PROTEINAS, 9

Autor: INFANTE TOSCANO CARLOS.
Año: 2000.
Universidad: SEVILLA.
Centro de lectura: BIOLOGIA.
Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGIA.

Resumen: GMAP-210 es un autoantigeno, reconocido por un suero humano procedente de un paciente afectado por el Sindrome de Sjogren, que se asocia perifericamente a la superficie citosolica de las membranas de la red cis del aparato de Golgi(CGN). La secuencia completa del ADNc que codifica a GMAP-210 predice una proteina de 1979 aminoacidos, con un peso molecular de 227´637 y un pI de 5,06. Los analisis estructurales realizados a partir de la secuencia de nucleotidos predicen que la mayor parte de la proteina se plegaria en helice superenrrollada,con excepcion del extremo carboxilo terminal, de carácter muy basico y probable estructura globular. Presente multiples secuencias consenso de fosforilacion por distintas quinasas y dos motivos de cremalleras de leucinas. Por el contrario, no presenta sitios de union a ATG y GTP. GMAP-210 interacciona con los microtubulos de forma directa a traves de la region carboxilo terminal. In vivo, se asocia preferentemente a una subpoblacion de microtubulos estables enriquecidos en tubulina detirosinada, caracteristicas iguales que la subpoblacion de microtubulos con la que el aparato de Golgi mantiene una estrecha relacion. La region amino terminal de GMAP-210 esta directamente implicada en la asociacion de la proteina a las membranas del aparato de Golgi. De esta forma, GMAP-210 constaria de una amplia region central plegada en helice superenrollada, que se asociaria a las membranas del aparato de golgi a traves de su extremo amino terminal y a los microtubulos a traves de la region carboxilo terminal, este modelo coincide con el descrito para otras proteinas de union a microtubulos. La sobreexpresion de GMAP-210 provoca una considerabe hipertrofia del aparato de Golgi, y una dramatica reorganizacion de la red de microtubulos en el area pericentrosomal. Estos efectos parecen producirse como consecuencia de una estabilizacion de microtubulos mediada por la proteina asociada a las membranas, ya que la sobreexpresion de una forma truncadade GMAP-210 en fusion con la GFP desplaza a la proteina endogena de las membranas y causa la desorganizacion del aparato de Golgi, lo que la implica en el mantenimiento de la integridad estructural del organulo. Por el contrario, el extremo carboxilo de GMAP-210 se une a los extremos de los microtubulos, podemos concluir que GMAP-210 es una proteina localizada en el aparato de Golgi que interacciona especificamente con el extremo menos de los microtubulos anclados en el centrosema.

Autor: SARRIAS FORNÉS M. ROSA.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y FORMACIÓN CONTINUADA.

Resumen: El estudio de la utilización del sistema inmunológico por los virus como patogenos para su propio beneficio fue el principal objetivo de este trabajo. Concretamente en este trabajo de tesis se analizaron dos especies de herpesvirus que infectan a humanos, el virus Herpes Simplex 1 (HSV-1), y el Epstein Barr (EBV). La entrada de ambos virus a las células es mediada por receptores del sistema immune. Se estudió la interacción de los respectivos receptores celulares, Herpes Virus Entry Mediator A (HveA), y el receptor de complemento 2 (CR2), con las glicoproteínas virales que se unen a ellos, y sus ligandos naturales, los cuales participan en la defensa del huesped. Se caracterizó la interacción de los receptores HveA y CR2 con sus ligandos utilizando proteinas recombinantes o purificadas de suero; en el caso de HveA nos centramos en la localización del sitio de unión de cada ligando al receptor. En el caso de CR2, se analizó la cinética de unión de sus ligandos. Para los dos receptores, se analizó si la unión de la proteina viral al receptor podría interferir y/o modular la unión de sus ligandos naturales. Los resultados se analizaon en el marco de la respuesta immunólogica del huesped mediada por el receptor celular, y en relación al posible papel modificador de esta respuesta por parte de la proteina viral. Para facilitar el estudio con HveA, se utilizaron las librerias aleatorias de péptidos expresadas en el fago M13. Se aislaron dos péptidos, cuya capacidad de inhibir la entrada del virus a las células fue analizada.

Autor: VILA UJALDÓN ROGER.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y DE FORMACIÓN CONTINUADA.

Resumen: La histona H1 es la proteína responsable de la formación de la superestructura de la cromatina. Esta proteína está formada por tres dominios: una región globular central flanquedad por colas N- y C-terminales hidrofilicas y básicas, muy ricas en lisina, alanina y prolina. Mediante técnicas de dicroísmo circular DC, resonancia magnética nuclear de protón de doble dimensión RMN-2D y espectroscopia de infrarrojo FTIR, se ha estudiado al estructura de péptidos de los dominios N- y C-terminales de los subtipos H1º y H1e, en distintas condiciones: en disolución auosa, en presencia de 2,2,2,-trifluoroetanol TFE y en presencia de DNA. Los péptidos estudiados son; NH1m de 20 residuos, que corresponde a todo el dominio N-terminal de la H1º, idéntico en ratón y humano, y NH2 correspondiente a los residuos 8-30 de la misma proteína. CH1 corresponde a los residuos 99-121, incluidos en el dominio C-terminal de la H1º, idénticos en ratón y rata. NE-1 corresponde a los residuos 15-36 del dominio N-terminal de la H1e de ratón. Los estudios de DC y RMN-2D de protón revelan que ninguno de los péptidos de la histona H1 estudiados se encuentra estructurado de forma estable en disolución auosa. En 90% de TFE, en cambio, los cuatro péptidos adquieren un porcentaje subsatancial de estructura secundaria, especialmente hélice alfa. Concretamente, NE-1 se estructura en dos hélices alfa anfipáticas separadas por dos glicinas. Este doblete de glicinas define uan zona flexible que provoca libertad de movimientos de las dos hélices. El dominio N-terminal de la H1º, según se desprende de nuestros resultados con NH-1 t -NH-2, carece de estructura en su mitad N-terminal y del residuo 11 a 23 se estructura en una hélice alfa. CH-1 se estructura en una hélice alfa anfipática del residuo 100 a 116. Sin embargo,parece que los primeros 4 residuos forman una hélice 3 10. El motivo TPKK de su extremo C-terminal se estructura en un giro beta/-. Se han estudiado los péptidos NH-1, NH-2 y CH-1 por FTIR. En disolución acusosa,la amida I de los tres péptidos presenta un componente principal a 1641 cm-1, característico del ovillo estadístico. En 90% de TFE, aparecen hélices y giros en proporciones que se ajustan a los resultados de RMN. También hemos estudiado la estructura de los péptidos unidos a DNA genómico de raón y a DNAs repetitivos como poli (dA-dT) pli (dA-dT). No se observan diferencias importantes entre los diferentes DNAs. Al interaccionar con el DNA, los péptidos se estrcutran en hélice alfa con unos porcentajes muy parecidos a los observados en TFE. Para CHE-1, los componentes atribuidos al giro beta/- y a hélices 3 10 también aparecen en los espectros de los complejos con DNA. En conclusión, el DNA induce estructura secundaria en regiones de los dominios N- y C-terminales de la histona H1, concretamente hélices alfa, hélices 3 10 y giros. El TFE revela dicha estructura y permtie su estudio a alta resolución.

