamato deshidrogenasas (GDHs). La GDH de Streptomyces clavuligerus ha sido purificada a homogeneidad y se ha caracterizado bioquímica, cinética y genéticamente. Posee una masa molecular nativa (Mr) de 1.100 kDa y está constituida por seis subunidades idénticas (a6) de 183 kDa cada una. Esta GDH, que requiere AMP como activador indispensable, exhibe una máxima velocidad de catálisis en tampón fosfato 100 mM a pH 7 y a 30ºC. En estas condiciones, siguen una cinéica de saturación hiperbólica con el amonio (Km = 33 mM) y sigmoide con el a-cetuglutarato (So,5 =1,3 mM, nh =1,5) y con el NADH (So = 20 uM, nh = 1,5). El aspartato y la asparragina son activadores de los téricos de esta enzima, que además, es inhibida por exceso de los sustratos NADH y NH4+, por algunos intermediarios del ciclo de los ácidos tricarboxílicos, por ATP y por Tris. Su función fisiológica parece ser catabólica ya que es específica de NAD+, posee un elevado valor de Km para el amonio y su máxima expresión se obtiene en un medio de crecimiento que contiene glutamato como únicas fuentes de carbono y de nitrógeno. La GDH de S. Clavuligerus es una proteína de 1.651 aminoácidos y está codificada por un fragmento de DNA de 4.953 pb (gen gdh). Exhibe un elevado porcentaje de homología con proteínas codificadas por ORFs, hasta el momento de función desconocida, presentes en el genoma de especies bacterianas de los géneros Mycobacterium, Rickettsia, Pseudomonas, Vibrio, Shewanella y Caulobacter, lo que sugiere que este nuevo tipo de enzimas se encuentra apliamente distribuido entre las bacterias. Además, en este trabajo, se estudian las relaciones filogenéticas entre los diferentes tipos de GDHs y se propone una hipótesis que explica su origen, su evolución y su distribución en los organismos actuales.
  • OBTENCIÓN DE CEPAS DE ASPERGILLUS AWAMORI MODIFICADAS GENÉTICAMENTE PARA LA PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS HETERÓLOGAS .
    Autor: MORALEJO LORENZO FRANCISCO JOSE.
    Año: 2000.
    Universidad: LEON.
    Centro de lectura: BIOLOGIA .
    Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGÍA.
    Resumen: Los hongos filamentosos son ampliamente utilizados para la producción de proteínas heterólogas gracias a su elevada capacidad secretora. En esta Tesis Doctoral se describe el desarrollo de un sistema para la producción en Asperigillus awamori de la proteína taumatina. Esta aparece ne los frutos de la planta tropical Thaumatococcus daniellii y se caracteriza por poseer un sabor 10.000 veces más dulce que la sacarosa, por lo que existen gran interés en su producción industrial. A nivel genético se han utilizado varias estrategias para optimizar la transcripción del gen de la taumatina, como el uso de un gen sintético con uso de codones optimizado para hongos,la fusión con un gén fúngico que codifica para una proteína extracelular eficientemente secretada y la utilización de regiones promotoras fúngicas de alta expresión. Utilizando estas estrategias se observó producción de taumatina por numerosos transformantes, sin embargo ésta era degradada intensamente por proteasas producidas por el hospedador. Mediante mutagénesis al azar se seleccionaron transformantes con menor actividad proteolítica que la cepa silvestre y una de ellas, el mutante Ipr66, mostraba una inserción en el gen pepA, que codifica para la aspergilopepsina A lo que daba lugar a una proteína no funcional. Igualmente, mediante doble recombinación se interrumpió el gen pepB, que codifica para la aspergilopepsina B, obteniéndose cepas con muy baja actividad proteolítica y que daban lugar a elevados rendimientos de taumatina. En las cepas de elevada producción se observó una retención intracelular de tauamtina, lo que indicaba la existencia de un cuello de botella en su secreción. Un aumento moderado de los niveles de proteína disulfuro isomerasa en el retículo endoplásmico incrementó la secreción de taumatina mientras que un aumento superior daba lugar a una reducicón de su secreción por un efecto antichaperón.
