Cibernetia > Tesis doctorales
Búsqueda personalizada

Índice > QUIMICA > BIOQUIMICA >

ENZIMOLOGIA, 2



344 tesis en 18 páginas: 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18
  • MODIFICACIÓN QUÍMICA E INMOVILIZACIÓN DE LA CICLODEXTRINA GLUCOSILTRANSFERASA DE THERMOANAEROBACER SP. APLICACIÓN DE SÍNTESIS DE OLIGOSACÁRIDOS .
    Autor: MARTÍN MONZÓN M. TERESA.
    Año: 2001.
    Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
    Centro de lectura: CIENCIAS.
    Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.
    Resumen: Las glicosiltransferasas (EC 2.4) son uno de los grupos enzimáticos más estudiados, debido a su aplicación en la síntesis de azúcares nuevos y oligosacáridos. Dentro de este grupo está la ciclodextrina glucosiltransferasa (CGTasa). Las principales líneas desarrolladas en esta Tesis Doctoral se enumeran a continuación: 1,- Purificación y caracterización de la GGTasa de Thermoanerobacter sp. 2,- Utilización de los estrategias diferentes (modificación química e inmovilización covalente) con el objeto de aumentar la estabilidad y funcionalidad de la enzima. 2.2.1,- La modificación ha permitido variar el balance de cargas positivas y negativas en el biocatalizador, mejorando la selectividad de la enzima hacia la reacción de transferencia. 2.2.2,- Como consecuencia de la inmovilización de la enzima al soporte (Eupergit C), se ha producido un cambio de la selectividad de la CGTasa, favoreciéndose la síntesis de oligosacáridos. Los estudios de estabilidad muestran que la enzima inmovilizada presenta una mayor resistencia a la desnaturalización química y térmica que la enzima soluble; pudiéndose emplear de manera reiterativa en un reactor industrial 3,- Estudios de modelado molecular y accesibilidad de diferentes residuos presentes en la estructura de la proteína. 4,- Estudio detallado de la reacción de transferencia intermolecular para la producción de oligosacáridos de interés industrial, mediante la utilización de diferentes moléculas aceptoras (glucosa, maltosa y sacarosa).
  • ESTUDIO CINÉTICO DE LA INHIBICIÓN ENZIMÁTICA DE METALO-BETA-LACTAMASAS POR DERIVADOS PENAMÁLDICOS DE ANTIBIÓTICOS BETA-LACTÁMICOS .
    Autor: GARCÍA ORTIZ RAQUEL.
    Año: 2001.
    Universidad: GRANADA.
    Centro de lectura: FARMACIA.
    Centro de realización: FACULTAD DE FARMACIA.
    Resumen: En el estudio recogido en la presente memoria se han obtenido, siguiendo las pautas dadas por otros autores, en primer lugar los derivados penamáldicos-Zn(II) correspondientes a cuatro antibióticos beta-lactámicos: dos alfa-aminopenicilinas (ampicilina y amoxicilina) y dos penicilinas (penicilina V y G). Los compuestos hans ido identificados y caracterizados por técnicas espectroscópicas. En segundo lugar, se ha realizado un estudio cinético para ver la influencia de distintos factores relacionados con la actividad enzimática, tales como disolución amortiguadora, tiempo de homogeneización, etc., para seleccionar así las condiciones del estudio cinético más adecuadas. En último lugar, utilizando los métodos habituales en los estudios de cinética enzimática se ha estudiado la capacidad de inhibición de los derivados penamáldicos, previamente aislados, sobre la actividad enzimática de la beta-lactamasa II de Bacillus cereus empleando, en este estudio, el sustrato cefaloridina.
  • HMGCOA REDUCTASA Y REPRODUCCIÓN EN BLATTELLA GERMANICA (L.) (DICTYOPTERA, BLATTELLIDAE) .
    Autor: ZAPATA PREGUEZUELO RAFAEL.
    Año: 2001.
    Universidad: BARCELONA.
    Centro de lectura: BIOLOGÍA.
    Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGÍA.
    Resumen: El estudio de la vía del mevalonato en insectos tiene un gran interés ya que estos organismos no producen colesterol mediante esta vía, y son un sistema idóneo para estudiar la regulación de la HMGCoA reductasa (enzima limitante de la ruta metabólica) por otros metabolitos de esta vía. Además esta vía metabólica se ha relacionado con procesos relacionados con la reproducción de las cucarachas como la vitelogénesis. Así se plantearon los siguientes objetivos: 1,- Caracterizar la expresión, a nivel de mRNA, proteína y actividad enzimática de la HMGCoA reductasa en el cuerpo graso, el ovario y el embrión de Blattella germanica. 2,- Estudiar el papel de la vía del mevalonato en la reproducción de B. Germanica, utilizando inhibidores de la MHGCoA reductasa como la compactina y la fluvastatina. 3,- Estudiar la posible aplicación como insecticidas de la compactina, la fluvastatina y otros análogos. La evolución de los niveles de mRNA, de proteína y de actividad HMGCoA reductasa en el cuerpo graso muestra que esta enzima se regula a nivel de la transcripción, la traducción y a nivel post-traduccional. La administración de fluvastatina y compactina induce una pérdida de la actividad de la enzima en el cuerpo graso que correlaciona con una disminución de la proteína. Esta menor cantidad de la proteína de la enzima no comporta menores niveles de su mRNA lo que sugiere que las estatinas habían inhibido la traducción, o más probablemente que la proteína HMGCoA reductasa se degrada más rápidamente en cuerpos grasos tratados con estos compuestos. La administración de fluvastatina y compactina no modifica los niveles de vitelogenina en la hemolinfa 24 horas después del tratamiento. Sin embargo sí disminuye la incorporación de vitelogenina al ovario transcurridas 96 horas después del tratamiento. Ello sugiere que se necesita una inhibición prolongada de la enzima para inhibir procesos importantes en la reproducción del insecto. El tratamiento con fluvastatina en hembras adultas de 2 días de edad inhibe la producción de laras, mientras la administración de compactina en las mismas condiciones, no la afecta. Lo que implica que la fluvastatina produce una inhibición de la HMGCoA reductasa más duradera que la provocada por la compactina. La expresión de la HMGCoA reductasa en el cuerpo graso sigue un patron diferente al del ovario, ya que en éste los niveles de actividad, proteína y mRNA de la enzima son paralelos, alcanzando un valor máximo a día 5. Ello sugiere la existencia de mecanismos de regulación de la enzima diferentes de los observados en el cuerpo graso. La administración de fluvastatina inhibe la actividad HMGCoA reductasa del ovario, pero no afecta a los niveles de la proteína, ni del mRNA, así esta inhibición se debería a una modificación en el centro activo de la enzima. La actividad HMGCoA reductasa durante la embriogénesis es máxima el día 3. Este máximo no coincide con los niveles más altos de la proteína lo que sugiere una activación post-traduccional de la enzima. La inhibición de la HMGCoA reductasa causada por fluvastatina en el ovario, reduce la producción larvaria de forma dosis dependiente, sin afectar a la formación del corion en los oocitos. Su efecto se prolonga hasta inhibir el pico de actividad HMGCoA reductasa que se produce el día 3 de la embriogénesis; lo que pone de manifiesto la duración del efecto de la estatina y sugiere que la inhibición de este pico de actividad HMGCoA reductasa es lo que provoca la disminución de la producción larvaria de la cucaracha. Las estatinas sintéticas inhiben la HMGCoA reductasa, in vivo, de forma más potente que las estatinas fúngicas, lo que las convierte en mejores candidatas para inhibir la reproducción del insecto. Las estatinas administradas sobre células UM-BGE-1 son capaces de activar o inhibir la HMGCoA reductasa dependiendo de la dosis aplicada. Sin embargo la proteína se mantiene constante y similar a la de las células control, para cualquiera de las dosis estudiadas, sugiriendo de nuevo una activación/inhibición post-traduccional de la enzima. La inhibición de la HMGCoA reductasa causada por la fluvastatina en células UM-BGE-1 se revierte al eliminar la estatina del medio de cultivo.
  • OBTENCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ENZIMAS IMPLICADAS EN LA DETERMINACIÓN DE COLESTEROL: COLESTEROL OXIDASA Y NADH PEROXIDASA .
    Autor: SARABIA MESEGUER M. DESAMPARADOS.
    Año: 2001.
    Universidad: MURCIA.
    Centro de lectura: BIOLOGÍA.
    Centro de realización: DEPTO. DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR A. FACULTAD DE BIOLOGÍA - UNIVERSIDAD DE MURCIA.
    Resumen: Desde la perspectiva de búsqueda de fuentes alternativas para determinar la concentración de colesterol, tanto en suero como en alimentos, han sido estudiadas dos enzimas oxidativas, colesterol oxidasa y NADH peroxidasa. La enzima coleterol oxidasa fue aislada de Streptomyces lividans 1326 pCO-3. En primer lugar fue realizada la optimización del cultivo del microorganismo siendo los valores 2 vvm de aireación y 600 rpm de agitación los óptimos encontrados para la producción de la enzima. Colesterol oxidasa fue posteriormente purificada a homogeneidad en un solo paso cromatográfico, utilizando una columna de afinidad con colesterol consiguiéndose una purificación de 8,91 veces y una actividad específica de 28,6. Por último, el gen choA productor de la enzima colesterol oxidasa fue clonado en Pichia pastoris GS115, lográndose la integración de este heterólogo en el genoma de la levadura. La producción máxima de la enzima fue conseguida tras añadir al medio de cultivo una concentración de metanol del 3% y mantener las condiciones de aireación y agitación respectivamente en 2.5 vvm y 250 rpm mediante la utilización de un fermentador. Por otro lado, la enzima NADH peroxidasa fue aislada de la bacteria Aerococcus viridans ATCC 11563. Las condiciones óptimas de producción de la enzima fueron obtenidas en medios con glucosa como fuente de carbono y catalasa, coincidiendo con un valor nulo de peróxido de hidrógeno en el medio extracelular. Posteriormente, la enzima fue purificada a homogeneidad mediante un protocolo que combinó la extracción con lisozima, precipitación con sulfato amónico, una columna de interacción hidrofóbica y una columna de hidroxiapatilo, de tal forma que la actividad específica encontrada fue de 114 con un purificación de 21,8. Tras la realización del análisis molecular de la enzima, el peso molecular hallado mediante la técnica de filtración en gel fue de 215.000 Da. Debido a que en la electroforesis desnaturalizante fue obtenida una única banda de Pm 55.000 Da, la enzima es un homotetrámero. Por último, fue realizado un análisis cinético de la enzima, calculándose la Km para ambos sustratos, siendo ésta de 21 uM/min para el beta-NADH y de 25 uM/min para el peróxido de hidrógeno. Esta enzima también muestra actividad sobre análogos de sustrato tales como el alfa-NADH y 3-acetilpiridín NADH. El pH óptimo de enzima fue 5,4 y la temperatura óptima de actuación se alcanzó a 55ºC. En los estudios se inhibición fue encontrada inactivación por peróxido de hidrógeno e inhibición competitiva por ADPR (Ki=33,3 uM).
  • PURIFICACIÓN DE ENZIMAS NADH-DEPENDIENTES DE PEDIOCOCCUS ACIDILACTICI MEDIANTE COLORANTES TEXTILES Y CICLODEXTRINAS.
    Autor: LÓPEZ MÁS JOSÉ ANICETO.
    Año: 2001.
    Universidad: MURCIA.
    Centro de lectura: BIOLOGÍA .
    Centro de realización: DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR A. FACULTAD DE BIOLOGÍA - UNIVERSIDAD DE MURCIA.
    Resumen: La bacteria del ácido láctico Pediococcus acidilactici crecida aeróbicamente en un medio conteniendo glicerol como carbohidrato fermetable resultó ser una buena de enzimas NADH-dependientes, permitiendo la obtención de las enzimas modelo en el estudio de las interacciones entre proteínas y colorantes reactivos, lactato deshidrogenasa y NADH-oxidasa. La combinación de dos columnas de afinidad en tandem y de distintas estrategias de elución inespecíficas, con etilenglicol, y específicas, con NADH, permite desarrollar un método de purificación en un solo paso para el caso de la L-LDH, obteniendo una enzima purificada en 58 veces con un 85% de recuperación, en dos pasos para el caso de la NADH-peroxidasa, con una purificación de 146 veces y un 59% de recuperación, y en tres pasos para el caso de la NADH-oxidasa (NOX-2), con una purificación de 18 veces y un 41% de recuperación. La NADH-peroxidasa de Pediococcus acidilactici puede obtenerse pura combinando la cromatografía de afinidad en tandem con una columna de intercambio aniónico, obteniendo un grado de purificación tres veces superior al citado en la bibliografía para la NADH-peroxidasa de Enterococcus faecalis, manteniéndose su porcentaje de recuperación. Así mismo, se reduce el tiempo de purificación a un tercio, de tres días a un solo día. La L-LDH de Pediococcus acidilactici, purificada sobre una columna de Procion Red MX-5B, presenta una gran especificidad por sus sustratos naturales, piruvato, L-lactato, NADH y NAD+, obteniéndose para todos ellos curvas de saturación Michaelianas, confirmándose la naturaleza no alostérica de esta enzima. Los parámetros cinéticos calculados sugieren fuertemente que el papel principal de esta L-LDH in vivo es la reducción de piruvato con la consiguiente reoxidación de NADH. Esta deshidrogenasa es fuertemente inhibida por numerosos colorantes textiles compitiendo éstos con el NADH. Durante esta tesis se ha desarrollado un nuevo método de elución competitiva mediante la formación de complejos de inclusión con ciclodextrinas. Con él se obtienen factores de purificación similares a los obtenidos mediante elución de afinidad por el ligante biospecífico NADH, y volúmenes de elución (más recuperación en menos fracciones), similares a los obtenidos por métodos de elución no específicos, pero a un costo más económico que con el uso de ligantes biospecíficos. Además, las ciclodextrinas se pueden separar fácilmente mediante diálesis o filtración en gel de la proteína purificada.