Autor: SOSPEDRA ALSINA PATRICIA PILAR.
Año: 2000.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: FARMACIA.

Resumen: En la presente memoria se reportan estudios fisioquímicos de las interacciones entre el péptido sintético correspondiente a la secuencia antigenica 110-121(110 Phe-Trp-Arg-Gly-Asp-Leu-Val-Phe-Asp-Phe-Gln-Val121) de la proteina VP3 de la cápside del virus de la hepatitis A y los diferentes tipos de lípidos (anónico, catiónico y neutro) y modelos de membrana de eritrocito y hepatocito. Así mismo se realizaron estudios con otros péptidos análogos: a) dos derivados sintéticos (sustitución de la glicina en la posición 113 por lisina y sustitución del ácido aspártico en posición 114 por ácido glutámico), b) dos derivados hidrofóbicos (palmitoil VP3(110-121) y derivado C-amidado y N-acetlado), c) VP3(110-121)unido a liposomas unilamenlares mediante enlace amida y d) derivados de la estructura original con menor longitud de cadena de aminoácidos. Todos los péptidos estudiados se caracterizaron fisicoquimicamente mediante la determinación de la actividad superficial. Como modelo de membrana se emplearon películas monomoleculares mediante la técnica de Langmuir, realizando cinéticas de penetración a éra constante y isotermas de comprensión. Tambien se emplearon bicapas lipídicas utilizando técnicas espectrofluorimétricas, en ellas se evaluaron las interacciones con las bicapas utilizando las sondas fluorescentes ANS y DPH.

Autor: PALMADA FENES MONICA .
Año: 2000.
Universidad: BARCELONA.
Centro de lectura: QUÍMICA.
Centro de realización: FACULTAD DE QUÍMICA (BARCELONA) Y MAX PLANCK INSTITUT (DORTUMUND, ALEMANIA).

Resumen: Los transportadores de los aminoácidos excitatorios juegan un papel esencial en la regulación de la concentración de glutamato y aspartato en la sinapsis. La evidencia de que la eliminación del exceso de estos aminoácidos es crucial para la protección neuronal,ha convertido estos transportadores en efectivas dianas farmacológicas. En el presente trabajo investigamos la posible modulación del transporte de aminoácidos excitadorios por otros neurotransmisores, distintos del glutamato y aspartato, así como por benzodiacepinas. Al investigar el posible papel del transportador neuronal EAAT3 como diana paracrina de aminas biogénicas, observamos que los neurotransmisores norepinefrina y el precursor directo de dopamina, L-DOPA, inhibieron el transporte. Tal inhibición no es debida a cambios en las fuerzas motrices del transportador sino a una interacción directa con el transportador, en el lugar de unión del sustrato, como indicaron los resultados obtenidos a partir de medidas de flujo realizadas con otro transportador dependiente de Na+, el transportador de glucosa SGLT1, así como por análisis cinéticos que mostraron una inhibición del tipo competitiva en los dos casos. Además, los productos de oxidación no están involucrados en la inhibición mediada por la norepinefrina puesto que la aplicación del agente antioxidante, glutation, no pudo prevenir los efectos mediados por la norepinefrina. En el caso de L-DOPA, no podemos descartar tal posibilidad. Considerando las propiedades de las benzodiacepinas (ansiolíticas, anticonvulsantes), podrían estar involucradas en la regulación de la transmisión de aminoácidos excitatorios mediante una estimulación del transporte. Así pues, estudiamos el efecto de una serie de benzodiacepinas sobre el transportador neuronal EAAT3 y los transportadores gliales EAAT1 y EAAT2, expresador independientemente en células CHO y ocitos de Xenopus laevis. En la presencia de altas concentraciones de benzodiacepinas (10-100 uM) ejercieron diferentes efectos dependiendo del transportador estudiado. El transportador neuronal EAAT3 fue estimulado, el glial EAAT1 no se modificó y EAAT2 fue inhibido. Tales efectos no son mediados por cambios en las fuerzas motrices de los transportadores ni por cambios en el potencial de membrana. La estimulación del transportador neuronal usando concentraciones micromolares de benzodiacepinas sugiere un mecanismo adicional del efecto ansiolítico de estos fármacos a la ya conocida interacción de las benzodiacepinas con el receptor de GABA.

Autor: RUIZ LEÓN YOLANDA .
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOMEDICAS.