  • BIOLOGIA MOLECULAR Y CARACTERIZACION INMUNOLOGICA DE DOS ALERGENOS PRINCIPALES DEL POLEN DE OLIVO. OLE E 1 Y OLE E 9 .
    Autor: HUECAS GAYO SONIA.
    Año: 2000.
    Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
    Centro de lectura: QUIMICA.
    Centro de realización: FACULTAD DE CC QUIMICAS.
    Resumen: En el presente trabajo de investigación se ha producido una isoforma (clon 3c) y un mutante no glicosilado de Ole e 1, alergeno principal del polen de olivo, como proteinas recombinantes en la levadura P.pastoris. Las proteinas recombinantes obtenidas son secretadas al medio extracelular por la levadura a partir de donde se han purificado, mediante dos etapas cromatograficas,con un alto rendimiento. Se ha realizado la caracterización molecular, estructural e inmunologica de las proteinas recombinantes, demostrandose su equivalencia con la proteina natural. Tambien, se ha validado la eficacia de la forma recombinante de Ole e 1 en el diagnostico de los pacientes alergicos a olivo. Por otro lado, se ha purificado un nuevo alergeno del polen de olivo, Ole e 9, a partir del extracto salino, mediante tres etapas cromatograficas. El alergeno Ole e 9 es una glicoproteina acida, constituida por una unica cadena polipeptidica con una masa molecular de 46,4 kDa, que presenta polimorfismo y que se expresa exclusivamente en el polen. El estudio de la frecuencia de sensibilización de los pacientes alérgicos a polen de olivo a este nuevo alergeno ha mostrado que se trata de un alergeno principal. Mediante clonación de su cDNA se ha determinado su secuencia primaria y uno de los clones obtenidos ha sido producido de forma recombinante en la levadura P.pastoris. Ole e 9, ademas de presentar actividad alergénica, presenta actividad endoglicolitica como se ha demostrado mediante los correspondientes ensayos enzimáticos. El trabajo de investigación presentado en esta memoria ha aportado una serie de resultados que han permitido, por un lado, validar el sistema de expresion en la levadura P.pastoris para la produccion de alergenos que presentan modificaciones postraduccionales,como Ole e 1 y Ole e 9, y por otro lado, se ha logrado el aislamiento, la caracterizacion molecular e inmunologia, y la producción recombinante de un nuevo alergeno principal del polen de olivo.
  • ESTRUCTURA, PROCESAMIENTO PROTEOLITICO Y ACTIVACION DE LA PROTEINA F DEL VIRUS RESPIRATORIO SINCITIAL HUMANO .
    Autor: GONZALEZ REYES LUIS.
    Año: 2000.
    Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
    Centro de lectura: QUIMICA.
    Centro de realización: FACULTAD DE CC. QUIMICAS.