  • ESTUDIO CINÉTICO SOBRE LA ESPECIFICIDAD DE SUSTRATO Y EL MECANISMO DE REACCIÓN EN LAS ACTIVIDADES MONOFENOLOSA Y DIFENOLASA DE TIROSINASA DE CHAMPIÑÓN.
    Autor: GÓMEZ FENOLL LORENA .
    Año: 2001.
    Universidad: MURCIA.
    Centro de lectura: QUÍMICA.
    Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGÍA.
    Resumen: Se ha realizado el estudio cinético de la actividad difenolasa de tirosinasa, utilizando diversas técnicas conceptuales y experimentales. Se han elaborado análisis cinético en estado estacionario y pre-estacionario sobre el mecanismo de reacción de la actividad difenolasa de tirosinasa, además se han efectuado ensayos cinéticos simulados, mediante integración numérica de los correspondientes sistemas de ecuaciones diferenciales. Se han realizado ensayos de RMN, así como ensayos cinéticos experimentales oximétricos y espectrofotométricos, sin y con flujo detenido, utilizando en éste caso un nuevo método con ácido ascórbico que permite la detección espectrofotométrica de oxitirosinasa. Se han determinado los valores de diversas constantes cinéticas, así como calculado los valores de distintas constantes de velocidad, del mecanismo de reacción de tirosinasa sobre orto-difenoles. Todas estas constantes cinéticas están reguladas por efectos electrónicos, estéricos e hidrofóbicos, originados por la cadena lateral sustituyente en C1 de los sustratos orto-difenólicos de tirosinasa. Para el estudio cinético de la actividad monofenolasa de tirosinasa, se han utilizado las técnicas conceptuales y experimentales anteriormente descritas para la actividad difenolasa, junto con las siguientes técnicas adicionales. Se ha realizado un análisis cinético electroquímico, así como ensayos experimentales de voltametría cíclica y cronoamperometría. Se han realizado ensayos de volatilización mediante sililación de sustratos, intermedios y productos de reacción, para su posterior separación mediante cromatografía de gases y detección con espectometría de masas (GC-MS). Se ha determinado los valores de las constantes cinéticas para diversos para- y meta-monofenoles, así como los valores de sus respectivos desplazamientos químicos en C3 y C4. Se ha determinado que las etapas de ataque nucleofílico y electrofílico son limitantes en la rapidez de oxidación de para- y meta-monofenoles, respectivamente. Además, en la ocidación de monofenoles y difenoles que originan quinonas ligeramente inestables, tirosinasa sólo alcanza un estado pseudo-estacionario inicial, con una escasa concentración de difenol liberado enzimáticamente, mientras que en la oxidación de monofenoles y difenoles que originan quinonas altamente inestables, tirosinasa evoluciona hacia otro estado estacionario final, con una alta concentración de difenol regenerado no enzimáticamente a partir de quinonas, explicando así el periodo de retardo en la actividad monofenolasa. Por último, se ha diseñado y aplicado un método que demuestra, por primera vez, la liberación directa de difenol por tirosinasa durante su actuación sobre monofenoles.
  • ESTRUCTURA, CINÉTICA Y TIEMPOS DE RESIDENCIA MEDIOS EN SISTEMAS LINEALES DE COMPARTIMENTOS .
    Autor: VIDAL DE LABRA JOSÉ ABELARDO.
    Año: 2001.
    Universidad: MURCIA.
    Centro de lectura: QUÍMICA.
    Centro de realización: FACULTAD DE QUÍMICA.
    Resumen: Se han elaborado algoritmos e implementado el progrma informático STRUCOM, que proporciona la estructura y todas las propiedades de conectividad de cualquier tipo de sistema de comportamientos, abierto o cerrado, agilizando el laborioso y propenso a errores análisis manual de su estructura. La determinación de la estructura del sistema de comportamientos, así como de sus componentes condensados o clases, ha permitido simplificar su matriz asociada, incluso en sistemas multicompartimentales complejos, cerrados y abiertos, sin y con sumideros, permitiendo la optimización de las ecuaciones algebraicas resultantes. Además, las ecuaciones cinéticas correspondientes a compartimentos en equilibrio rápido y/o en estado estacionario, se obtienen de manera simple, a partir del límite de las ecuaciones en fase de transición cuando el tiempo tiende a infinito. Los algoritmos diseñados e implementados en el programa informático ECUCINOP, generan las expresiones algebraicas optimizadas y los valores numéricos de todos los parámetros involucrados en las ecuaciones cinéticas de cada uno de los compartimentos, en sistemas cerrados y abiertos. Se ha realizado un completo análisis de los tiempos de residencia en cada compartimento de sistemas cerrados y abiertos, implementándolo en el programa informático MERTIMES, que origina las expresiones simbólicas y los valores numéricos de los tiempos de residencia. Los procedimientos y programas informáticos descritos sobre el estudio cinético de sistemas de compartimentos cerrados y abiertos, se han aplciado a ejemplos multicompartimentales ilustrativos de su gran interés práctico, dentro de áreas como la Cinética Enzimática, la Farmacocinética y la Nutrición.
  • INMOVILIZACIÓN DE GLUTAMATO RACEMASA GENÉTICAMENTE MODIFICADA PARA LA PRODUCCIÓN DE MEZCLA RACÉMICA D,L-GLUTÁMICO .
    Autor: BERNEDO CORNEJO JUANA MARIETA.
    Año: 2001.
    Universidad: ALCALA.
    Centro de lectura: QUÍMICA .
    Centro de realización: UNIVERSIDAD DE ALCALÁ, CIB, ICP.