Resumen: La proteína Beta-amiloide es el componente mayoritario de las placas seniles que se observan en la enfermedad de Alzheimer. Se genera por procesamiento a partir de la proteína precursora del péptido beta-amiloide (APP), una proteina de membrana cuya sobreexpresión está directamente relacionada con el desarrollo de la enfermedad. El ácido retinoico (AR) induce la expresión de APP en células de neuroblastoma. Sin embargo, el efecto requiere tiempos largos de tratamiento, y además el promotor de APP no contiene ningún elemento consenso de unión a los receptores de AR (RARE), lo que parece descartar un efecto directo de este ligando a nivel transcripcional. En esta tesis, hemos demostrado que el AR puede regular la expresión de APP a través de sus efectos previos sobre el mRNA del receptor TrkB. BDNF es capaz de estimular la actividad del promotor de APP en células de neuroblastoma humano SH-SY5Y, y el tratamiento con AR permitiría este estímulo induciendo la síntesis de su receptor TrkB. La activación transcripcional del promotor de APP por BDNF es dependiente de la actividad tirosina quinasa de TrkB y se lleva a cabo principalmente a través del sitio Shc del receptor. La regulación de APP por BDNF, que es independiente de la actividad PLC-y/PKC, estaría mediada principalmente a través de otras dos vía de señalización, la vía Ras/MAPK y la vía P13K/Akt, que presentan varios puntos de inteferencia entre sí. En este sentido, nuestros resultados sugieren un posible efecto permisivo y/o activador de Raf y MEK sobre la vía P13K/Akt. A otro nivel,hemos estudiado las secuencias del promotor de APP que median la respuesta a BDNF. Mediante deleciones sucesivas hemos probado que la respuesta a BDNF está mediada fundamentalmente a través de secuencias localizadas entre los nucleóticos -307 a -15. Más aún, nuestros resultados han demostrado que el efecto delBDNF es independiente de los sitios AP-1 presentes en esta región del promotor, y sugieren la posible implicación de otros efectores, en particular de CREB, en la activación del promotor de APP por BDNF.

Autor: ABAD PASTOR JOSE M..
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS UNIVERSIDAD AUTONOMA DE MADRID.

Resumen: EN EL PRESENTE TRABAJO SE HAN LLEVADO A CABO DOS OBJETIVOS RELACIONADOS ENTRE SI: 1) EL ESTUDIO Y APLICACIÓN DEL MODO DE TRANSDUCCION PIEZOELECTRICO (LA MICROBALANZA DE CRISTAL DE CUARZO) EN EL DESARROLLO DE BIOSENSORES Y 2) EL DESARROLLO Y CARACTERIZACION MEDIANTE LA MICROBALANZA DE CRISTAL DE CUARZO, DE NUEVAS ESTRATEGIAS DE INMOVILIZACIÓN CONTROLADA DEL COMPONENTE BIOLOGICO SOBRE EL TRANSDUCTOR. EN EL PRIMERO OBJETIVO SE HAN DESARROLLADO DOS BIOSENSORES PIEZOELECTRICOS:UN INMUNOSESOR PARA LA DETERMINACION DEL ANTICUERPO DE LA PROTEINA P12 DEL VIRUS DE LA FIEBRE PORCINA Y UN BIOSENSOR ENZIMATICO BASADO EN LA ACETILCOLINESTERASA (AChE), PARA LA DETERMINACION DE LOS PESTICIDAS ORGANOFOSFORADOS (PAROXON) Y CARBAMATOS (CARBARILO) EN MEDIO ACUOSO. EN EL SEGUNDO OBJETIVO SE HAN DESARROLLADO NUEVAS ESTRATEGIAS PARA LA INMOVILIZACION SELECTIVA Y ORIENTADA DE PROTEINAS SOBRE SUPERFICIES DE ORO CON EL FIN DE OBTENER ELECTRODOS ENZIMÁTICOS PARA SU UTILIZACION EN BIOSENSORES. ESTAS ESTRATEGIAS SE BASARON EN LA OBTENCION DE SUPERFICIES ORDENADAS MEDIANTE LA TECNOLOGIA DE FORMACION DE MONOCAPAS AUTOENSAMBLADAS (SAMs) FUNCIONALIZADAS CON LIGANDOS ADECUADOS QUE FACILITARON LA UNION SELECTIVA Y ORIENTADA DE LAS PROTEINAS A TRAVES DE SITIOS DE UNION ESPECIFICOS PRESENTES EN LAS PROTEINAS O GENERADOS MEDIANTE TECNICAS DE GENETICA MOLECULAR.

Autor: GONZAEZ BILLAULT CRHISTIAN ENRIQUE.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGIA MOLECULAR SEVERO OCHOA.

Resumen: La proteina asociada a microtúbulos 1B es la primera de las MAPs que se expresa especificamente en el sistema nervioso durante el desarrollo. Su función se ha postulado que es la estabilización de los microtubulos, promoviendo de esta forma su ensamblaje. Para analizar las funciones in vivo de esta proteina, en esta tesis hemos analizado la deficiencia de MAP1B en un modelo de raton transgenico. Los animales fueron generados por el metodo de "gene trapping" y el analisis de los mutantes, en los cuales la expresión de MAP1B esta reducida en un 95%, arroja como resultado una letalidad perinatal de los animales homocigotos. Estos animales presentaron deficiencias en todas las estructuras laminadas del cerebro, entre ellas, el cerebelo, el hipocampo y la corteza cerebral, sugirieron la participación de MAP1B en los procesos de migración neuronal. Así mismo, a nivel celular se describe que las neuronas de hipocampo de los animales homocigotos para la mutación tienen menos microtubulos que aquellas de los controles. Este es la primera evidencia in vivo que confirma una de las funciones que se le han adscritos a la MAP1B. Igualmente en las neuronas deficientes en MAP1B el balance entre la poblacion de microtubulos estables y dinamicos esta alterado en estos mutantes.

Autor: PAZOS CABALEIRO FLORENCIO.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGÍA (CSIC).