    Resumen: La glicoproteina F del virus respiratorio sincitial humano fusiona las membranas viral y celular. La proteina F y un mutante al que se han eliminado la region transmembrana y citoplasmatica (F TM-) se expresaron a partir de vaccinias recombinantes y se purificaron por cromatografia de inmunoafinidad. Mediante el analisis del comportamiento en SDS-PAGE, reactividad frente a anticuerpos monoclonales, susceptibilidad a digestion con tripsina, comportamiento en ultracentrifugacion en gradientes de sacarosa y microscopia electronica, se determino que las proteinas F y F TM- tienen una estructura similar, por lo que el ectodominio de la proteina se pliega independientemente. Mediante microscopia electronica se identificaron dos conformaciones de la proteina que, probablemente, correspondan a las formas pre- y post-activas. Estudios de inmunomicroscopía electronica de la proteina F dieron información de la localización en la estructura tridimensional de los sitios antigénicos de la proteina. La caracterización de la forma sin procesar (FO), parcialmente procesada (F A1-109) y totalmente procesada (F1+F2) de las proteinas F TM- y F mediante reactividad frente a sueros especificos, secuenciacion N-terminal y espectrometria de masas, demostro que la proteina F sufre un doble procesamiento proteolítico durante su maduración (tras el residuo 109, sitio I y el residuo 136, sitio II). El corte en ambos sitios es independiente, como se determinó mediante mutagenesis dirigida, pero posiblemente primero se produzca en el sitio I. Además, por ensayos de inmunoprecipitacion con un suero especifico de las formas FO y Fa1-109, se determinó que F1+F2, y F0 y/o F A1-109 pueden cooligomerizar en el trimero de proteina F TM-y que el peptido entre los dos sitos de procesamiento no se encuentra en la proteina madura. Por ultimo, preparaciones de proteina F TM-procesadas en el sitio II aparecieron con la conformacion post-activa, lo que sugiere que el procesamiento proteolitico tras ese sitio es el evento que dispara el cambio conformocional entre las conformaciones pre- y post-activas de la proteina.
  • "LA PROTEINA MED8 CONECTA LA MAQUINA GENERAL DE LA TRANSCRIPCION CON SISTEMAS DE REGULACION DE LA EXPRESION GENICA" .
    Autor: SUAREZ CHAVES M. ROMINA.
    Año: 2000.
    Universidad: OVIEDO.
    Centro de lectura: MEDICINA .
    Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.
    Resumen: Con el fin de identificar y caracterizar nuevos factores transcripcionales implicados en el mecanismo de regulación por glucosa en Sacchromyces cerevisiae se han llevado a cabo en la primera parte del trabajo dos estrategias de experimentacion independientes: A)Obtencion de mutantes afectados enla represion a nivel del elemento DRS2 el gen HXK2. B)Identificacion de proteinas que se unen directamente a la secuencia UAS del prmotor SUC2. La primera condujo a la selección y caracterizacion parcial de dos mutantes afectados en la regulacion a traves del elemento DRS2 del gen HXK2, asi como la identificacion del producto del gen TIM9 como un posible factor implicado en la regulacion de la expresion de los genes SUC2 y HXK2. La segunda dio lugar a la identificacion del producto del gen MED8 como un nuevo factor transcripcional involucrado en el sistema de represión por glucosa en S.cerevisiae. La proteina Med8 es una subunidad esencial del subcompleto Srb/mediador del holoenzima de la ARN polimerasa II de levaduras. En este trabajo se aportan prueba suficientes que indican que Med8 es una pieza clave de conexión entre la maquinaria general de la transcripcion y sistemas de regulacion de la expresion genica especificos, concretamente secuencias reguladoras activadoras en direccion 5´del sitio del inicio del ARNm(gen SUC2) y secuencias reguladoras represoras en direccion 3´del sitio del inicio del ARNm (gen HXK2). La segunda parte del trabajo se ha dedicado a la caracterizacion funcional del producto codificado por el gen MED8 y el estudio de los dominios funcionales de la proteina Med8, a nivel de interacciones ADN-proteina, de localizacion subcelular y de interacciones proteina-proteina, permitiendo el conjunto de resultados obtenido sugerir y discutir modelos de regulacion de la expresion de los genes KXK2 y SUC2, en los que Med8 interaccionaria directamente con elementos reguladores en cis, transmitiendo al holoenzima de la ARN polimerasa II a la información para modular la velocidad de la transcripcion. La proteina Hxk2 en condiciones de represion interaccionaria con Med8 en el nucleo impidiendo la transmision de la informacion al holoenzima, actuando por tanto como un represor en el caso del gen SUC2 y como un activador en el caso del gen HXK2, autocebando su propia expresion.
  • OXIGENACIÓN HIPERBÁRICA EN RATAS. PATRONES DE TOXICIDAD NEUROLÓGICA .
    Autor: PONZ MARQUINA EMILIO.