    Resumen: La obtención de especies ópticamente puras es uno de los retos más importantes de la química de compuestos bioactivos. Así pues, el descubrimiento de enzimas con capacidad de "racemizar" precursores farmacéuticos de interés y su posterior hiper-expresión, purificación, inmovilización y estabilización es un campo de investigación de enorme interés en química fina y química farmacéutica. La biotransformación natural del ácido L-glutámico a su racemato se lleva a cabo mediante intervención de la enzima glutamato racemasa. Se ha creado una fusión traduccional del gen de la glutamato racemasa con la región 5' del plásmido pUC18, que codifica el péptido alfa de la beta-glactosidasa lo que ha conducido a la hiper-expresión de este gen en E.coli DH5alfa. La estabilidad de dicho gen se ha mantenido a lo largo de sucesivas resiembras. Así mismo se ha demostrado que, durante la producción de E.coli DH5alfa (pGR1F) la estabilidad del plásmido introducido, después de múltiples ciclos de fermentación, se ha mantenido y que la modificación producida no ha supuesto una disminución de la actividad ni de estabilidad de la enzima. Se ha validado el modelo propuesto por Guardia (1996) para la producción de E.coli ATCC 8739, sin modificar genéticamente, en el crecimiento de E.coli DH5alfa(pGR1F). Las diferencias fundamentales son que la fase de latencia es mayor y que el rendimiento obtenido es mayor para el microorganismo modificado. La unión multipuntual de la enzima glutamato racemasa sobre gales glioxil agarosa (con un alto grado de activación) provoca aumentos muy importantes en su estabilidad. Así, mientras la enzima soluble pierde más del 90% de actividad en 5 minutos a 60ªC y pH7, los mejores derivados conservan más del 70% de actividad después de 50 horas en las mismas condiciones experimentales. El uso de derivados muy activos y altamente estables podría mejorar las posibilidades de utilización de la glutamato racemasa para racemización a altas temperaturas, a las cuales el L-glutámico es más soluble y los problemas de contaminación están minimizados. Se ha conseguido elaborar una estrategia original y sencilla para la inmovilización de esta enzima cuyas características específicas (riqueza en lisinas) y el tipo de inmovilización efectuada ha permitido, mediante un único paso, adsorber selectivamente la enzima al soporte de inmovilización, inmovilizarla covalente multipuntual al soporte utilizado. El modelo cinético de la reacción de racemización del D-glutámico, utilizando la enzima en disolución, corresponde a un mecanismo de Michaelis-Menten y no se tienen evidencias de que este cambie al usar de la enzima en disolución. Para la enzima inmovilizada, en el reactor tipo tanque agitado, se determinaron las condiciones experimentales para las que no se producen efectos de difusión externa. Se ha comprobado, a partir de los valores de las velocidades de reacción obtenidos, que la distribución de la enzima en el interior de la partícula soporte no es uniforme.
  • REGULATION OF HISTAMINE SYNTHESIS AND RELEASE IN THE CENTRAL NERVOUS SYSTEMA BY H3 RECEPTOR TRANSDUCTION MECHANISMS .
    Autor: GÓMEZ RAMÍREZ JORGE.
    Año: 2001.
    Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
    Centro de lectura: MEDICINA.
    Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y DE FORMACIÓN CONTINUADA.
    Resumen: La importancia de la neurotransmisión histaminérgica sobre diversos proceso neurofisiológicos i neuropatológicos ha sido bien descrita. A pesar de todo, los mecanismos de transducción que controlan la liberación i la síntesis de histamina son poco conocidos. En este sentido, se ha descrito que los autoreceptores H3 tienen una función principal en la regulación de los niveles de histamine cerebral pero, hasta el día de hoy, los mecanismos de transducción de señal acoplados a estos autoreceptores son poco conocidos. La principal finalidad de este trabajo ha sido la descripción de las vias de transducción de señal involucradas en la modulación de la liberación i la síntesis de histamine mediante los autoreceptores H3. Hemos desarrollado un método radioisotopico para purificar por cromatogradía líquida de elevada resolución (HPLC) [3H]-histamina sintetizada a partir de histidina radioactiva lo cual permite una cuantificación de la [3H]-histamina más senzilla, sensible y exacta que la obtenida mediante otros métodos descritos previamente. Hemos demostrado que los autoreceptores H3 modulan la síntesis de [3H]-histamina mediante la via de la adenilato ciclasa-proteina quinasa A. A pesar de ello, basandonos en nuestros resultados no podemos concluir si esta última proteina quinasa activa a la histidina descarboxilasa de forma directa mediante la fosforilación del enzima o de forma indirecta mediante la activación de otras proteinas quinasa intermediarias. Por otro lado, hemos observado que los autoreceptores H3 no pueden modular la liberación de [3H]-histamina mediante la via de transudcció que hemos citado previamente. También hemos descrito que los incrementos de la liberación i la síntesis de [3H]-histamina inducidos por despolarización con potasio están mediados por el incremento de la entrada de calcio extracelular a través de canales de calcio activados por voltage de tipo N. Teniendo presentes estos resultados, seria interesante investigar que tipo de proteina quinasas dependientes de calcio podrian estar involucradas en el control de la liberación i la síntesis de histamina en las neuronas histaminérgicas. Finalmente, hemos demostrado que la síntesis de [3H]-histamina puede ser estimulada por la activación de la via adenilato ciclasa-proteina A o por la entrada de calcio extracelular de manera independientes. En conclusión, este trabajo de tesis doctoral ha permitido una mejora en la comprensión de la función histaminérgica cerebral a la vez que un mejor conocimiento de los mecanismos de transducción de señal de los autoreceptores H3. Este conocimiento podria ser útil para el desarrollo de nuevos tipos de fármacos que podrian ser aplicable al tratamiento de diversas enfermedades del sistema nervioso.
  • APROXIMACIÓN EXPERIMENTAL Y TEÓRICA A LAS CARBOXIPEPTIDASAS PANCREÁTICAS Y REGULADORAS .
    Autor: COMPANYS GARCÍA VERÓNICA.
    Año: 2001.
    Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
    Centro de lectura: CIENCIAS.
    Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y DE FORMACIÓN CONTINUADA.
    Resumen: Las metalocarboxipeptidasas son enzimas que escienden residuos C-terminales de otras proteínas o péptidos. Dentro de esta familia de proteínas encontramos, por un lado, las procarboxipeptidasas pancreáticas y, por otro, las carboxipeptidasas reguladoras. Las procarboxipeptidasas pancreáticas son un sistema muy estudiado, del cual se cuenta con numerosos datos, tanto a nivel estructural como a nivel funcional. En esta tesis se han estudiado los mecanismos de activación e inhibición de una proteína perteneciente a este grupo, la procarboxipeptidasa B porcina. Para ello, se han obtenido mutantes de esta proteína mediante el método de expresión heteróloga de la levadura Pichia pastoris, que nos han ayudado a acabar de definir su proceso de activación, relacionándolo con algunas de sus características estructurales. En las carboxipeptidasas reguladoras se habían realizado algunos estudios funcionales, pero hasta el momento del inicio de esta tesis, eran completamente desconocidas a nivel estructural. En este trabajo se ha conseguido expresar, purificar y concentrar el dominio 2 de la carboxipeptidasa D (CPD) de pato a niveles adecuados para su cristalización y se ha resuelto su estructura cristalina. Consideramos que ésta es un prototipo para las carboxipeptidasas reguladoras, ya que es la primera estructura que se ha obtenido de esta subfamilia, y la única hasta el momento. Por último, nos hemos basado en la estructura cristalina del dominio 2 de CPD de pato para confeccinar modelos teóricos de otras reguladoras (dominios 1 y 3 de CPD de pato y CPE humana). Además, se ha resuelto la estructura del mismo dominio acomplejado con un inhibidor. La obtención de la primera estructura cristalina de una carboxipeptidasa reguladora abre las puertas para el estudio de la relación estructura/función en esta subfamilia.