Resumen: Este trabajo esta centrado en el estudio y predicción de la interacción física entre proteínas, aspecto esencial para explicar su función, tocando también el tema, íntimamente relacionado, de la predicción de estructura tridimensional de proteínas a partir de secuencias. Todo ello desde el punto de vista bioinformático, yendo desde el estudio de estos procesos, pasando por el desarrollo de algoritmos de predicción y llegando a la implementación de estos en programas de ordenador para su distribución y uso. En predicción de estructura de proteínas se han desarrollado herramientas para la combinación, visualización y manipulación interactiva de los modelos propuestos por técnicas de predicción estructural, principalmente técnicas de reconocimiento de plegamiento (threading). En predicción de interacción entre proteínas se han desarrollado sistemas capaces de predecir, partiendo de información de secuencia únicamente, parejas de proteínas interaccionantes y las regiones de las proteínas implciadas en esta interacción.

Autor: OLMEA ALONSO OSVALDO RAMÓN.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID.

Resumen: Las familias de proteínas constituyen una fuente valiosa de información. En un alineamiento múltiple están reflejadas las características funcionales, estructurales e históricas de una familia de proteínas. A partir de su análisis, hemos intentado extraer esta información, derivando diversas propiedades, como la información sobre conservación de secuencia y la correlación. La conservación de secuencia está relacionada con la presión evolutiva que se ejerce al intentar mantener las características químicas de algunas posiciones en la secuencia con el fin de mantener la función y la estructura de la proteína. La correlación se atribuye a los ajustes que se necesitan para mantener la estabilidad de la proteína frente al fenómeno mutacional, aunque también puede haber correlación relacionada con la función. Basado en el modelo de mutaciones correlacionadas en un alineamiento múltiple se ha desarrollado un método de predicción de contactos entre aminoácidos de una proteína. Hemos demostrado que los pares correlacionados tienen una tendencia a estar más cercanos en el espacio que los pares no correlacionados, por lo que pueden ser utilizados directamente para predecir contactos aunque con una baja precisión. Las predicciones generadas con este método son mejores que una predicción aleatoria pero no parecen ser suficientes para su uso en experimentos de plegamiento de proteínas de novo. Los alineamientos múltiploes pueden proporcionar más información para mejorar la predicción de contactos. Con esta información, la predicción de contactos mejora. Extendimos el análisis de las mutaciones correlacionadas al estudio de la estabilidad de estas correlaciones y de la formación de redes de pares correlacionados. La conformación del espacio de secuencias, distinta para cada familia de proteínas, justifica la necesidad de investar cuán dependientes son las mutaciones correlacionadas de la estructura del mismo. Nuestros resultados apuntan a que, aquellos pares de residuos que continúan correlacionados con independencia de la estructura de este espacio, contienen mayor información sobre los contactos. Las redes de correlaciones son conjuntos de pares formados por residuos que se encuentran correlacionados entre sí. Hemos confirmado la hipótesis de que tales redes son ricas en contactos, fundamentalmente en proteínas pequeñas. También mejora la caliad de la predicción la incorporación de la información acerca de la conservación y el análisis de la cantidad de contactos que puede hacer un residuo determinado. La información que demostró ser más útil para la mejora de la predicción de contactos fue la de conservación de secuencia y la densidad de contactos. El éxito de la utilización de información sobre la conservación se debe al hecho de que los aminoácidos conservados suelen formar parte de sitios funcionales o de regiones estructuralmente importantes, por lo que tienden a estar agrupados en el espacio. La aplicación de un protocolo que combina esas variables independientes permite predicciones de contactos que son dos veces mejores que aquellas obtenidas con las mutaciones correlacionadas. Pensamos que será muy difícil alcanzar mejoras dramáticas en la predicción de contactos entre residuos tomando como base la correlación, aunque un factor positivo será el disponer de un mayor número de secuencia a medida que se avance en la secuenciación de genomas. En nuestro trabajo también mostramos que pueden detectarse proteínas con un plegamiento incorrecto con la información de la conservación de secuencia, la correlación y la apolaridad. Utilizamos esta información de la conservación de secuencia, la correlación y la apolaridad. Utilizamos esta información para reconocer el tipo de plegamiento de una proteína evaluando los modelos sugeridos por un método de RTP, como un ejercicio más realista de predicción de estructura de proteínas. En particular, nos basamos en el grado de proximidad de los residuos correlacionados, conservados y apolares. Los resultados demostraron que la capacidad de reconocimiento de plegamiento de un método particular mejora. Esta mejora es producto de la selección de los mejores alineamientos evaluados según los tres tipos de información. Para evaluar nuestros resultados hemos participado en dos congresos de evaluación crítica de métodos de predicción de estructura (CASP2 y CASP3).Los resultados obtenidos demuestran la validez de nuestros métodos.

Autor: SARNAGO CEBADA SUSANA.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGÍA MOLECULAR (UAM).