    Año: 2000.
    Universidad: VALENCIA.
    Centro de lectura: MEDICINA.
    Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.
    Resumen: Mediante oxigenación hiperbárica de ratas, en una instalación diseñada y construida a tal efecto, se han obtenido intoxicaciones agudas por oxígeno o hiperoxias (efecto Paul-Bert, consistente en crisis convulsiva generalizada). La medición de tiempos de hiperoxia ha permitido constatar: 1,- Mayor tiempo de hiperoxia en ratas jóvenes que en adultas a la misma presión de oxígeno. 2,- Disminución de la variabilidad en tiempos de hiperoxia con el aumento de la presión de oxígeno siendo esta disminución mucho más importante a presiones de oxígeno superiores a 5'5 atmósferas absolutas. Alteraciones bioquímicas en ratas expuestas: 1,- Incremento de actividad enzimatica de Superóxido Dismutasa tanto las isoenzimas Zn-Cu como la Mn. 2,- Disminución de actividad enzimática de Catalasa y de Glutatión Peroxidasa. 3,- Disminución de concentración de Glutation reducido y aumento de Glutationoxidado. 4,- Aumento de la concentración de Malondialdehido. 5,- Aumento de la concentración de 8-oxo-2'-de oxiguanosina. Se describe una especie de norma o ptarón de regularidad en la intoxicación neurológica por oxígeno (efecto Paul-Bert) mediante una curva logarítmica. Se propone un posible mecanismo bioeléctrico del fenómeno convulsivo basado en el comportamiento de la membrana celular como un condensador eléctrico.
  • EL COMPLEJO NDH: COMPLEJO CLOROPLASTICO HOMOLOGO AL COMPLEJO I DE LA CADENA RESPIRATORIA MITOCONDRIAL .
    Autor: ELORTZA BASTERRIKA FELIX.
    Año: 2000.
    Universidad: PAIS VASCO.
    Centro de lectura: CIENCIAS .
    Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.
    Resumen: La NADH-ubiquinona-reductosa, tambien denominada complejo I, es el primer enzima de la cadena transportadora de electrones mitocondrial. El complejo I de Escherichia coli consta de 14 subunidades y puede disociarse en 3 subcomplejos. El genoma del cloroplasto codifica homologos de 11 de esas 14 subunidades (ndhA-K). Estas subunidades forman parte de los subcomplejos hidrofobico y conector del complejo I de E.coli. Sin embargo, falta por dilucidar la identidad de las subunidades que formarian el subcomplejo hidrofilico, lo cual ha abierto el debate sobre la identidad del donador de electrones del complejo. Su función podria estar relacionada con el transporte ciclico de electrones alrededor del PSI o con el proceso denominado como clororespiración. En el presente trabajo, se ha secuenciado el gen ndhK de guisante y se ha comprobado que la metionina inicial erroneamente asignada en publicaciones anteriores, siendo la hasta entonces denominada M23 el inicio real de la proteina. La secuencia tiene gran homologia con el resto de genes ndhK de otras plantas e indica la presencia de un posible grupo sulfoferro en la proteina codificada por este gen. El producto del gen ndhK se encuentra en membranas tilacoidales y forma parte del complejo NDH de mas de 670 kDa. El complejo NDH de guisante tiene actividad NADH deshidrogenasa y la FNR no participa en el. Sin embargo, el complejo NDH de maiz tiene actividad NADPH deshidrogenasa, pero aquí tampoco aparece FNR como uno de sus componentes.
  • ACCION DE LA VASOPRESINA A NIVEL DE LA GLANDULA SUPRARRENAL BOVINA. CARACTERIZACION FARMACOLOGICA Y FUNCIONAL DE LOS DIFERENTES RECEPTORES IMPLICADOS.
    Autor: ANDRES MARTINEZ MIRIAM .
    Año: 2000.
    Universidad: PAIS VASCO.
    Centro de lectura: MEDICINA.
    Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.