  • PRODUCCION DE L-(-)-CARNITINA CON CEPAS DE ESCHERICHIA COLI. MODELO NO ESTRUCTURADO CELULAR Y ENZIMÁTICO.
    Autor: MAIZQUEZ VAREA JUAN RAMÓN.
    Año: 2000.
    Universidad: MURCIA.
    Centro de lectura: QUIMICA .
    Centro de realización: FACULTAD DE QUÍMICA.
    Resumen: La L(-)-carnitina interviene en el trasnporte de ácidos grasos de cadena larga a través de la membrna interna mitocondrial. En la actualidad el 80% de la carnitina utilizada a nivel mundial se obtiene por vía química, lo que da lugar a la producción de la mezcla racémica D-Lcarnitina. De ahí que los depósitos existentes de D-carnitina como subproducto sean elevados. Este hecho junto a que el proceso de resolución del racemato supone un problema medioambiental, hace que se incrmente el interés por los métodos biológicos de producción. Por otra parte, la purificacióny caracterizaciónde enzimas presentes en el metabolismo celular de cepas de Escherichia coli como la L(-)-carnitina deshidratasa, crtonobetaína reductasa y carnitina racemasa por Kleber y cols., permite abordar el desarrollod e procesos de biotransofrmaciónde D-carnitina y/o crotonobetaína, productos de bajo valor añadido, mediante métodos biotecnológicos. El trabajo que se presenta en la presente memoria trata de profundizar en las metodologías modelo que establecen las condiciones en las que se desarrollan tanto los procesos que pueden dar lugar a productos asociados al crecimiento celular, como las biotrasformaciones de metabolitos secundarios en ausencia de crecimiento. Tal es el casode la producción de L(-)-carnitina mediante el uso de las cepas de E.coli 044 K74 y la transformada genéticamente K38pT7-5KE32 en estado durmiente y durante el crecimiento. Además, el trabajo se ha desarrollado cracterizando la configuración de un reactor adecuado para realizar el bioproceso y que permita su integración en la propia línea de producción de L(-)-carnitina. Para ello, los estudios realizados contemplan por una parte el análisis de la biotransformación de crotonobetaína en L(-)-carnitina enreactores discontinuos, mientras que por otra también se han ultimado reactores continuos con suportes d einmovilización,. Con tal de obtener L(-)-carnitina de forma continua. En ambas etapas se estudió el comprotamiento de las células tanto durante su crecimiento como en condiciones de estado durmiente. En los estudios realizados en discontinuo se ha comprbado que la adiciónd e fumarato al medio de cultivo aumenta la velocidad de crecimeinto celular, así como el rendimiento en L(-)-carnitina. Por otro lado, en los estudios en continuo se han utilizado reactores tubulares empaquetados con partículas esféricas de vidrio de borosilicato y con espumas de poliuretano y reactores con recirculación celular con retención física celular mediante membranas de microfiltración. En los estudios realizados con células en fase de crecimiento, se ha observado que la productividad en L(-)-carnitina en los reactores tubulares fue entre ellos similar, con niveles d e2 g L-1h-1, mientras que en los reactores con retención celular mediante membrana de microfiltración se han alcanzado productividad en L(-)-carnitina en los reactores tubulares fue entre ellos similar, conviles de 2g L-1 h-1, mientras que enlos reactores conretención celular mediante membrana de microfiltración se han alcanzado productividades de 7 gL-1 h-1 en L(-)-carnitina. Todos los reactores con células inmovilizadas, han mostrado productividades elevadas a velocidades de dilución que superan hasta tres veces la velocidad específica de crecimiento (0,6 h-1). Los experimentos realizados en condiciones de estado durmiente celular reflejan la capacidad de E. Coli 044 K74 para biotransoformar crotonobetaína en L(-)-carnitina durante periodos prolongados de operación y posterior regeneración del sistema (250 h). Por último, se ha elaborado un modelo matemático que permite simular y representar la evolución del proceso de biotransformación de cortonobetaína en L(-)-carnitina realizado por las cepas de E. Coli, así como su crecimiento en los sistemas de reactores estudiados. Además, el modelo también considera la producción y actuaciónde las enzimas implicadas en el metabolismo de compuestos de trimetilamonio por células de E. Coli, tanto en condiciones anaerobias como aerobias.
  • CAMBIOS MOLECULARES Y CINÉTICOS EN LA ENZIMA ALFA-L-FUCOSIDASA DURANTE LA DIFERENCIACION ENTEROCÍTICA DE LA LÍNEA CELULAR HT-29 DE ADENOCARCINOMA DE COLON HUMANO .
    Autor: MERINO TRIGO ANA M..
    Año: 2000.
    Universidad: VIGO.
    Centro de lectura: CIENCIAS.
    Centro de realización: UNIVERSIDAD DE VIGO, FACULTAD DE CIENCIAS.
    Resumen: En estudios previos se ha observado una relación inversa entre l nivel de actividad alfa-L-fucosidásica y el grado de diferenciación de tumores de colon. Considerando la diferenciación celular como un proceso inverso al desarrollo tumoral, el objetivo principal de este trabajo fue evaluar si el comportamiento de esta enzima durante la diferenciación de líneas celulares de colon humano reflejaba cambios inversos a los que ocurren en el proceso tumoral. Los resultados muestran que a lo largo del proceso de diferenciación la enzima alfa-L-fucosidasa experimenta un incremento gradual en su actividad, por lo que las células diferenciadas contienen niveles superiores de actividad alfa-L-fucosidásica intracelular.La cuantificación de la proteína específica en bambos fenotipos celulares indica un aumento en la misma, aunque inferior al incremento observado en la actividad específica. Hemos comprobado que el incremento detectado no es debido a cambios en el valor de pH óptimo, en la estabilidad frente al pH y a la temperatura, o en su afinidad frente al sustrato sintético 4-MU-fucósido. La disminución en la actividad intracelular no se debe tampoco a una alteración de la secreción de la enzima al medio extracelular ni a la presencia de inhibidores o activadores de dicha actividad. Sin embargo, el patrón de glicosilación y el estado de agregación de la enxima sí es dependiente del fenotipo celular. Tras la diferenciación celular la enzima muestra un mayor número de manosas, así como un mayor estado de agregación, que la presente en cultivos no diferenciados. Hemos obserbado también diferencias en la afinidad de la enzima durante la cromatográfia empleada para su purificación, obteniendo un mayor rendimiento y grado de purificación al purificar la enzima presente en los cultivos diferenciados. Además, hemos comproabado que, a pesar de que se considera tradicionalmente como una enzima lisosómic, en células HT-29 la enxima alfa-L-fucosidasa aparece también en membranas y en una fracción presumiblemente endosómica, variando su distribución en función del fenotipo celular. Todos estos resutlados sugieren que la enxima alfa-L-fucosidasa esta sometida a una regulación dependiente del estado de diferenciación celular, y teniendo encuenta la alteración parcial en el procesamiento de las N-glicoproteínas que existe en las células HT-29, pensamos que la disminución en la actividad alfa-L-fucosidásica y en menor proporción de proteína específica podría ser explicado por un bloqueo postraduccional en su procesamiento que desviase una gran proporción de la enzima a la vía autofágica para su degradación lisosómica en las células no diferenciadas.