Resumen: En esta tesis doctoral se describen nuevos mecanismos de regulación de la quinasa de receptores acoplados a proteínas G, GRK2. Esta quimasa desempeña un papel muy importante en la desensibilización y señalización de numerosos receptores, y sus niveles y funcionalidad se encuentran alterados en diversas patologías como hipertensión, hipotiroidismo o fallo cardiaco congestivo. El trabajo realizado en esta tesis ha permitido proponer un mecanismo funcional para la activación y translocación de GRK2 en respuesta a estímulo basado en la modulación de la actividad de GRK2 frente a distintos sustratos por dominio N y C-terminales de la quinasa, junto con el efecto protector de un péptido C-terminal en su proteolisis parcial, y en la elaboración de un modelo molecular para GRK2. En este modelo, GRK2 se mantendría en un estado basal inactivo mediante interacciones intramoleculares entre los dominios RGS, PH y catalítico. La ruptura de esos contactos por interacción con subunidades Gbetay, lípidos y receptores activados promoverían cambios conformacionales que simultáneamente translocan GRK2 a la membrana y la activan. Se ha demostrado también la regulación de la quinasa por fosforilación por otras quinasas activadas por receptores acoplados a proteínas G como Src y MAPK. GRK2 recombinante se fosforila por la tirosina quinasa c-Src con rapidez, alta afinidad, y estequiométricamente.La fosforilación de GRK2 en residuos de tirosina tienen lugar también en un contexto celular, tanto en sistemas heterólogos, como endógenos, en respuesta a la estimulación de diversos receptores acoplados a distintas proteínas G, entre los que se encuentran los receptores beta2- y alfa2A-adrenérgicos, el receptor M1-muscarínico de acetilcolina, y el receptor de quimioquinas CXCR4. Por tanto, este mecanismo de regulación de GRK2 por fosforilación sería inherente a la estimulación de múltiples receptores acoplados a proteínas G. Además, GRK2 se fosforila en residuos de tirosina en respuesta a otros estímulos que activan tirosina quinasas citosólicas de la familia de c-Src, en respuesta a la activación con anticuerpos ante-CD3 en células Jurkat, y en respuesta a estímulos de estrés oxidativo. Además, GRK2 y c-Src están presentes transitoriamente en el mismo complejo multimolecular en respuesta a estímulo, habiéndose detectado asociación de ambas proteínas en respuesta a la activación de receptores beta2- y alfa2A-adrenérgicos. Los residuos críticos para la fosforilación de GRK2 por c-Src son las tirosinas 13,86 y 92, del dominio N-terminal. Una pequeña proporción de GRK2 puede fosforilarse en más de un residuo, dando lugar un pequeño cambio de su movilidad electroforética. La fosforilación de GRK2 por c-Src conlleva un aumento de su actividad frente a sustratos solubles y de membrana y promueve también cambios en la asociación de la quinasa a otras proteínas, como la proteína Gaq, cuya interacción con GRK2 aumenta tras fosforilación en los residuos de tirosina incluidos en el dominio de homología a RGS de la quinasa. Además, la fosforilación de GRK2 por Src afecta a su estabilidad, lo que sugiere que actuaría como señal para su degradación proteolítica. Por último, se ha demostrado también en esta tesis que GRK2 es sustrato de MAPK, que la fosforila en su dominio C-terminal, provando una disminución de la actividad de GRK2 frente al receptor. La fosforilación por MAPK se potencia por la presencia de subuniddes Gbetay de la proteínas G y de un receptor activado, sugiriendo que GRK2 sería fosforilada por MAPK tras su reclutamiento a la membrana en respuesta a estímulo en un contexto celular. La fosforilación de GRK2 por MAPK no es necesaria para la fosforilación por c-Src, y GRK2 fosforilada por MAPK es peor sustrato para la tirosina quinasa, lo que sugiere una acción secuencial Src/MAPK en la modulación funcional de GRK2.

Autor: MARTÍN BELMONTE FERNANDO.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS .
Centro de realización: UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID.

Resumen: El proteolípido MAL Ha sido propuesto como un elemento de la maquinaria de transporte que opera en la distribución apical de proteínas en células epiteliales polarizadas. El hecho de que, a diferencia de los que ocurre con las células epiteliales MDCK, las células FRT derivadas de tiroides de rata dirijan la mayor parte de sus proteínas ancladas por glicosilfosfatidilinositosl GPI a la membrana basolateral, nos ha suministrado una oportunidad única para determinar el papel de MAL en el transporte apical de proteínas de membrana en condiciones en las que la mayoría de proteínas ancladas por GPI don (MDCK) o no (FRT) transportadas a la membrana apical. Utilizando una estrategia basada en oligonucleótidos antisentido para reducir los niveles de la proteína MAL endógena, hemos observado que el transporte correcto de proteínas transmembrana apicales asociadas con rafts (HA y al proteína anclada por GPI gD1-DAF) o no (el receptor neurotrófico p75NTR exógeno), así como el conjunto de proteínas endógenas de membrana destinadas a la membrana apical dependen de unos niveles normales de proteían MAL endógena. De igual forma, el transporte correcto de HA, p75NTR, DPPIV y el conjunto de proteínas apicales de membrana endógenas tiene lugar por una ruta que es dependiente de unos niveles normales de la proteína ancladas por GPI que son transportadas a la membrana apical en las células FRT, es dependiente de unos niveles normales de MAL endógeno, mientras que no se afectó el transporte basolateral de gD1-DAF cuando se redujeron los niveles de MAL endógeno en estas células. Hemos demostrado, además, que la proteína secretada tiroglobulina es transportada a la superficie apical por una ruta asociada a rafts y que tanto tiroglobulina como la proteína endógena secretada apicalmente gp80 dependen de MAL para su secreción en las células MDCK.

Autor: ELORZA MORENO SUSANA.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO DE BIOLOGIA MOELCULAR (UAM).

Resumen: La rápida degradación de GRK2 en distintos tipos celulares tiene lugar poar la via del proteasoma, principalmente de forma dependiente de la actividad de receptores acoplados a proteinas G, y modulada por su estimulación. Otros miembros de la familia GRK(GRK3,GRK5 y GRK6) tambien se degradan por la via del proteasoma, lo cual sugiere que se trata de un mecanismo general de modulación de estas proteinas. La degradación de GRK2 requiere de su actividad catalitica y depende de la funcion de las B-arrestinas como proteinas adaptadoras. Una función clave, pero no única, de B-arrestina en este proceso es su capacidad de reclutar la tirosina quinasa c-Src en un determinado contexto celular, en el que la fosforilacion directa de GRK2 en residuos de tirosina permite promover su recambio por la maquinaria proteolítica. GRK2 y MAPK pueden detectarse en un mismo complejo multimolecular mediante experimentos de co-inmunoprecipitación, de forma dependiente tanto del estadode activación de MAPK como la estimulación de GPCRs. La fosforilacion de GRK2 por MAPK en este contexto promueve su proteolisis por la vía del protasoma. La fosforilación del GRK2 por c-src y MAPK tras estimulación de GPCRs, es parte de una misma via de regulación de la degradación de GRK2, en la que particpan secuencialmente, siendo aparentemente la fosforilación por c-Src necesaria y la mediada por MAPK suficiente para promover el proceso de degradación de GRK2. La inhibición de tirosina quinasas citosolicas o de la via MAPK, indistintamente, atenúa fuertemente el recambio de GRK2 endogena en distintas lineas celulares y aumenta sus niveles estacionarios de expresión. La alteración de la estabilidad de GRK2 puede modificar el patrón de desensibilizacion/resensibilización de GPCRs y por tanto, la duración de las señales mediadas por estos receptores, lo que sugiere un importante papel para la modulación de la estabilidad de GRK2 en distintas situaciones fisiopatologicas.