    Resumen: La glandula suprarrenal es el unico organo en los mamiferos capaz de expresar los tres subtipos de vasopresina existentes Si esta claro que el rector V1a cortical esta implicado en la división celular y la sintesis de esteroides, el papel del receptor V1b medular y del receptor V2, descubiertos recientemente son todavia mal conocidos. La reciente puesta en evidencia de la sintesis y liberacion en el seno de la medula suprarrenal de neuropeptidos tales como la vasopresina (AVP),el factor liberador de corticotropina (CRF) o la adernocorticotropina plantea el problema de la regulación fina de la actividad de la glandula suprarrenal por estas secreciones locales. Por otra parte y teniendo en cuenta la gran homologia estructural y funcional que existe entre la glandula suprarrenal y el complejo hipotálamo-hipofisario (glandulas con un doble origen embriológico que secretan neuropétidos comunes, AVP y CRF entre otros, y poseen sus receptores especificos) se contemplara la hipotesis de una accion concertada de estos dos neuropéptidos en la medula suprarrenal, como ya ha sido demostrado a nivel hipofisario. Este trabajo de tesis comporta en primer lugar la caracterizacion farmacológica de los diferentes receptores de vasopresina en ternero, ya que nada habia sido descrito anteriormente a este respecto. En segundo lugar, comprobar la presencia de diferentes subtipos de receptores de la vasopresina en la glandula suprarrenal bovina, carcterizarlos y establecer su papel fisiologico. Por ultimo, estudiar las posibles interacciones entre la vasopresia y el factor liberador de corticotropina a nivel de la médula suprarrenal. De esta manera, se agrupa la farmacologia molecular, los estudios de las vias de acoplamiento y los efectos de secreción asociados a la activacion de los receptores de vasopresina.
  • EFECTE DE L'INHIBIDOR DE CARBOXIPEPTIDASA DE PATATA (PCI) EN LA VÍA DE SENYALITZACIÓ DELS RECEPTORS DE LA FAMÍLIA ERBB. APLICACIONS ANTITUMORALS.
    Autor: STJÁ ARNAU MARTA.
    Año: 2000.
    Universidad: GIRONA.
    Centro de lectura: CIENCIAS.
    Centro de realización: UNIVERSITAT DE GIRONA.
    Resumen: el inhibidor de carboxipeptidasa de patata (PCI) es una pequeña proteína, inhibidor de proteasas, que presenta u plegamiento espacila de tres puentes disufluro llamado "T-Knot". Este motivo estructural se encuentra presente en muchos factores de crecimiento, como el EGF o el TGF-a. Los factores de crecimiento de la familia del EGF i su receptores están involucrados en la a parición y progresión de muchos carcinomas. Se ha determinado que el PC compite con el EGF para la unión a su receptor, el EGFR (ErbB-1), y que inhibe el crecimiento in vitro e in vivo de la líneas celulares tumorales de carcinoma pancreático. El objetivo de este trabajo ha sido determinar el mecanismo molecular de acción del PCI como antitumoral i su uso potencial en la terapia y en la quimioprevención del cáncer. Para evaluar el mecanismo molecular de acción del PCI, se ha estudiado de manera detallada el efecto del PCI en los diferentes pasos de la activación de los receptores ErbB i en otros procesos asociados. El EGF y el TGF-a, cuando se unen a su receptor,inducen la dimerizacion y transfosforilacion del EGRF, i la señal estimuladora se transduce. Una vez la célula ha sido activada, se produce la internalización de los receptores y la célula queda momentánemente desensibilizada. Los resultados han mostrado que el PCI la activación del EGFR inducida por el TGF-a, bloquea induce la internalización del EGFR, cambia la expresión de este receptor, e inhibe parcialmente el efecto del EGF en la proliferación celular. También bloquea la activación del l'erbB-2 inducida por el EGF. Mediante estudios de similitud estructura, se ha determinado que el PCI presenta, en la misma posicion