  • PURIFICACION Y CARACTERIZACION DE LA FAD-AMP LIASA (CICLANTE) O FMN CICLASA DE HIGADO DE RATA .
    Autor: CABEZAS MARTIN ALICIA.
    Año: 2000.
    Universidad: EXTREMADURA.
    Centro de lectura: MEDICINA.
    Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA.
    Resumen: Recientemente se publicó la primera descripción de una FAD-AMP liasa o FMN ciclasa, una preparación parcialmente purificada a partir de higado de rata (Fraiz FJ,Pinto RM, Costas MJ, Avalos M, Canales J, Cabezas A, Cameselle JC, Biochem. J. 330,881-888,1998). El principal objetivo de esta tesis doctoral era purificar esta FMN ciclasa hasta un grado de homogeneidad aparente y emplear la preparacion de alta pureza para confirmar y ampliar la caracterización de la enzima parcialmente purificada. Los pasos de purificacion fueron: obtención de un sobrenadante de 100000 g a partir de homogeneizados de higado de rata en medio isotónico, precipitación fraccionada con sulfato amónico, cromatografias de filtración en gel, intercambio ionico, afinidad por Verde Reactivo 19-agarosa y afinidad por ADP-agarosa. La adsorción a ADP-agarosa se consiguió en presencia de Mn2+ (cation activador de la enzima), condición en que la FMN ciclasa permanecia adherida incluso a alta fuerza iónica, recuperandose con baja fuerza iónica sin Mn2+. Los resultados de la purificación completa fueron: actividad especifica, 2,2 U/mg,purificación de 240 veces y rendimiento del 15%. Por electroforesis en condiciones desnaturalizantes revelada con plata, solo se observó una banda proteica de 59 kDa. La correspondencia de la proteina con la actividad FMN ciclasa se puso de manifiesto por electroforesis desnaturalizante seguida de renaturalización, ultracentrifugación en gradiente seguida de analisis por electroforesis desnaturalizante, y electroforesis no desnaturalizante con revelado de la actividad FMN ciclasa por fluorescencia. La masa molecular nativa de la FMN ciclasa resultó ser 100 Kda ó 140 Kda al medirla por ultracentrifugación en gradiente o por cromatografia de filtracion en gel, respectivamente. Los estudios de especificidad de sustrato y reaccion indicaron que la enzima tiene actividad liasa(ciclante) sobre los siguientes sustratos: FAD(mejor sustrato), ADP-glucosa, UDP-glucosa, UDP-galactosa, UDP-xilosa, UDP-glucuronato, UDP-galacturonato, CDP-glucosa, CDP-glicerol, GDP-glucosa, GDP-a-L-fucosa. El mejor sustrato a juzgar por los constantes de especificidad (kcat/km) obtenidas, es el FAD. Aunque la ADP-glucosa es tambien un buen sustrato,es un compuesto no fisiológico en mamiferos. Las constantes de especificidad de los otros sustratos son 50-500 veces menores que la del FAD. Se estudiron también los efectos del pH sobre la actividad enzimatica con FAD, ADP-glucosa, UDP-glucosa y UDP-glucunorato como sustratos, registrandose el pH optimo de la actividad dependiente de Mn2+ a pH 8,5 y el de la actividad dependiente de Co2+ a pH7,3. Se estudio el requisito de Mn2+ o Co2+ para la actividad FMN ciclasa y se encontró que la enzima requiere concentraciones milimolares de uno de estos cationes para ser totalmente activa. Se hizo un estudio de inhibición de la FMN ciclasa por diversos compuestos nucleotídicos, encontrándose que ATP y ADP son potentes inhibidores competitivos con valores de ki de orden nanomolar. AMP,dATP y dADP fueron inhibidores mucho más debiles. La preparación enzimatica presento una debil actividad ATPasa(0,8% de la actividad sobre FAD) con caracteristicas diferentes de la actividad de tipo liasa(ciclante). Puede ser un contaminante minoritario de la preparación purificada.
  • BIOSINTESIS DE CAROTENOIDES EN HONGOS: LOS GENES CAR RA DE PHYCOMYCES Y AL-2 DE NEUROSPORA .
    Autor: ARRACH NABIL.
    Año: 2000.
    Universidad: SEVILLA.
    Centro de lectura: BIOLOGIA.
    Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGIA.
    Resumen: En esta tesis se ha Clonado el gen carRA de Phycomyces sacando ventaja de su estrecho ligamiento con el gen carB y se caracterizaron a nivel molecular los mutantes que mapean dicho gen. Tambien se ha investigado la bifuncionalidad del gen al-2 de Neurospora descrito anteriormente como una sintasa de fitoeno. Con estos resultados son cuatro los genes que determinan dos enzimas esenciales en la biosintesis de carotenoides en hongos. El gen carRA tiene a demas otras funciones reguladoras determinadas por la region A del extremo 3´del gen. Dichas funciones estan relacionadas con la transferencia de sustratos en el complejo mutienzimatico, la regulacion por productofinal y la fotocarotenogenesis. Los resultados obtenidos en esta tesis nos ofrecieron mas informacion sobre el origen evolutivo de las ciclasas de hongos. La alta similitud entre las ciclasas de hongos y el resto de las ciclasas heterodimericas sugiere que ambas tienen un origen comun, la ciclasas monomericas parecen tener un origen independiente.
  • PRODUCCION DE POLIAMINAS EN PHYCOMYCES BLAKESLEEANUS .
    Autor: MORERA OLIVEROS BEATRIZ.
    Año: 2000.
    Universidad: SEVILLA .
    Centro de lectura: BIOLOGIA.
    Centro de realización: FACULTAD DE BIOLOGIA.