Autor: ARRASATE IRAGUI MONTSERRAT.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: UNIVERSIDAD AUTONOMA DE MADRID.

Resumen: La proteina tau es una proteina neuronal asociada a microtúbulos cuya función más importante es la estabilización de microtúbulos axonales. Dicha proteína aparece involucrada en patologías neurodegenerativas que cursan con demencia, como la enfermedad de Alzheimer, u otras patologías como la demencia frontotemporal asociada al cromosoma 17(FTDP-17). En el trabajo presentado en esta tesis se ha analizado la influencia de la fosforilacion en la asociacion de tau a membranas celulares. Así, se ha observado que la fosforilación del epitopo 199-202 en la región rica en prolinas, es capaz de dirigir la localización subcelular de la proteina tau de membrana a citoplasma. Adicionalmente, se han realizado estudios de búsqueda de interacciones de la proteina tau con nuevas proteinas mediante el sistema de doble híbrido. Se ha descrito la posible interacción de la proteína tau con secuencias consenso derivadas de inserciones Alu que se expresan en determinadas proteínas. La proteína tau es el componente fundamental de los filamentos aberrantes que aparecen en las demencias descritas previamente, existiendo una correlación entre su aparición y la demencia padecida. En este sentido, se ha estudiado el papel de los glicosaminoglicanos en la formación de dichos filamentos aberrantes, asi como su papel en la estructura helicoidal que presentan. SE ha analizado además, el posible efecto de mutaciones en el gen de tau que son causa directa del padecimiento de FTDP-17, observándose que algunas de ellas son capaces de modificar la afinidad a microtúblos así como de favorecer la agregación de tau en filamentos.

Autor: ASENJO VILA ANA M..
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS .
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: El virus respiratorio sincitial humano (VRSH) es el principal agente causal de infecciones respiratorias agudas que requieren hospitalizacion en niños menores de dos años. Tambien causa infecciones respiratorias agudas en ancianos. Hasta el momento es un patógeno no controlado sanitariamente. Las vacunas, compuestos antivirales y humanización de anticuerpos neutralizantes especificos son las tres herramientas que, de acuerdo con las caracteristicas de la infeccion y de las poblaciones mayoritariamente afectadas, pueden controlar las infecciones. Este estudio pretende determinar la funcionalidad de la fosforilacion de la proteina P, una fosfoproteina estructural de las nucleocapsidas virales. Resultados anteriores de nuestro laboratorio demostraron que la proteina P se fosforila en residuos de serina localizados en dos regiones separadas de la moelcula: region I o central y region II o carboxilo terminal. Este trabajo ha servido para definir una fosforilación nueva estrictamente regulada en la región amino terminal de la molécula, a la que hemos denominado region III, y determinar que la fosforilacion de la region I que al igual que la de la region II pensabamos que era constitutiva, tambien esta parcialmente regulada. Hemos identificado las proteínas quinasas y fosfatasas que controlan dichas regiones asi como la casi totalidad de los residuos que se modifican en la region III. Se ha comprobado que la fosforilacion de las regiones I y II en dispensable para la funcionalidad de la proteina en transcripicon y replicacion aunque incrementa la actividad de la proteina P rn en dichos procesos. Se ha demostrado que la proteína P es capaz de oligomerizar formando tetrameros y se ha definido un dominio probable de oligomerización, para este proceso es dispensable la fosforilación de las regiones I y II, y quizas, es esencial la fosforilación de la region III, en el residuo T46. Todos los resultados han sido empleados en la construcción de un modelo que debe ser probado experimentalmente y que explicaria como fosforilaciones diferenciales de la proteina P determinarian la multifuncionalidad de esta en transcripción, rellicación y morfogénesis.