espacial, aminoácidos de características físico-químicas similares a algunos de los amonoácidos de la sueprficie de interacción del TGF-a y el EGF a su receptor. Por el contrario, el PCI, al ser una molécula más pequeña, no presenta los aminoácidos equivalentes al extremo C-terminal de los factores de crecimiento. Todos estos resultados han permitido elaborar la hipótesis del mecanismo de actuación del PCI como antagonsita de los ligandos del EGFR. El PCI compite con el TGF-a ó el EGF para la unión a l'EGFR. Una vez unido al receptor, el PCI no puede estabilizar el dímero porqué le falta el equivalente a la cola C-terminal de los ligandos naturales, por lo tanto el receptor no se activa.no obstante, la union del PCI alEGFR debe provocar un cambio conformacional en el receptor que induce su internalización. Como resultado final, el PCI desensibiliza la célula mediante la disminución del número de EGFR a membran, sinque estos receptores hayan estado activados. Debido a la importancia del EGFR i el erbB-2 en la génesis y la progresión de los carcinomas, el PCI tiene un potencial terapéutico en este tipo de tumores, al ser capaz de bloquear la activación inducida por lo ligandos de EGFR. En la determinación del potencial antitumoral del PCI en el carcinoma de mama, se ha visto que el PCI provoca una disminución del creciminnto in vitro de células tumorales humanas de carcionam mamario, i que esta inhibición no está asociada ni a un incremento del apoptosi ni a una parada de le células en la guan fase del ciclo celular. Sin embargo,la disminución del crecimiento se mantiene en ausencia del PCI. Cuando el PCI se ha combinado con tamoxifén, droga antihormonal, se obtuvo un efecto sinérgico. La presencia de PCI permite reducir la concentración de tamoxifén necesaria para bloquear el crecimiento in vitro inducido por los estrogenos. Por eso, el PCI puede tener un gran interés en la terapia combinada del carcinoma mamario y en la prevención de la resistencia a drogas, asociada al uso de altas dosis de estas drogas durante tratamientos prolongados. Finalmente, en la evaluación de la capacidad del PCI para prevenir la aparición del cáncer intestinal en el modelo de ratones APC/Min, se ha determiando que la administración subcutánea de PCI en estos ratones no afecta ni la aparición ni el crecimiento de los adenomas intestinales.
  • CONSTRUCCIÓN DE UN SISTEMA DE EXPRESIÓN HETEROLOGO CON LOS GENES DE LA D-CARBAMICASA Y LA D,L-HIDANTOINSA. EVALUACIÓN DE SU APLICACIÓN BIOTECNOLOGIA A LA SINTESIS DE D-AMINOACIDOS A PARTIR DE DERIVADOS DE LA D, L-HIDANTOINA .
    Autor: CLEMENTE JIMÉNEZ JOSEFA M..
    Año: 2000.
    Universidad: ALMERIA.
    Centro de lectura: CIENCIAS EXPERIMENTALES.
    Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS EXPERIMENTALES.
    Resumen: El objetivo de esta tesis ha sido aislar, clonar y sobre-expresar las enzimas implicadas en la síntesis enzimática de D'-para-hidroxifenilglicina a partir de una mezcla recémica de D, L-para-hidroxifenilhidantoina.Las enzimas D, L-hidantoinasa y D-carbamilasa se han aislado del genoma de Agrobacterium sp. A244. Así mismo se han determinado las propiedades físcio-químicas de mayor interés industrial, constante de afinidad y especificidad de sustrato. Del estudio molecular realizado a la enzima D, L-hidantoinasa se deduce que el extremo amino-terminal es esencial para la actividad catalítica de la enzima. Por último se ha secuenciado el cluster en el que estan incluídos los genes de ambas enzimas, determinándose su disposición invertida respecto a una región promotora cómun. Dicha topología es compatible con la disposición de los regulones.
562 tesis en 29 páginas: 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 | 21 | 22 | 23 | 24 | 25 | 26 | 27 | 28 | 29
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