    Resumen: Las poliaminas son compuestos nitrogenados policatiónicos de bajo peso molecular que se encuentran en todos los organismos. Son esenciales para el crecimiento y tienen papeles fisiológicos importantes, pero desconocidos. Se han investigado las variaciones en las concentraciones de poliaminas a lo largo de los ciclos de vida del hongo Phycomyces blakesleeanus, que tiene putrescina y espermidina, pero no espermina. Se han utilizado cuatro mutantes (spe) residentes a diaminobutanona, un analogo sintetico de la putrescina que inhibe a la descarboxilasa de la ortinina. En Phycomyces se ha visto una relación entre la máxima concentración de putrescina y la fase de crecimiento exponencial. Se ha secuenciado un fragmento del gen para la descarboxilasa de la ornitina de Phycomyces, al que llamamos speA, cuya secuencia de aminoacidos es muy semejante a la de Mucor. Las mutaciones spe no afectan de manera especial a ningun paso del desarrollo. La mutacion spe-2 es recesiva, la spe-4 es dominante y las spe-1 y spe-3 son intermedias. Las mutaciones spe-1 y spe-2 afectan a la descarboxilasa de la ornitina, modificando su sitio de union a la ornitina, y las mutaciones spe-3 y spe-4 afectan a la regulacion de la sintesis de descarboxilasa de la ornitina. En Phycomyces,organismo cenocitico, se pueden seleccionar los nucleos de los heterocariontes que llevan ciertos marcadores, pero no otros. Esta paradoja se resuelve observando que no se seleccionan nucleos, sino propágulos,según las condiciones del medio permitan su crecimiento.
  • TELOMERASA: REGULACIÓN, DIANA TERAPÉUTICA Y SIGNIFICADO CLÍNICO EN NEOPLASIAS HUMANAS.
    Autor: ALBANELL MESTRES JUAN.
    Año: 2000.
    Universidad: AUTONOMA DE BARCELONA.
    Centro de lectura: MEDICINA.
    Centro de realización: ESCUELA DE DOCTORADO Y DE FORMACIÓN CONTINUADA.
    Resumen: Las células malignas deben adquirir un potencial de replicación ilimitado (inmortalidad celular) para la formación de tumores avanzados. La adquisición de inmortalidad celular depende de la reactivación de la telomerasa, una enzima que permite compensar el problema de replicación terminal del ADN asociado a cada división celular. En una serie de estudios presentados en esta tesis, se demuestra; 1,- La telomerasa es una enzima regulable en células tumorales humanas. La maduración de células neoplásicas de diversa estirpe inducida por agentes diferenciadores se asocia a inhibición de telomerasa. El grado de inhibición de telomersas se correlaciona inversamente con el grado de diferenciación celular en los modelos experimentales. Esta correlación inversa existe también in vivo en tumores de células germinales. 2,- Los tumores humanos expresan actividad telomerasa y su expresión se asocia a estadío tumoral, índice proliferativo y diferenciación. Los cánceres de pulmón con alto nivel de telomerasa se asocian a un alto índice proliferativo y con estadíos avanzados. Estos hallazgos indican que la actividad telomerasa puede contribuir a la tumorigénesis pulmonar y a su profesión. En tumores de células germinales masculinos, la actividad telomersa se expresa en todos los cánceres de células germinales. En cambio, no se detecta en ningún teratoma madura. Estos hallazgos indican que existe una correlación inversa in vivo entre actividad de telomerssa y el estado de diferenciación de los tumores de células germinales. 3,- La telomerasa es una diana antitumoral atractiva. La mayoría de tumores expresan actividad telomerasa mientras que los tejidos normales adyacentes carecen de actividad detectable. Esta observación apoya el concepto de inhibición de telomerasa como una terapia atractiva del cáncer porque debería contar con dos características importantes; amplio espectro antitumoral y escasa toxicidad. En los modelos preclínicos desarrollados se realizó el screening de una serie de compuestos candidatos inhibidores de telomerasa in vitro e in vivo. Es de esperar que en un futuro cercano se identifiquen compuestos que puedan ser investigados clínicamente.
  • VALOR DE LA ENZIMA ALFA-L-FUCOSIDASA SÉRICA COMO MARACADOR TUMORAL EN CÁNCER COLORRECTAL.
    Autor: AYUDE VÁZQUEZ DANIEL.
    Año: 2000.
    Universidad: VIGO.
    Centro de lectura: CIENCIAS.
    Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS DE VIGO.
    Resumen: La enzima alfa-L-fucosidasa de humanos (alfa-L-fucósido fucohidrolasa, EC, 3.2.1.51) ha sido estudiada en individuos sanos y con diversas enfermedades, despertando un particular interés las alteraciones de sus niveles entejido y suero descritas en relación con diversos procesos cancerosos. En estudios previos se ha econtrado una disminución significativa de la actividad de la enzima-alfa-L-fucosidasa en el tejido tumoral con respecto a la mucosa sana de pacientes con cáncer colorrectal, y se ha demostrado el valor pronóstico de dicha disminución. En este trabajo hemos demostrado que la actividad de la enzima alfa-L-fucosidasa de suero es significativamente inferior en pacientes con cáncer colorrectal que en individuos sanos. Con ayuda de las curvas ROC, hemos establecido como punto de corte en el diagnóstico del cáncer colorrectal el valor de 5,6 U/mL. Para completar el estudio hemos comparado la capacidad diagnóstica de la enzima alfa-L-fucosidasa con la del antígeno carcinoembrionario, como marcador de uso establecido, y con la de un marcador en estudio, la glicoproteína CD26 soluble. El antígeno carcinoembrionario estudiado en nuestros pacientes no muestra validez diagnóstica, como ha sido ampliamente descrito en otros trabajos. Por el contrario la glicoproteína CD 26 soluble poseía una eficiencia diagnóstica superior a la de la enzima, incluso para los estadios más tempranos del tumor. También se analizó el valor diagnóstico del uso combinado de los tres marcadores tumorales. No se han encontrado variaciones en los niveles de actividad de la enzima alfa-L-fucosidasa en función del sexo o la edad del paciente, el tamaño, la localización anatómica, el grado de diferenciación o la capacidad invasiva del tumor. Sin embargo, sí hemos detectado una relación entre los niveles de actividad de la enzima y el tipo de metástasis. De este modo, la actividad media de la enzima alfa-L-fucosidasa fue más alta en pacientes que tenían metástasis hepáticas que en el resto de los pacientes. En estudios de supervivencia, se realizó un seguimiento de los pacientes intervendios con intención curativa durante un periodo mínimo de tres años, observando que factores de pronóstico clásicos como los estidos de Dukes o la localizaicón del tumor diferenciaban grupos de pacientes con pronósticos claramente diferentes. El resultado más importante de este estudio fue la diferenciación de tres grupos de pacientes con distinto pronóstico en función de los niveles de actividad de la enzima alfa-L-fucosidasa, incluso cuando consideramos por separado los pacientes en estadio B o C de Dukes.Otros marcadores tumorales que aportaron información pronóstica fueron el antígeno carcinoembrionario y los antígenos carbohidratos 19.9 y 72.4. Por otra parte, el análisis multivariante mostró que la enzima alfa-L-fucosidasa, los antígenos carbohidratos 19.9 y 72.4 yla localización del tumor se comportan de forma independiente respecto a los estadios de Dukes o TNM, por lo que proporcionan información adicional en la predición del riesgo de recidiva. En la predicción del riesgo de muerte, las variables que aportaron información pronóstica independiente fueron la enzima alfa-L-fucosidasa proporcionó información adicional a la de los estadios de Dukes o TNM. Por último, el estudio de la evolución de los niveles de actividad de la enzima alfa-L-fucosidasa en los sueros obtenidos en las diferentes revisiones del seguimiento postoperatorio mostró que, en la mayoría de los pacientes intervenidos con intención curativa y que se encontraban estables, los niveles de actividad enzimática se incrementan alcanzado niveles normales o cercanos a la normalidad.El único caso en el que se ha detectado una recidiva, siendo éste a causa de la persistencia tumoral, los niveles de actividad enzimática permanecieron disminuidos. Los resultados discutidos en este trabajo nos ofrecen un nuevo marcador tumoral sérico para el cáncer colorrectal, cuya determinación, sencilla y fácilmente automatizable, resulta también económica para una utilización rutinaria.