Autor: GAMEZ ABASCAL ALEJANDRA.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: La fenilcetonuria (PKU) es una enfermedad genética humana que se transmite con carácter autosomico recesivo causada por una deficiencia en la enzima fenilalanina hidroxilasa hepatica (PAH) que cataliza la hidroxilación del aminoácido esencial fenilalanina a tirosina en presencia de tetrahidrobiopterina y oxígeno. La disfunción de esta enzima, limitante en el metabolismo de la fenilalanina, causa hiperfenilalanina. Las manifestaciones clinicas de la enfermedad han permitido establecer cuatro grupos fenotipicos en funcion de los niveles de fenilalanina en plasma en el momento del diagnostico y de la tolerancia a la fenilalanina de la dieta. Estos grupos son: PKU severo, PKU moderado, PKU suave y HPA. La manifestación clinica más suave de la enfermedad, denominada hiperfenilalaninemia suave o benigna (HPA), se caracteriza porque los pacientes no requieren tratamiento dietético aunque es necesario un correcto seguimiento clínico en determinadas situaciones como el embarazo, con el fin de prevenir el síndrome de hiperfenilalaninemia materna que produce daños irreversibles en el feto. El objetivo principal de este trabajo fue el de profundizar en la correlacón genotipo-fenotipo en PKU con objeto de ampliar el conocimiento de esta enfermedad genetica. Para ello, se realizo por un lado la caracterización genotipica de pacientes con el fenotipo HPA mediante analisis molecular y por otro, se examinó el efecto de determinadas mutaciones causantes de PKU en la estructura y función de la proteina PAH. El estudio de las bases moleculares del fenotipo HPA en la población española se llevó a cabo mediante el empleo de la tecica de Broad range DGGE(electroforesis en geles con gradiente de desnaturalizacion) en combinacion con la tecnica de secundación directa permitiendo determinar el genotipo del 92,5% de los alelos analizados. El analsis molecular de 93 pacientes HPA españoles nos permitió identificar 68 genotipos distintos causantes de este fenotipo en la poblacion española asi como determinar la naturaleza HPA de 13 mutaciones que confieren inequivocamente este fenotipo a los pacientes que las portan, independientemente de la naturaleza de la segunda mutacion con la que se encuentran asociadas. Adicionalmente durante este trabajo se identificaron 7 mutaciones nuevas, no descritas con anterioridad en ninguna poblacion. En conclusión el estudio genético de los pacientes HPA permite confirmar el diagnóstico bioquímico y distinguir, prenatal y postnatalmente, los individuos que requieren terapia dietética de los que no la necesitan. Por otra parte, este trabajo demostró la utilidad tanto del empleo de distintos sistemas de expresión de proteinas (procariota, eucariota y un sistema libre de celulas) bajo diferentes condiciones experimentales (expresión a distintas temperaturas y coexpresión con las chaperoninas bacterianas GroES y GroEL) como del analisis estructural y modelado molecular con el fin de elucidar el efecto que las mutaciones PKU producen en la actividad, estabilidad, oligomerización y estructura de la proteina PAH. Así, mediante la expresión in vitro en diferentes sistemas experimentales de determinadas mutaciones PKU(I65T, R261Q, L348V, S349L, S349P y V388M) y gracias a la localización de los residuos afectados por estas mutaciones en las distintas estructuras cristalinas de la proteina PAH a partir desus coordenadas cristalograficas, se caracterizo molecularmente la naturaleza de estasmutaciones. Mediante estas aproximacione se determinó la naturaleza estructural de las mutaciones I65T, R261Q, L348V y V388M, paradigma de las inconsistencias observadas en la correlación genotipo-fenotipo, que provocan un plegamiento defectuoso en la proteina, y como consecuencia, su inestabilidad. Por otra parte, las mutaciones que afectan al residuo Ser 349(S349L y S349P) demostraron ser de naturaleza tanto estructural como funcional al ser un residuo implicado en la coordinación del átomo de hierro que es esencial en el mantenimiento de la arquitectura de la proteina y e su actividad catalitica. La posibilidad de modular el efecto de determinadas mutaciones estructurales mediante factores externos, como son las chaperonas moleculares y proteasas que forman parte del sistema de control celular, revela la existencia de un posible mecanismos común a diversos enfermedades geneticas que podria explicar las inconsistencias en la correlación genotipo-fenotipo.

Autor: JIMENEZ GOMEZ M. CONCEPCION.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGIA.

Resumen: El estudio de los mecanismos de señalizacion intracelular que regulan los procesos biologicos ha sido ampliamente estudiado. Dentro de estos procesos la transformacion celular ha tenido un amplia relevancia en biomedicina. La caracterizacion de los procesos celulares que un oncogen afecta, va a permitir el desarrollo de dianas terapeuticas para contrarrestar el carácter oncologico de una proteina. En esta memoria se ha estudiado la implicacion del enzima fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) en el proceso de transformacion celular, describiendose que cuando este enzima se desregula coopera con otras vias para inducir crecimiento celular descontrolado. En esta memoria se estudia un mutante de la subunidad reguladora del enzima PI3K obtenido de un linfoma murino y los cambios que esta mutación induce en la actividad de la subunidad catalitica (p110). Estos estudios demuestran que la truncacion del dominio C-SH2 de p85 confiere a la subunidad reguladora la capacidad de potenciar la actividad de la subunidad catalitica y revelan el mecanismo por el que se induce esta activación. Estos estudios permiten concluir que la activación constitutiva de PI3K, cuyos productos normalmente se encuentran en niveles muy bajos en células quiescentes, contribuye a promover el proceso de transformacion celular. Por otra parte, tambien se incide en la implicación de PI3K en el proceso de reorganización del citoesqueleto de actina y migración celular, demostrándose que la subunidad reguladora de PI3K juega un papel fundamental. Se describe una nueva via de señalizacion que contribuye a la regulacion de la adhesion celular y el movimiento, procesos requeridos para la migracion fisiologica y metastatica de celulas tumorales. El factor de crecimiento, PDGF, a traves de la subunidad reguladora de PI3K activa Cdc42 y su efector N-Wasp, el cual influye en la dinámica de la polarización de actina, no solamente induciendo la formación de filopodia, sino tambien disminuyendo las fibras de estrés y adhesiones focales. Los estudios presentados en esta memoria revelan una nueva función de la subunidad reguladora p85, capaz de mediar un aumento en la actividad de la GTPasa Cdc42 y de N-Wasp, potenciado la migración celular. Las alteraciones en la regulación de la PI3K contribuyen al proceso de transformación celular e identifican una nueva ruta de señalización intracelular que ligando la señalizacion de receptores transmembrana con las moleculas que median polimerizacion de actina, regulan migracion celular.

Autor: LOPEZ MOREJON LISSETT.
Año: 2000.
Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGIA, CSIC..