  • DEGRADACION DE SUSTANCIAS PECTICAS EN UN BIORREACTOR DE MEMBRANA CON ENZIMAS PECTINOLITICAS INDUCIDAS EN ASPERGILLUS NIGER POR SUBPRODUCTOS AGROALIMENTARIOS .
    Autor: RODRIGUEZ NOGALES JOSE MANUEL.
    Año: 2000.
    Universidad: BURGOS.
    Centro de lectura: CIENCIAS.
    Centro de realización: FACULTAD DE CIENCIAS.
    Resumen: La degradación enzimatica de sustancias pecticas mediante la intervención de enzimas pectinoliticas es un paso esencial en el procesado industrial de zumos, mostos y vinos. Tradicionalmente, estos procesos biotecnologicos se han realizado en biorreactores de baño con enzimas solubles. Con esta tecnica es muy dificil recuperar la enzima activa despues de la reacción para una posible reutilización. En este sentido, la preparación de enzimas inmovilizadas por medio de membranas semipermiables permite la reutilización del biocatalizador y posibilita el diseño de procesos en continuo, reduciendo el coste enzimático. Con estas perpectivas, este trabajo de investigación se ha orientado i) al estudio de la biosintesis de enzimas pectinoliticas despolimerizantes (poligalacturonasa y pectina liasa)inducidas en Aspergillus niger por residuos agroalimentarios (poligalacturanasa y pectina liasa) inducidas en Aspergiullus niger por residuos agroalimentarios (pomaza y pulpa de manzana) y pectinas purificadas (acido poligalacturonico, pectina de citrico y de manzana), y ii)al desarrollo de un reactor de membrana continuo con enzimas pectinoliticas implicado en la degradación de sustancias pécticas. Con respecto a los resultados principales obtenidos en el estudio de la biosíntesis de enzimática se podria concluir que, la poligalacturonasa era predominantemente extracelular y la pectina liasa estrictamente extracelular, y que de modo general, un mayor enriquecimiento en la fuente de carbono o en el grado de metoxilación del inductor generaba extractos enzimáticos con mayor capacidad pectinolitica. Por otro lado, la aplicación de subproductos agroalimentarios como sustrato nutricional, reducía la velocidad de sintesis enzimatica, pero resultaban inductores excelentes del complejo pectinolitico, por lo que, con el objeto de reducir el coste de la utilización de enzimas, las pectinas purificadas pueden ser sustituidas por residuos agroalimentarios. En cuanto al desarrollo del biorreactor de membrana, se constató que las condiciones experimentales optimas del ensayo enzimático, determinadas por medio de la metodología de superficies de respuestas, fueron una concentración de enzima del 0,03% (p/v), una concentración de sustrato del 0,7% (p/v), un pH 4,8, una temperatura de 46º C y un tiempo de reacción de 60 min. La utilización de enzimas pectinolíticas en el biorreactor de membrana incrementaba significativamente el flujo de permeado en un 300%, obteniendose altos niveles de conversión (69%) y una excelente estabilidad operacional (71/2 de 18,8 dias). Las enzimas endopectinolíticas seguian una cinética de inhibición reversible por producto y la configuración del reactor enzimátco de membrana provocaba un aumento de los constantes cinéticas Kp y Km, sin modificar la capacidad hidrolítica (Vmax) del sistema enzimático. Estos resultados confirman la idoneidad de este método de inmovilización para la degradación de sustacias pécticas durante los procesos de filtración y clarificación de zumos, mostos y vinos.
  • ESTUDI DE LA FOSFOGLICERAT MUTASA I DE LA BISFOSFOGLICERATMUTASA DURANTE LA MIOGENESI I L´ERITROPOIESI EN SITUACIONS FISIOLOGIQUES I PATOLOGIQUES .
    Autor: GONZACLEZ CINCA NURIA .
    Año: 2000.
    Universidad: BARCELONA.
    Centro de lectura: FARMACIA.
  • CONVERSIÓN DE LA FOSFOFRUCTOKINASA NO ALOSTÉRICA DE DICTYOSTELIUM DISCOIDEUM EN UN ENZIMA ALOSTÉRICO E INHIBICIÓN DE LA POLIMERIZACIÓN DE TUBULINA POR EL ENZIMA NATIVO .
    Autor: SANTAMARIA JIMENEZ M. BELEN.
    Año: 2000.
    Universidad: AUTONOMA DE MADRID.
    Centro de lectura: CIENCIAS.
    Centro de realización: FAC. MEDICINA.
    Resumen: Se han originado una serie de mutaciones específicas en la secuencia de la fosfotructokinasa no alostérica de D.discoideum con objeto de investigar los motivos estructurales por los que carece de propiedades reguladoras. La mayor parte de los aminoácidos propuestos como importantes para el centro catalítico y sitios alostéricos están conservados en esta PKK, excepto algunos de ellos cuya reversión no alteró la conducta cinética del enzima nativo. Sin embargo, la introducción de diversas modificaciones a nivel de la cola C-terminal, única para esta PFK, convirtió a este isozima en uno alostérico que exhibe propiedades características de las PFKs reguladoras, como histéresis, intensa cooperatividad positiva para el fructosa 6-P, fuerte activación por fructosa-2,6-P2 y fructosa-1,6-P2, inhibición por protones, dependencia de la concentración de enzima y asociación-disociación de subunidades. La región implicada ha sido caracterizada mediante mutagénesis sistemática y el estudio de los mutantes ha suminsitrado una nueca interpretación para el control alostérico de las PKFs en general. Adicionalmente, hemos identificado a la PFK de D.discoideum como un potente factor que inhibe la velocidad de polimerización de tubulina con una razón molar de una molécula por alrededor de 300 dímeros de tubulina para un efecto mitadl del máximo (IC50 = 32 nM). Este efecto ha sido caracterizado y es específico, puesto que no lo produce la PKF de músculo. También se contra de ésta última, la actividad catalítica del enzima de D.discoideum no se afecta por la presencia de tubulina o microtúbulos. Este hallazgo sugiere una nueva función para la PFK de este organismo distinta de su acción como enzima glicotílico.
344 tesis en 18 páginas: 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18
Búsqueda personalizada
Manuales | Tesis: Ordenadores, Circuitos integrados...
english
Cibernetia