Resumen: EL VIRUS DE LA SHARKA PERTENECE AL GENERO POTYVIRUS DE LA FAMILIA POTYVIRIDAE. CUYO MIEMBRO TIPO ES EL VIRUS Y DE PATATA: TODOS LOS MIEMBROS DE ESTA FAMILIA COMPARTEN UNA SERIE DE CARACTERISTICAS COMUNES, TALES COMO LA MORFOLOGIA DE LA CAPSIDA Y LA INDUCCION DE INCLUSIONES EN FORMA DE RUEDA DE MOLINO: ESTE VIRUS CAUSA GRANDES DAÑO EN LA AGRICULTURA, DE AHÍ SU MAXIMA INTERES EN EL INTERES EN EL ESTUDIO DEL MISMO: DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS CON ESTA TESIS DE-DELUCIDAMOS DIFERENTES CONCLUSIONES: (1) LA PROTEINA CI DE PPV ES CAPAZ DE INTERACCIONAR CONSIGO MISMA SIN NECESIDAD DE OTRAS PROTEINAS VIRALES: (2) UN DOMINIO DE INTERACCIÓN CONSIGO MISMA FUE ENCONTRADO EN LOS PRIMEROS 177 AMINOACIDOS DE ESTA PROTEINA. (3) SE HAN IDENTIFICADO DIEZ CLONES DE UNA GENOTECA DE CDNA DE N.benthamiana QUE CODIFICAN FRAGMENTOS DE PROTEINA CAPACES DE INTERACCIONAR CON LA PROTEINA CI DE PPV EN UN SISTEMA DE DOBLE HIBRIDO DE LEVADURA: SE HA DETERMINADO LA SECUENCIA COMPLETA DE DOS DE ESTAS PROTEINAS, L1 Y L". (5)Lª TIENE UN DOMINIO DE DEDOS DE ZINC EN SU EXTREMO CARBOXILO, QUE TAMBIEN SE ENCUENTRA EN UN AMPLIO NUMERO DE PROTEINAS DE SECUENCIAS MUY DIVERSAS. LI ES SIMILAR A UNA PROTEINA HUMANA QUE SE UNE A LA CICLINA G1, Y PARECE FORMAR PARTE DE UNA FAMILIA QUE INCLUYE PROTEINAS DE PLANTAS, LEVADURAS Y ANIMALES. (6)L" ES LA PROTEINA CLOROPLASTICA psiK QUE FORMA PARTE DEL FOTOSISTEMA T.

Autor: OCÓN GARRIDO M. ESTER.
Año: 1999.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: CIENCIAS.
Centro de realización: ESTACIÓN EXPERIMENTAL DEL ZAIDIN(C.S.I.C).

Resumen: La fructosa-1,6-bisfosfatasa, o FBPasa, es una enzima cloroplastídica regulada por la luz gracias al sistema ferredoxina-tiorredoxina. La tiorredoxina reducida interacciona con la FBPasa y la activa. La interacción de estas dos proteínas supone un acercamiento por fuerzas iónicas, una posible intracción hidrofóbica y, por último, una reducción de puentes disulfuro de la FBPasa más un cambio conformacional. La FBPasa es capaz entonces de hidrolizar la fructosa-1,6-bisfosfato(FBP). En esta tesis se ha llevado a cabo la estabilización covalente del complejo iónico FBPasa-tiorredoxina f con la finalidad de estudiar su interacción y los facotes que en ella influyen. Se hizo uso de un agente formador de enlaces cruzados etre grupos carboxilo y amino, la 1-etil-3-[3-(dimetilamino) propil] carbodiimida (EDC), que es hidrosoluble y de uso muy extendido, y permite, con bastante selectividad, la formación de enlaces covalentes entre grupos que en solución interaccinan iónicamente. Se demostró que el complejo covalente formando derivaba del iónico fisiológico, y pudo aislarse en condiciones desnaturalizantes. También se observó la aparición de complejos covalentes entre subunidades de FBPasa. Tanto éstos como los complejos FBPasa-tiorredoxina f fueron analizados por filtración molecular y electroforesis. Por otra parte, el intermediario disulfuro formado entre ambas proteínas se estabilizó en un medio oxidante (Cu2+). En los dos casos se llevaron también a cabo experimentos en los que la FBPasa fue sustituida por fragmentos peptídicos correspondientes a una zona expuesta de la enzima, la conocida como "bucle 170". Se demostró de esta manera la importancia de los enlaces electrostáticos entre grupos carboxilo de la región Leu154-Gly 167 de la FBPasa y grupos amino de la tiorredoxina f en la interacción de ambas proteínas, la implicación de enlaces electrostáticos en el mantenimiento de la estructura cuaternaria de la FBPasa y la importancia de la Cys 153 de la FBPasa en la reacción de intercambio de hidrógeno.

Autor: LEON LOPEZ JOSEFA.
Año: 1999.
Universidad: GRANADA.
Centro de lectura: MEDICINA.
Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.

Resumen: En esta Tesis Doctoral se evalúan en primer lugar los efectos electrofisiológicos de la administración microiontoforética de melatonina y de diversas kinureninas en neuronas estriatales de rata que muestran un respuesta excitadora a la estimulación eléctrica de la corteza somatosensorial(EECS). Los resultados obtenidos muestran que tanto la melatonina como todas las Kinurerinas evaluadas(excepto la codificada como 29c) inducen una inhibición de la frecuencia de descarga de las neuronas estriatales inducida por EECS y por la eyección microintoforética de NMDA en la superficie de tales neuronas. La melatonina y diversas Kinureninas producen el efecto inhibidor con una latencia de alrededor de 2 min mientras que las aminokinureninas(codificadas como 26 a 26 c) producen el efecto con menos latencia que la melatonina y son más potentes que ésta. Por otra parte, la Kinurenina 29c, a diferencia de todos los demás compuestos estudiados, produce una estimulación de la frecuencia de descarga neuronal. La Tesis Doctoral estudia en segundo lugar el efecto de la metonina y las Kinureninas sobre la actividad de la oxido nítrico sintasa neuronal(nNOS), encontrándose que únicamente la melatonina y las aminokinureninas 26a y 26c inhiben la actividad de la nNOs estrital. Dicha inhibición se produce de una produce de una forma no competitiva con la 1-arginina y parece debida a la capacidad de estos fármacos de unirse a la calmodulina, ya que la calmodulina revierte la actividad inhibitoria de la nNOs de estos fármacos y tanto la melatonina como las aminokinureninas alteran la movilidad electroforética de la calmodulina.